040-01非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法

1、SOP非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)檢查法文件編碼：SOP-ZL-TY040-01頁碼：第1頁共14頁頒發(fā)部門：制定人：部門審核人：QA審核人：批準(zhǔn)人：質(zhì)量部生效日期：年 月曰年 月曰年 月曰年 月曰年 月曰分發(fā)部門：檔案室質(zhì)量部質(zhì)量控制部1.簡述微生物計(jì)數(shù)法系用于能在有氧條件下生長的嗜溫細(xì)菌和真菌的計(jì)數(shù)。當(dāng)本法用于檢查非無菌制劑及其原、輔料等是否符合相應(yīng)的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，應(yīng)按下述規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)，包括樣品的取 樣量和結(jié)果的判斷等。除另有規(guī)定外，本法不適用于活菌制劑的檢査。微生物計(jì)數(shù)試驗(yàn)環(huán)境應(yīng)符 合微生物限度檢查的要求。檢驗(yàn)全過程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止再污染，防止污染的措施不 得影響供

2、試品中微生物的檢出。單向流空氣區(qū)域、工作臺(tái)面及環(huán)境應(yīng)定期進(jìn)行監(jiān)測(cè)。如供試品有 抗菌活性，應(yīng)盡可能去除或中和。供試品檢査時(shí)，若使用了中和劑或滅活劑，應(yīng)確認(rèn)其有效性及 對(duì)微生物無毒性。供試液制備時(shí)如果使用了表面活性劑，應(yīng)確認(rèn)其對(duì)微生物無毒性以及與所使用 中和劑或滅活劑的相容性。2計(jì)數(shù)方法計(jì)數(shù)方法包括平皿法、 薄膜過濾法和最可能數(shù)法（Most-Probable-Number Method,簡稱MPN法）。MPN法用于微生物計(jì)數(shù)時(shí)精確度較差，但對(duì)于某些微生物污染量很小的供試品，MPN法可能是更適合的方法。供試品檢查時(shí)，應(yīng)根據(jù)供試品理化特性和微生物限度標(biāo)準(zhǔn)等因素選擇計(jì)數(shù) 方法，檢測(cè)的樣品量應(yīng)能保證所獲得

3、的試驗(yàn)結(jié)果能夠判斷供試品是否符合規(guī)定。所選方法的適用 性須經(jīng)確認(rèn)。2.1計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢査和供試品計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)供試品微生物計(jì)數(shù)中所使用的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行適用性檢查。供試品的微生物計(jì)數(shù)方法應(yīng)進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)，以確認(rèn)所采用的方法適合于該產(chǎn)品的微生物計(jì)數(shù)。若檢驗(yàn)程序或產(chǎn)品發(fā)生變化可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)，計(jì)數(shù)方法應(yīng)重新進(jìn)行適用性試驗(yàn)。2.2菌種及菌液制備2.2.1菌種試驗(yàn)用菌株的傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保藏中心獲得的干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保存，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查和計(jì)數(shù)方 法適用性試驗(yàn)用菌株見表1。SOP-ZL-TY040-01微生物計(jì)數(shù)檢查

4、法第2頁共15頁 1試驗(yàn)菌懣的制書和隹用試監(jiān)曲憔試崟藺浪的劄待計(jì)數(shù)覽拝基詩用性檢畫計(jì)敕方憩適用性試驗(yàn)希以若期敕計(jì)戟籌苗和韻即苗盤黃削蔔萄球鑿(StsphyiactKcui au -CCMCC ( B)藤IB大耳林茁柑 堆養(yǎng)華或煎酪大豆 稱箱萼埔養(yǎng)基.犖 養(yǎng)ifi廉30-3512 .芾養(yǎng)時(shí)間- 24小時(shí)勝麟女豆.豚取脂培算 基刪酪大豆陳離悴培 菲墓，培錚覘度B5Vt堆界時(shí)伺卓Ifi過3天*按科St不大于lOOtfn戾酩尢豆味瓊脂培養(yǎng) 基或鵝幣大豆瞇嶽體培 捧基( (MPN祛”堆界祖30-3512T第葬時(shí)間 術(shù)超過3天接種童不 大干itwicfu廟躱假單N圈(PTCudoTFIDFra!ffrrp

