常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用PPTPPT學(xué)習(xí)教案

1、會計學(xué)1常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理(yunl)及應(yīng)及應(yīng)用用PPT第一頁，共126頁。核酸分子雜交 (nucleic acid hybridization ) 在DNA復(fù)性過程中，把不同DNA單鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對關(guān)系，就可在不同的分子之間形成(xngchng)雜化雙鏈的這種現(xiàn)象。一、分子(fnz)雜交與印跡技術(shù)的原理雜交的原理實(shí)質(zhì)是核酸(h sun)分子的變性與復(fù)性過程第1頁/共125頁第二頁，共126頁。復(fù)性(f xn)RNADNA第2頁/共125頁第三頁，共126頁。（一）印跡(yn j)

2、技術(shù)1. 具體步驟 Southern E 1975年首次(shu c)應(yīng)用 Southern EM. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J Mol Biol，1975, 98(3):503-517. 原始(yunsh)文獻(xiàn)出處：第3頁/共125頁第四頁，共126頁。（一）印跡(yn j)技術(shù)1. 具體步驟 Southern E 1975年首次(shu c)應(yīng)用 瓊脂糖分離的DNA片段 變性為單鏈 將一張NC膜放在膠上，上面(shng min)放吸水紙巾 利用

3、毛細(xì)作用使膠中的DNA片段轉(zhuǎn)移到NC膜上，使之成為固相化分子。 載有DNA單鏈分子的NC膜可在雜交液與另一種DNA或RNA分子（探針）雜交，具有互補(bǔ)序列的RNA或DNA結(jié)合到存在于NC膜的DNA分子上，經(jīng)檢測分析可顯現(xiàn)出雜交分子的區(qū)帶。第4頁/共125頁第五頁，共126頁。2. 印跡(yn j)(blotting)定義將存在(cnzi)于凝膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移（印跡）或直接放在固相化介質(zhì)上并加以檢測分析的技術(shù)。3. 應(yīng)用(yngyng) 廣泛用于DNA、RNA、蛋白質(zhì)的檢測4. 發(fā)展 電轉(zhuǎn)移印跡技術(shù)、真空吸引轉(zhuǎn)移印跡等第5頁/共125頁第六頁，共126頁。（二）探針(tn zhn)技術(shù)探針(t

4、n zhn)(probe)的概念 是帶有特殊可檢測標(biāo)記（放射性核素、生物素或熒光染料）的核酸片段，它具有特定(tdng)的序列，能夠與待測的核酸片段互補(bǔ)結(jié)合，因此可以用來檢測核酸樣品中是否存在某一特定(tdng)的基因。探針的種類n寡核苷酸探針寡核苷酸探針n基因組基因組DNA探針探針ncDNA探針探針nRNA探針探針第6頁/共125頁第七頁，共126頁。 將探針與固定在NC膜上的DNA或RNA進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，探針的序列如與NC膜上的核酸序列相互補(bǔ)，就可結(jié)合到膜上的相應(yīng)區(qū)帶，經(jīng)放射自顯影或其他(qt)檢測手段就可判斷膜上是否有同源的核酸分子存在。探針技術(shù)(jsh)的概念第7頁/共125頁第八頁，共

5、126頁。二、印跡技術(shù)(jsh)的類別及應(yīng)用（一）DNA印跡(yn j)技術(shù) (Southern blotting) （二）RNA印跡(yn j)技術(shù) (Northern blotting) （三）蛋白質(zhì)的印跡分析 (Western blotting) 第8頁/共125頁第九頁，共126頁。M1 2轉(zhuǎn)移(zhuny)緩沖液Whatman濾紙(lzh)凝膠Whatman濾紙(lzh)紙巾玻璃板重物支持物500g1 2與探針同源雜交的基因DNA片段基因組DNADNA酶切片段內(nèi)切酶NC或尼龍膜NC膜或尼龍膜第9頁/共125頁第十頁，共126頁。 基因組DNA的定性與定量分析。 如對在基因組中特異(t

6、y)基因的定位及檢測等。重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。Southert blotting用途(yngt)第10頁/共125頁第十一頁，共126頁。放射(fngsh)自顯影照片第11頁/共125頁第十二頁，共126頁。（二）RNA印跡(yn j)技術(shù)(Northern blotting)相同點(diǎn)：Alwine JC, et al. Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper（重氮芐氧甲基紙） and hybridization with DNA probes