5、j- giHg CGMCCtB)、膜酪大豆廟瓊脂 堵養(yǎng)號(hào)或般皤丸豆 脈掖體培養(yǎng)基壤ft ft 3D 3St冊(cè)養(yǎng)時(shí)間10 - 24小時(shí)般酪大豆眛瓊脂皓養(yǎng) 基和藤隔犬耳脇瓏體塩 菲昜維養(yǎng)如度酬3510+捅界時(shí)間不趙過3天*BE種St不大于IOOc(u腕略丈豆除球脂培薜 坯或番醃丈牡歸雜徉培t3(-35t,堵甘時(shí)間 不趨過$天.艇種氏菲 丸于】燉知(BaditKf陽tintCMCCB)3 &on拽龍犬豆陳瓊酯陳痕萍培弄基*培 養(yǎng)伍厘卵亠硏弋 培界時(shí)瓣誼昭 小時(shí)轟酪大耳殊瓊脂塔養(yǎng) 圣和腭體氏豆陳潢體第 養(yǎng)鑫.站養(yǎng)血度旳 站C.培養(yǎng)時(shí)河半創(chuàng)過3天 篠種量芥大于lOOdui掛疇尢豈胖琳脂培養(yǎng) 星或

6、胰略尢克殊港悴塘度30鮎堵養(yǎng)時(shí)間 不坦過3 X,搖胖童不 大于iQOcfu白色念珠(CAM!idaJCCMCC(F)9a 001)沙氏塾萄榛瓊帝 培莽基或沙氏和葡 轄箱體培養(yǎng)基.堵 養(yǎng)Si度曲一為匸 堵養(yǎng)時(shí)祠2-3犬?dāng)D酪大豆腺琉脂堆養(yǎng).iflaiarw35V,培捽時(shí)間不毎過F天 撞和雖不大于lOOcfu脂培界基， 培菲 沮度20-25X?,塔養(yǎng)時(shí)聞不JKil 5天，F(xiàn)S種童不大干lOOcfu観弗大豆總瓊脂培養(yǎng) CCMCC(F)衿氏葡珂糖瓊脂 堵養(yǎng)筆或卻轉(zhuǎn)餐 扇驕晾脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度20-Z5V ,堵養(yǎng)時(shí)聞5-7 X 或直舛聯(lián)側(cè)豐用的 也于騎酣丈豆蠻總脂坤養(yǎng) 蟹*集養(yǎng)ifi度軸藥 P 培驛時(shí)間不

7、超過5天 揍種豐不大于lOOcfu沙氏琦萄糖垃脂陪養(yǎng)基+焰靠S1度SO25t?.塔捽時(shí)間不眄過5天.犍種車 大干IMU廉酪丸豆瞬尊脂站界 塔冊(cè)FN祛不適用、,養(yǎng)混度初輻弋塔捍 時(shí)間不趙址5天，接稈 駐不大干lOOcfu註氏葡萄糖球追度20 - 25t?,塔養(yǎng)時(shí)間不超改天.棲科*不 大于lflflcfu肖II用玫現(xiàn)虹IftW培養(yǎng)基(N宦卻菌軸薛母11總殖吋.應(yīng)進(jìn)疔堆界募適用性楡住，檢崔比崔同找氏珊利箱瓊脂垛養(yǎng)基*2.2.2菌液制備按表1規(guī)定程序培養(yǎng)各試驗(yàn)菌株。取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物，用PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜

8、濃度的菌懸液；取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物加人35ml含0. 05% (ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液， 將孢子洗脫。 然后， 采用適宜的方法吸出孢子懸液至 無菌試管內(nèi)， 用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0無菌氣化鈉-蛋白胨緩沖液或0. 9%無菌氯 化鈉溶液制成適宜濃度的黑曲霉孢子懸液。菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用；若保存在28C,可在24小時(shí)內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在28C，在驗(yàn)證過的貯存期內(nèi)使用。SOP-ZL-TY040-01微生物計(jì)數(shù)檢查法第3頁共15頁2.2.3陰性對(duì)照為確認(rèn)試驗(yàn)條件是否符合要求，應(yīng)進(jìn)行陰

9、性對(duì)照試驗(yàn)，陰性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)無菌生長。如陰性對(duì)照有菌生長，應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查。2.2.4培養(yǎng)基適用性檢査微生物計(jì)數(shù)用的成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基適用性檢查。按表1規(guī)定，接種不大于lOOcfu的菌液至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基管或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng) 基平板或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板，置表1規(guī)定條件下培養(yǎng)。每一試驗(yàn)菌株平行制備2管或2個(gè)平皿。同時(shí)，用相應(yīng)的對(duì)照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗(yàn)。被檢固體培養(yǎng)基上的菌落平 均數(shù)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的比值應(yīng)在0.52范圍內(nèi)，且菌落形態(tài)大小應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落一致；被檢液體培養(yǎng)基管與對(duì)照培養(yǎng)基管比較，試驗(yàn)菌應(yīng)生長良好。2.2.5

10、計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)2.2.5.1供試液制備根據(jù)供試品的理化特性與生物學(xué)特性，采取適宜的方法制備供試液。供試液制備若需加溫時(shí)，應(yīng)均勻加熱，且溫度不應(yīng)超過45C。供試液從制備至加入檢驗(yàn)用培養(yǎng)基，不得超過1小時(shí)。常用的供試液制備方法如下。如果下列供試液制備方法 經(jīng)確認(rèn)均不適用，應(yīng)建立其他適宜的方法。(1)水溶性供試品 取供試品， 用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液， 或pH7.2磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基溶解或稀釋制成1: 10供試液。若需要，調(diào)節(jié)供試液pH值至6&必要時(shí)，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步10倍系列稀釋。水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液。(2)水不溶性非油

11、脂類供試品 取供試品，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，或pH7.2磷 酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基制備成1：10供試液。分散力較差的供試品，可在稀釋液中加人表面活性劑如0.1 %的聚山梨酯80,使供試品分散均勻。若需要，調(diào)節(jié)供試液pH值至6& 必要時(shí)，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步10倍系列稀釋。(3)油脂類供試品取供試品，加人無菌十四烷酸異丙酯使溶解，或與最少量并能使供試品乳化的無菌聚山梨酯80或其他無抑菌性的無菌表面活性劑充分混勻。表面活性劑的溫度一般不 超過40C：(特殊情況下，最多不超過45C)，小心混合，若需要可在水浴中進(jìn)行，然后加人預(yù)熱 的稀釋液使成1：10供試液，

12、保溫，混合，并在最短時(shí)間內(nèi)形成乳狀液。必要時(shí)，用稀釋液或含 上述表面活性劑的稀釋液進(jìn)一步10倍系列稀釋。(4) 需用特殊方法制備供試液的供試品a、膜劑供試品取供試品，剪碎，加pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，或pH 7.2磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨 液體培養(yǎng)基，浸泡，振搖，制成1：10的供試液。若需要，調(diào)節(jié)供試液pH值至68。必要時(shí)，SOP-ZL-TY040-01微生物計(jì)數(shù)檢查法第4頁共15頁用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步10倍系列稀釋。b、腸溶及結(jié)腸溶制劑供試品取供試品，加人pH 6.8無菌磷酸鹽緩沖液(用于腸溶制劑)或pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液(用于結(jié) 腸溶制劑)，置45C水浴中，振搖，使

13、溶解，制成1: 10的供試液。必要時(shí)，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步10倍系列稀釋。C、氣霧劑、噴霧劑供試品取供試品，置一20C或其他適宜溫度冷凍約1小時(shí)，取出，迅速消毒供試品開啟部位，用無菌鋼錐在該部位鉆一小孔，放至室溫，并輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)容器，使拋射劑緩緩全部釋出。供試品亦可采用其 他適宜的方法取出。用無菌注射器從每一容器中吸出藥液于無菌容器中混合，然后取樣檢査。d、貼膏劑供試品取供試品，去掉防粘層，將粘貼面朝上放置在無菌玻璃或塑料器皿上，在粘貼面朝上覆蓋一層適宜的無菌多孔材料(如無菌紗布)，避免貼膏劑粘貼在一起。將處理后的貼膏劑放入盛有適宜體積并含有表面活性劑(如聚山梨酯80或卵磷脂)稀釋液的容器中