7、.Proc Natl Acad Sci USA, 1977, 74(12):5350-5354原始文獻(xiàn)(wnxin)出處名稱(mngchng)相對于Southern blotting轉(zhuǎn)移的是RNA轉(zhuǎn)移前無需酶切轉(zhuǎn)移效率較高變性方法不同點(diǎn)原理均為毛細(xì)作用。 第12頁/共125頁第十三頁，共126頁。（二）RNA印跡(yn j)技術(shù)Northern blotting 用途 檢測某一組織或細(xì)胞中已知的特異mRNA 的表達(dá)水平。 比較(bjio)不同組織和細(xì)胞的同一基因的表達(dá)情況。第13頁/共125頁第十四頁，共126頁。第14頁/共125頁第十五頁，共126頁。由于基因組測序的完成及基因芯片(j y

8、n xn pin)技術(shù)的成熟以上兩種技術(shù)應(yīng)用的越來越少第15頁/共125頁第十六頁，共126頁。（三）蛋白質(zhì)的印跡技術(shù)(jsh)(免疫印跡) 首先將混合蛋白質(zhì)用PAGE按分子大小分開，再將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到NC膜或PVDF膜上，蛋白質(zhì)的位置(wi zhi)可保持在膠中的原位上。與DNA和RNA印跡(yn j)相似之處第16頁/共125頁第十七頁，共126頁。n或用同位素標(biāo)記第二抗體，放或用同位素標(biāo)記第二抗體，放射自顯影法檢測蛋白區(qū)帶的信射自顯影法檢測蛋白區(qū)帶的信號。號。與DNA和RNA印跡(yn j)不同之處第17頁/共125頁第十八頁，共126頁。Western blotting應(yīng)用(yngyng

9、) 檢測樣品中的特異蛋白質(zhì)的存在(cnzi)。 細(xì)胞中特異蛋白質(zhì)的定量分析。 蛋白質(zhì)分子的相互作用研究。第18頁/共125頁第十九頁，共126頁。第19頁/共125頁第二十頁，共126頁。第20頁/共125頁第二十一頁，共126頁。第21頁/共125頁第二十二頁，共126頁。辣根過氧化酶（HRP）使試劑中的發(fā)光物（Luminol）氧化并發(fā)光，而試劑中含有增強(qiáng)劑這使得發(fā)光增強(qiáng)了1000倍。經(jīng)HRP標(biāo)記的抗體與膜上的蛋白直接（標(biāo)記一抗）反應(yīng)。當(dāng)加入(jir)免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑后，Luminol發(fā)生氧化降解，并發(fā)射波長為428nm的光，此光可經(jīng)X光膠片感光記錄下來。 第22頁/共125頁第二十三頁

10、，共126頁。Western blotting應(yīng)用(yngyng)SDS-PAGE purified recombinant human CK2(重組重組(zhn z)人酪蛋白人酪蛋白激酶激酶2) subunit and its Western blotting用已知的特異抗體檢測目的基因(jyn)蛋白重組人酪蛋白激酶2 第23頁/共125頁第二十四頁，共126頁。三種(sn zhn)印跡技術(shù)的比較Western blotting垂直槽Northern blotting水平槽Southern blotting水平槽第24頁/共125頁第二十五頁，共126頁。 斑點(diǎn)印跡 (dot blottin

11、g) 原位雜交 (in situ hybridization) DNA芯片(xn pin)技術(shù) (DNA chip) 其他(qt)印跡技術(shù)第25頁/共125頁第二十六頁，共126頁。第26頁/共125頁第二十七頁，共126頁。第27頁/共125頁第二十八頁，共126頁。第28頁/共125頁第二十九頁，共126頁。第29頁/共125頁第三十頁，共126頁。A：正常(zhngchng)細(xì)胞，兩綠兩紅. B：一個t(9;22)(q34;q11.2)易位融合信號，一綠一紅兩融合.D：一個t(9;22)(q34;q11.2)易位融合信號，兩紅兩綠一融合，這由于異常染色體上面的BCR和ABL基因分離造成的

12、.E：一個t(9;22)(q34;q11.2)易位融合信號和一個額外的Ph 染色體。一紅一綠三融合.第30頁/共125頁第三十一頁，共126頁。DNA芯片(xn pin)將多種已知序列的DNA排列在一定大小的固相支持物上用于檢測(jin c)細(xì)胞或組織樣品中的核酸種類的技術(shù)。第31頁/共125頁第三十二頁，共126頁。第32頁/共125頁第三十三頁，共126頁。（Polymerase Chain Reaction，PCR）聚合酶鏈反應(yīng)第33頁/共125頁第三十四頁，共126頁。 PCR技術(shù)是1985年由美國科學(xué)家Kary B Mullis建立的體外擴(kuò)增基因片段的方法，它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、

13、簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出(t ch)優(yōu)點(diǎn)，是分子生物學(xué)技術(shù)中一項具有革命性的創(chuàng)舉。 PCR方法(fngf)被美國Science雜志評為1989年的十大科技成就之一，而Taq DNA聚合酶被評選為象征1989年的“年分子”(the molecule of year)。第34頁/共125頁第三十五頁，共126頁。The Nobel Prize in Chemistry 1993for contributions to the developments of methods within DNA-based chemistry Michael SmithLa Jolla, CA, USA Ka

14、ry B. Mullis University of British Columbia Vancouver, Canada for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) methodfor his fundamental contributions to the establishment of oligonucleotide-based, site-directed mutagenesis and its development for protein studies第35頁/共125頁第三十六頁，共126頁。5Primer

15、 15Primer 2Cycle 2Cycle 155 55 5 5Template DNA一、PCR技術(shù)的工作(gngzu)原理55 555 5 55第36頁/共125頁第三十七頁，共126頁。Cycle 355 555 5 555 5 55 555 52530 次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬倍以上。第37頁/共125頁第三十八頁，共126頁。n模板(mbn)DNAn 特異性引物n耐熱DNA聚合酶n dNTPsn Mg2+ PCR體系基本組成(z chn)成分第38頁/共125頁第三十九頁，共126頁。PCR反應(yīng)(fnyng)循環(huán)變性(binxng)95C左右延伸(ynshn)適

16、溫退火Tm-5C 經(jīng)過30個左右的循環(huán)后，PCR的擴(kuò)增倍數(shù)為(1+x)n, x=75%, n為循環(huán)數(shù).第39頁/共125頁第四十頁，共126頁。2. 利用特異性引物以cDNA或基因組DNA為模板(mbn)獲得已知目的基因片段。3. 利用簡并引物從cDNA文庫或基因組文庫中獲得具有一定(ydng)同源性的基因片段。4. 利用(lyng)隨機(jī)引物從cDNA文庫或基因組文庫中隨機(jī)克隆基因。1. 與反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)相結(jié)合，直接從組織和細(xì)胞的mRNA獲得目的基因片段。二、PCR技術(shù)的主要用途（一）目的基因的克?。ㄒ唬┠康幕虻目寺〉?0頁/共125頁第四十一頁，共126頁。（二）基因的體外突變（二）基因的體外

17、突變（三）（三）DNA和和RNA的微量分析的微量分析（四）（四）DNA序列測定序列測定（五）基因突變（五）基因突變(j yn t bin)分分析析二、PCR技術(shù)(jsh)的主要用途第41頁/共125頁第四十二頁，共126頁。第42頁/共125頁第四十三頁，共126頁。RT-PCR技術(shù)(jsh)AAnATTnT 55mRNA反轉(zhuǎn)錄(zhun l)酶mRNAcDNA3TTnTAAnA核糖核酸(h tn h sun)酶HTTnT3DNA poly IcDNA核酸酶S1雙鏈cDNA35 35 5加熱變性加入特異性引物DNA聚合酶PCR擴(kuò)增出大量的產(chǎn)物第43頁/共125頁第四十四頁，共126頁。第44頁

18、/共125頁第四十五頁，共126頁。第45頁/共125頁第四十六頁，共126頁。multidrug resistance associated-protein (mrp) genemultidrug resistance associated-protein (mrp) genemultidrugresistanceassociatedprotein第46頁/共125頁第四十七頁，共126頁。第47頁/共125頁第四十八頁，共126頁。第48頁/共125頁第四十九頁，共126頁。第49頁/共125頁第五十頁，共126頁。此方法(fngf)適用于：第50頁/共125頁第五十一頁，共126頁。第5