14、，振蕩至少30分鐘。必要時(shí), 用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步10倍系列稀釋。2.2.5.2接種和稀釋按下列要求進(jìn)行供試液的接種和稀釋，制備微生物回收試驗(yàn)用供試液。所加菌液的體積應(yīng)不 超過供試液體積的1%。為確認(rèn)供試品中的微生物能被充分檢出，首先應(yīng)選擇最低稀釋級(jí)的供試 液進(jìn)行計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)。(1)試驗(yàn)組 取上述制備好的供試液，加入試驗(yàn)菌液，混勻，使每Iml供試液或每張濾膜所濾過的供試液中含菌量不大于lOOcfu。(2)供試品對(duì)照組取制備好的供試液，以稀釋液代替菌液同試驗(yàn)組操作。(3)菌液對(duì)照組取不含中和劑及滅活劑的相應(yīng)稀釋液替代供試液，按試驗(yàn)組操作加人試驗(yàn)菌液并進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)。若因供試品抗菌

15、活性或溶解性較差的原因?qū)е聼o法選擇最低稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)采用適宜的方法對(duì)供試液進(jìn)行進(jìn)一步的處理。如果供試品對(duì)微生物生長的抑制作用無法以其他方法消除，供試液可經(jīng)過中和、稀釋或薄膜過濾處理后再加人試驗(yàn)菌懸液進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。2.2.5.3抗菌活性的去除或滅活供試液接種后，按下列微生物回收”規(guī)定的方法進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)。若試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組菌落數(shù)的值小于菌液對(duì)照組菌落數(shù)值的50%，可采用下述方法消除供試品的抑菌活性。SOP-ZL-TY040-01微生物計(jì)數(shù)檢查法第5頁共15頁(1)增加稀釋液或培養(yǎng)基體積。(2)加人適宜的中和劑或滅活劑。中和劑或滅活劑(表2 )可用于消除干

16、擾物的抑菌活性，最好在稀釋液或培養(yǎng)基滅菌前加入。若使用中和劑或滅活劑，試驗(yàn)中應(yīng)設(shè)中和劑或滅活劑對(duì)照組，即取相應(yīng)量稀釋液替代供試品同試 驗(yàn)組操作，以確認(rèn)其有效性和對(duì)微生物無毒性。中和劑或滅活劑對(duì)照組的菌落數(shù)與菌液對(duì)照級(jí)的 菌落數(shù)的比值應(yīng)在0.52范圍內(nèi)。表2常見干擾物的中和劑或滅活劑干擾物可選用的中和劑或滅活方法戊醛、水制劑亞硫酸氫鈉酚類、乙醇、醛類、吸附物稀釋法醛類甘氨酸季銨化合物、對(duì)羥基苯甲酸、雙胍類化合物卵磷脂季銨化合物、碘、對(duì)羥基苯甲酸聚山梨酯水銀巰基醋酸鹽水銀、汞化物、醛類硫代硫酸鹽EDTA、喹喏酮類抗生素鎂或鈣離子磺胺類對(duì)氨基苯甲酸3-內(nèi)酰胺類抗生素3-內(nèi)酰胺酶(3)采用薄膜過濾法(

17、4)上述幾種方法的聯(lián)合使用若沒有適宜消除供試品抑菌活性的方法，對(duì)特定試驗(yàn)菌回收的失敗，表明供試品對(duì)該試驗(yàn)菌 具有較強(qiáng)抗菌活性，同時(shí)也表明供試品不易被該類微生物污染。但是，供試品也可能僅對(duì)特定試 驗(yàn)菌株具有抑制作用，而對(duì)其他菌株沒有抑制作用。因此，根據(jù)供試品須符合的微生物限度標(biāo)準(zhǔn) 和菌數(shù)報(bào)告規(guī)則，在不影響檢驗(yàn)結(jié)果判斷的前提下，應(yīng)采用能使微生物生長的更高稀釋級(jí)的供試 液進(jìn)行計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)。若方法適用性試驗(yàn)符合要求，應(yīng)以該稀釋級(jí)供試液作為最低稀釋級(jí) 的供試液進(jìn)行供試品檢査。2.2.5.4供試品中微生物的回收表1所列的計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)用的各試驗(yàn)菌應(yīng)逐一進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)。微生物的回收可采用平皿法

18、、薄膜過濾法或MPN法。(1)平皿法平皿法包括傾注法和涂布法。表1中每株試驗(yàn)菌每種培養(yǎng)基至少制備2個(gè)平皿，以算術(shù)均值作為計(jì)數(shù)結(jié)果。傾注法 取照上述“供試液的制備”“接種和稀釋”和抗菌活性的去除或滅活”制備的供試液lml，置直徑90mm的無菌平皿中，注人1520ml溫度不超過45C熔化的胰酪大豆胨瓊脂或 沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，SOP-ZL-TY040-01微生物計(jì)數(shù)檢查法第6頁共15頁混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。若使用直徑較大的平皿，培養(yǎng)基的用量應(yīng)相應(yīng) 增加。按表1規(guī)定條件培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。同法測(cè)定供試品對(duì)照組及菌液對(duì)照組菌數(shù)。計(jì)算各試驗(yàn)組的 平均菌落數(shù)。涂布法 取1520ml溫度不超過45C的胰酪大豆胨瓊

19、脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，注人直 徑90mm的無菌平皿，凝固，制成平板，采用適宜的方法使培養(yǎng)基表面干燥。若使用直徑較大的 平皿，培養(yǎng)基用量也應(yīng)相應(yīng)增加。每一平板表面接種上述照洪試液的制備”接種和稀釋”和抗菌活性的去除或滅活”制備的供試液不少于0.1ml。按表1規(guī)定條件培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。同法測(cè)定供試 品對(duì)照組及菌液對(duì)照組菌數(shù)。計(jì)算各試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)。（2）薄膜過濾法薄膜過濾法所采用的濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45pm，直徑一般為50mm，若采用其他直徑的濾膜，沖洗量應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。供試品及其溶劑應(yīng)不影響濾膜材質(zhì)對(duì)微生物的截留。濾器及濾膜使用 前應(yīng)采用適宜的方法滅菌。使用時(shí)，應(yīng)保證濾膜在過濾前后的完整性。

20、水溶性供試液過濾前先將 少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品，其濾膜和濾器在使用前應(yīng)充分干燥。為發(fā)揮濾膜的 最大過濾效率，應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個(gè)濾膜表面。供試液經(jīng)薄膜過濾后，若需 要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量一般為100ml?？倹_洗量不得超過1000ml，以避免濾膜上的微生物受損傷。取照上述供試液的制備” “接種和稀釋”和抗菌活性的去除或滅活”制備的供試液適量（一般取相當(dāng)于lg、lml或10cm2的供試品，若供試品中所含的菌數(shù)較多時(shí)，供試液可酌情減量），加至適量的稀釋液中，混勻，過濾。用適量的沖洗液沖洗濾膜。若測(cè)定需氧 菌總數(shù)，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基

21、平板上；若測(cè)定霉菌和酵母總數(shù)，轉(zhuǎn)移濾 膜菌面朝上貼于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上。按表1規(guī)定條件培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。每株試驗(yàn)菌每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。同法測(cè)定供試品對(duì)照組及菌液對(duì)照組菌數(shù)。（3）MPN法MPN法的精密度和準(zhǔn)確度不及薄膜過濾法和平皿計(jì)數(shù)法，僅在供試品需氧菌總數(shù)沒有適宜計(jì)數(shù)方法的情況下使用，本法不適用于霉菌計(jì)數(shù)。若使用MPN法，按下列步驟進(jìn)行。取照上述“供試液的制備”“接種和稀釋”和“抗菌活性的去除或滅活”制備的供試液至少3個(gè)連續(xù)稀釋級(jí)，每一稀釋級(jí)取3份lm l分別接種至3管裝有910ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中， 同法測(cè)定菌液對(duì)照組菌數(shù)。必要時(shí)可在培養(yǎng)基中加入表面活性劑、中和劑或滅活劑。

22、接種管置3035C培養(yǎng)3天，逐日觀察各管微生物生長情況。如果由于供試品的原因使得結(jié)果難以判斷，可將該管培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，在相同條件下培養(yǎng)12天，觀察是否有微生物生長。根據(jù)微生物生長的管數(shù)從表3查被測(cè)試品每1g或每1ml中需氧菌總數(shù)的最可能數(shù)。SOP-ZL-TY040-01微生物計(jì)數(shù)檢查法第8頁共15頁每看會(huì)岸晶的I ml AQk010. OOLKPLW3. C7, 4169. 517205抽154382TF538-129421芻AO甜994359&429d9439&423S943S1 91046416IB!439181751719tU030