19、1頁/共125頁第五十二頁，共126頁。探針法技術(shù)(jsh)原理第52頁/共125頁第五十三頁，共126頁。此方法(fngf)適用于：第53頁/共125頁第五十四頁，共126頁。第54頁/共125頁第五十五頁，共126頁。核酸(h sun)序列分析的基本原理化學(xué)(huxu)裂解法 (Maxam-Gilbert法)DNA鏈的末端合成(hchng)終止法 (Sanger法)第55頁/共125頁第五十六頁，共126頁。一、化學(xué)(huxu)裂解法(Maxam-Gilbert法)基于某些化學(xué)試劑可以使DNA鏈在1個或2個堿基處發(fā)生專一性斷裂的特性，精確地控制反應(yīng)強(qiáng)度，使一個斷裂點(diǎn)僅存在于少數(shù)(shosh

20、)分子中，不同分子在不同位點(diǎn)斷裂，從而獲得一系列大小不同的DNA片段，將這些片段經(jīng)電泳分離。分析前，用同位素標(biāo)記DNA的5末端，經(jīng)放射自顯影即可在X膠片上讀出DNA鏈的序列。第56頁/共125頁第五十七頁，共126頁。 (Sanger雙脫氧(tu yng)鏈終止法)HO P O P O P O CH2OOOOHOHOHOA, C, G or T13 OH5 雙脫氧核苷三磷酸(ln sun)脫去二、DNA鏈末端(m dun)合成終止法Sanger 1958年和1980年兩次獲Nobel獎第57頁/共125頁第五十八頁，共126頁。第58頁/共125頁第五十九頁，共126頁。第59頁/共125頁第

21、六十頁，共126頁。The Nobel Prize in Chemistry 1980for his fundamental studies of the biochemistry of nucleic acids, with particular regard to recombinant-DNA for their contributions concerning the determination of base sequences in nucleic acids Paul BergWalter GilbertFrederick Sanger1/2 of the prize1/4 of

22、 the prize1/4 of the prizeStanford University Stanford, CA, USAHarvard University, Biological Laboratories Cambridge, MA, USAMRC Laboratory of Molecular Biology Cambridge, United Kingdom 第60頁/共125頁第六十一頁，共126頁。三、DNA自動測序用熒光替代放射性核素標(biāo)記是實(shí)現(xiàn)DNA序列分析自動化的基礎(chǔ)。用不同熒光分子標(biāo)記4種ddNTP，然后(rnhu)進(jìn)行Sanger測序反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)電泳（平板電泳或毛細(xì)管電

23、泳）分離。通過4種激光激發(fā)不同大小DNA片段上的熒光分子使之發(fā)射出4種不同波長熒光，檢測器采集熒光信號，并依此確定DNA堿基的排列順序。 第61頁/共125頁第六十二頁，共126頁。多色熒光(ynggung)標(biāo)記毛細(xì)管電泳 單色熒光標(biāo)記平板(pngbn)電泳同位素標(biāo)記平板電泳A C G TACGT測序圖譜T A TTG CAT TG TC TGCATTG T C T第62頁/共125頁第六十三頁，共126頁。computer analysis凝膠中DNA移動(ydng)方向樣品(yngpn)槽激光器輸入(shr)光學(xué)系統(tǒng)成象透鏡聚焦透鏡高靈敏度相機(jī)旋光鏡/棱鏡組件第63頁/共125頁第六十四頁

24、，共126頁。DNA自動測序結(jié)果(ji gu)舉例第64頁/共125頁第六十五頁，共126頁。ABI PRISM 310型 DNA測序儀第65頁/共125頁第六十六頁，共126頁。目前(mqin)所用測序技術(shù)的缺點(diǎn)1、測序的原理是DNA鏈終止法，這注定了一個反應(yīng)所測序列不可能太長，目前為1000個核苷酸左右。2、測序反應(yīng)費(fèi)時費(fèi)力 科學(xué)家們完成第一個人類基因組測序整整花了13年的時間，耗費(fèi)了30億美元的費(fèi)用。3、測序準(zhǔn)確度不高 DNA聚合酶造成的堿基錯配，DNA序列判讀錯誤。4、測序基于(jy)PCR反應(yīng)，需要引物，并且有些結(jié)構(gòu)復(fù)雜的難于進(jìn)行PCR反應(yīng)的片段不能測序。第66頁/共125頁第六十七

25、頁，共126頁。第67頁/共125頁第六十八頁，共126頁。第68頁/共125頁第六十九頁，共126頁。第69頁/共125頁第七十頁，共126頁。第 四 節(jié)第70頁/共125頁第七十一頁，共126頁?；蚪MDNA文庫(wnk) (genomic DNA library)cDNA文庫(wnk) (cDNA library) 基因文庫 (gene library)是指一個包含了某一生物體全部DNA序列(xli)的克隆群體。第71頁/共125頁第七十二頁，共126頁。一、基因組DNA文庫(wnk)基因組DNA文庫(wnk)是指生物的基因組DNA的信息（包括所有的編碼區(qū)和非編碼區(qū)）以DNA片段形式貯存

26、的克隆群體。 用于構(gòu)建基因組文庫的載體有噬菌體、粘粒和酵母(jiom)人工染色體等。第72頁/共125頁第七十三頁，共126頁。cDNA文庫是包含某一組織細(xì)胞在一定條件下所表達(dá)的全部mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄而合成的cDNA序列的克隆群體，它以cDNA片段的形式(xngsh)貯存著該組織細(xì)胞的基因表達(dá)信息。 二、cDNA文庫(wnk)第73頁/共125頁第七十四頁，共126頁。第74頁/共125頁第七十五頁，共126頁。第 五 節(jié) 生 物 芯 片 技 術(shù)Biological chip technology第75頁/共125頁第七十六頁，共126頁。是指將許多特定的DNA片段有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積

27、的支持物上，然后與待測的熒光標(biāo)記樣品進(jìn)行(jnxng)雜交，雜交后用熒光檢測系統(tǒng)等對芯片進(jìn)行(jnxng)掃描，通過計算機(jī)系統(tǒng)對每一位點(diǎn)的熒光信號做出檢測、比較和分析，從而迅速得出定性和定量的結(jié)果。該技術(shù)亦被稱作DNA微陣列(DNA microarray)。 一、基因芯片(j yn xn pin)n基因芯片(j yn xn pin)(gene chip)第76頁/共125頁第七十七頁，共126頁。第77頁/共125頁第七十八頁，共126頁。 將高度密集排列的蛋白分子作為探針點(diǎn)陣固定在固相支持物上，當(dāng)與待測蛋白樣品(yngpn)反應(yīng)時，可捕獲樣品(yngpn)中的靶蛋白，再經(jīng)檢測系統(tǒng)對靶蛋白進(jìn)行

28、定性和定量分析的一種技術(shù)。二、蛋白質(zhì)芯片(xn pin)蛋白質(zhì)芯片(xn pin)(protein chip)第78頁/共125頁第七十九頁，共126頁。The worlds highest-density protein microarray, carrying 22,000 human proteins第79頁/共125頁第八十頁，共126頁。第六節(jié)生物(shngw)大分子相互作用研究技術(shù) The Method of Protein-protein and Protein-DNA Interaction Study第80頁/共125頁第八十一頁，共126頁。一、蛋白質(zhì)相互作用研究(ynji

29、)技術(shù)各種親和分析（標(biāo)簽蛋白沉淀、免疫共沉淀等）酵母雙雜交熒光共振能量轉(zhuǎn)換效應(yīng)分析噬菌體顯示(xinsh)系統(tǒng)篩選n常用蛋白質(zhì)相互作用的研究(ynji)技術(shù)第81頁/共125頁第八十二頁，共126頁。標(biāo)簽融合蛋白(dnbi)結(jié)合實(shí)驗是一個基于親和色譜原理的、分析蛋白(dnbi)質(zhì)體外直接相互作用的方法。（一）標(biāo)簽(bioqin)蛋白沉淀標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實(shí)驗主要用于證明兩種蛋白分子是否存在直接物理結(jié)合、分析兩種分子結(jié)合的具體結(jié)構(gòu)部位及篩選(shixun)細(xì)胞內(nèi)與融合蛋白相結(jié)合的未知分子。 第82頁/共125頁第八十三頁，共126頁。down），在電泳膠中見到相應(yīng)條帶。第83頁/共125頁第八十四

30、頁，共126頁。標(biāo)簽融合蛋白沉淀實(shí)驗(shyn)流程示意圖第84頁/共125頁第八十五頁，共126頁。第85頁/共125頁第八十六頁，共126頁。Schematic of pull-down assay using bacterial expression of bait protein and cell-free expression for the prey protein. 第86頁/共125頁第八十七頁，共126頁。第87頁/共125頁第八十八頁，共126頁。特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。第88頁/共125頁第八十九頁，共126頁。第89頁/共125頁第九十頁，共126頁。第90頁/共12

31、5頁第九十一頁，共126頁。第91頁/共125頁第九十二頁，共126頁。第92頁/共125頁第九十三頁，共126頁。第93頁/共125頁第九十四頁，共126頁。 1989年美國紐約州立大學(xué)的Fields和Song首先(shuxin)描述了酵母雙雜交系統(tǒng)(yeast two-hybrid system)。 第94頁/共125頁第九十五頁，共126頁。該系統(tǒng)的建立是基于對真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過程的認(rèn)識(rn shi)。真核生物基因轉(zhuǎn)錄需要反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與，真核生物轉(zhuǎn)錄因子含有兩個不同的結(jié)構(gòu)域：轉(zhuǎn)錄激活因子DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BD)(DNA binding domain) 轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AD)

32、(activation domain) 第95頁/共125頁第九十六頁，共126頁。 這兩個結(jié)構(gòu)域各具功能，互不影響, 單獨(dú)存在時沒有轉(zhuǎn)錄激活的功能，只有兩者通過共價或非共價鍵連接建立起來的空間結(jié)構(gòu)方可表現(xiàn)出一個完整(wnzhng)的激活特定基因表達(dá)的激活因子的功能。第96頁/共125頁第九十七頁，共126頁。 Gal4為酵母半乳糖苷酶基因gal1的轉(zhuǎn)錄激活因子，天然的Gal4分子(fnz)是由一條由881個氨基酸殘基組成的多肽鏈。 兩個結(jié)構(gòu)域中的DNA-BD由位于N-末端的1147位多肽構(gòu)成，能識別位于Gal4效應(yīng)基因的上游激活序列(upstream activation sequence，

33、UAS)。此外，在其N-端還具有一段核定位序列。AD由位于C-末端的768881位多肽構(gòu)成。 當(dāng)Gal4的兩個結(jié)構(gòu)域位于不同肽鏈上，只要它們在空間上充分接近，則能恢復(fù)Gal4作為轉(zhuǎn)錄因子的活性。第97頁/共125頁第九十八頁，共126頁。 Fields和Song將兩個融合蛋白分別構(gòu)建在穿梭(chun su)質(zhì)粒上，一個是將Gal4的DNA-BD與酵母蛋白SNF1融合；另一個是將Gal4的AD和酵母蛋白SNF4融合。 其中，SNF1是一種絲氨酸/蘇氨酸的蛋白激酶，SNF4是它的一個結(jié)合蛋白，這兩種蛋白是已知可以相互作用的。第98頁/共125頁第九十九頁，共126頁。 當(dāng)兩種穿梭質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化含有Ga

34、l4結(jié)合位點(diǎn)的報告基因LacZ的酵母菌株后，通過SNFl與SNF4的相互作用，Gal4的DNA-BD與Gal4的AD靠近, 形成一個大的復(fù)合物Gal4BD-SNF1-SNF4-Gal4-AD。 Gal4的DNA-BD可識別位于Gal4效應(yīng)基因的UAS，并可與之結(jié)合； Gal4的AD則可與轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中其他成分結(jié)合，激活(j hu)UAS下游報告基因LacZ的轉(zhuǎn)錄。第99頁/共125頁第一百頁，共126頁。酵母轉(zhuǎn)錄(zhun l)因子（Gal 4）與BD-fusion -誘餌（bait）與AD-fusion -獵物(li w)或靶蛋白（prey or target protein）報告基因（rep

35、orter gene） -Lac Z（編碼(bin m)-半乳糖苷酶）第100頁/共125頁第一百零一頁，共126頁。2 酵母(jiom)雙雜交系統(tǒng)的原理ADYADYXDNA-BDGAL4 UASPromoterlacZ reporter genetranscriptionGAL4 UASPromoterlacZ reporter geneGAL4 UASPromoterlacZ reporter geneXDNA-BDX-Gal是-半乳糖苷酶(-galactosidase)的顯色底物，在-半乳糖苷酶的催化下會產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物，所以可以輕易(qng y)的檢測出LacZ基因的表達(dá)。 第101頁/共

36、125頁第一百零二頁，共126頁。第102頁/共125頁第一百零三頁，共126頁。 表達(dá)“誘餌(yu r)”和“獵物”蛋白； 檢驗這兩種蛋白表達(dá)后能否激活酵母中的報告基因。3 酵母雙雜交系統(tǒng)的基本(jbn)策略第103頁/共125頁第一百零四頁，共126頁。4 酵母雙雜交系統(tǒng)(xtng)的優(yōu)點(diǎn)（1） 高敏感性 采用高拷貝和強(qiáng)啟動子的表達(dá)載體，使融合蛋白過量表達(dá)； 激活結(jié)構(gòu)域和結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，之后又與啟動子結(jié)合，此三元復(fù)合體使融合蛋白各組分間結(jié)合更趨于穩(wěn)定； 通過mRNA使信號放大； 檢測的結(jié)果是基因表達(dá)產(chǎn)物的累積(lij)效應(yīng)，可檢測存在于蛋白質(zhì)間的微弱或暫時的相互作用。第1

37、04頁/共125頁第一百零五頁，共126頁。（2）真實(shí)性 檢測在活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，作用條件與作用力無需模擬，在一定程度上代表細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)情況。（3）簡潔性 融合蛋白相互作用后，減少了制備抗體和純化蛋白質(zhì)的繁瑣步驟。（4）廣泛性 采用不同組織器官細(xì)胞類型和分化時期的材料構(gòu)建cDNA文庫，能分析不同亞細(xì)胞部位和功能的蛋白質(zhì)，適用于部分(b fen)細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核及膜結(jié)合蛋白。第105頁/共125頁第一百零六頁，共126頁。 分析已知蛋白之間的相互作用 對蛋白質(zhì)功能域的分析，如可將待測蛋白質(zhì)進(jìn)行點(diǎn)突變或缺失突變再進(jìn)行雙雜交。 用已知功能蛋白質(zhì)篩選雙雜交cDNA文庫(wnk)，研究蛋白質(zhì)之間相互作用的傳遞

38、途徑，發(fā)現(xiàn)新的相互作用蛋白。 分析新基因的生物學(xué)功能。即以功能未知的新基因去篩選文庫(wnk)，再根據(jù)篩的已知基因推測新基因功能。 繪制蛋白質(zhì)相互作用系統(tǒng)圖譜5 酵母(jiom)雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用現(xiàn)狀第106頁/共125頁第一百零七頁，共126頁。例如(lr)：利用酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)新的相互作用蛋白質(zhì) 將已知基因作為誘餌，在選定的cDNA文庫中篩選與誘餌蛋白相互作用的蛋白，從篩選到的陽性酵母菌株中可以分離得到AD-文庫載體，并從載體中進(jìn)一步克隆得到隨機(jī)插入的cDNA片段，并對該片段的編碼序列在GENEBANK中進(jìn)行比較，研究與已知基因在生物學(xué)功能(gngnng)上的聯(lián)系。 第107頁/共125頁第一

39、百零八頁，共126頁。電泳遷移率變動測定(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)或稱凝膠遷移變動實(shí)驗(gel shift assay)最初用于研究DNA結(jié)合蛋白與相應(yīng)DNA序列間的相互作用，可用于定性和定量分析，已經(jīng)成為轉(zhuǎn)錄因子研究的經(jīng)典(jngdin)方法。目前這一技術(shù)也被用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定RNA序列間的相互作用。二、DNA-蛋白質(zhì)相互作用分子分析(fnx)技術(shù)（一）電泳遷移率變動(bindng)測定第108頁/共125頁第一百零九頁，共126頁。第109頁/共125頁第一百一十頁，共126頁。第110頁/共125頁第一百一十一頁，共126頁。放射自顯影未結(jié)合探針結(jié)合有蛋白的探針標(biāo)記探針1X1X1X1X核蛋白提取物1X10X10X未標(biāo)記探針10Xn凝膠遷移(qiny)實(shí)驗結(jié)果示意圖第111頁/共125頁第一百一十二頁，共126頁。n凝膠遷移(qiny)實(shí)驗結(jié)果圖Nuclear extracts from Tsc2+/+ or Tsc2-/- MEFs were used in the EMSAusing the HRE-3 from the PTEN