23、300ISO30糾09318360150303802 IQ3Q+002&09039024040990460901PM01 loo2004訂0011004注I我內(nèi)所列檢螫鼻如改片！】期吹曲兒0.】期血和60加I或ml)吋*表內(nèi)載* 庖HI磴疇侍10悟*如戒用0. 01(-ft mH v O- CO就或ml*n O- OOfllftCE時(shí) 鋰內(nèi) 卞薩畑應(yīng)堆鋼10倍. 辰険類榕*SOP-ZL-TY040-01微生物計(jì)數(shù)檢查法第9頁共15頁2.2.5.5結(jié)果判斷計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)中，采用平皿法或薄膜過濾法時(shí)，試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組菌落數(shù)的值與菌液對(duì)照組菌落數(shù)的比值應(yīng)在0.52范圍內(nèi)；采用

24、MPN法時(shí)，試驗(yàn)組菌數(shù)應(yīng)在菌液對(duì)照組菌數(shù)的95%置信限內(nèi)。若各試驗(yàn)菌的回收試驗(yàn)均符合要求，照所用的供試液制備方法及計(jì)數(shù)方法進(jìn)行該供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)。方法適用性確認(rèn)時(shí)，若采用上述方 法還存在一株或多株試驗(yàn)菌的回收達(dá)不到要求，那么選擇回收最接近要求的方法和試驗(yàn)條件進(jìn)行供試品的檢査。3供試品檢查3.1檢驗(yàn)量檢驗(yàn)量即一次試驗(yàn)所用的供試品量（g、ml或cm2）。一般應(yīng)隨機(jī)抽取不少于2個(gè)最小包裝的供試品，混合，取規(guī)定量供試品進(jìn)行檢驗(yàn)。除另有規(guī)定外，一般供試品的檢驗(yàn)量為10g或10ml;膜劑為100cm2;貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗(yàn)量可以酌減。檢驗(yàn)時(shí)，應(yīng)從2個(gè)以上最小包裝單位中抽取供

25、試品，大蜜丸還不得少于4丸，膜劑還不得少于4片。3.2供試品的檢査按計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的計(jì)數(shù)方法進(jìn)行供試品中需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的測(cè) 定。胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基用于測(cè)定需氧菌總數(shù)；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng) 基用于測(cè)定霉菌和酵母總數(shù)。3.3陰性對(duì)照試驗(yàn)以稀釋液代替供試液進(jìn)行陰性對(duì)照試驗(yàn)，陰性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)無菌生長，如果陰性對(duì)照有菌生長，應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)査。3.4平皿法平皿法包括傾注法和涂布法。除另有規(guī)定外，取規(guī)定量供試品，按方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方 法進(jìn)行供試液制備和菌數(shù)測(cè)定，每稀釋級(jí)每種培養(yǎng)基至少制備2個(gè)平板。3.4.1培養(yǎng)和計(jì)數(shù)除另有規(guī)定外，胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板在3035

26、C培養(yǎng)35天，沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板在2025C培養(yǎng)57天，觀察菌落生長情況，點(diǎn)計(jì)平板上生長的所有菌落數(shù)，計(jì)數(shù)并報(bào) 告。菌落蔓延生長成片的平板不宜計(jì)數(shù)。點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)后，計(jì)算各稀釋級(jí)供試液的平均菌落數(shù)，按 菌數(shù)報(bào)告規(guī)則報(bào)告菌數(shù)。 若同稀釋級(jí)兩個(gè)平板的菌落數(shù)平均值不小于15，則兩個(gè)平板的菌落數(shù)不能相差1倍或以上。3.4.2菌數(shù)報(bào)告規(guī)則需氧菌總數(shù)測(cè)定宜選取平均菌落數(shù)小于300cfu的稀釋級(jí)、霉菌和酵母菌總數(shù)測(cè)定宜選取平均菌落數(shù)小于lOOcfu的稀釋級(jí)，作為菌數(shù)報(bào)告的依據(jù)。 取最髙的平均菌落數(shù)，算lg、lml或10cm2SOP-ZL-TY040-01微生物計(jì)數(shù)檢查法第10頁共15頁供試品中所含的微生物

27、數(shù)，取兩位有效數(shù)字報(bào)告。如各稀釋級(jí)的平板均無菌落生長，或僅最低稀釋級(jí)的平板有菌落生長，但平均菌落數(shù)小于1時(shí)，以v1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。3.5薄膜過濾法除另有規(guī)定外，按計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法進(jìn)行供試液制備。取相當(dāng)于lg、Iml或10cm2供試品的供試液，若供試品所含的菌數(shù)較多時(shí)，可取適宜稀釋級(jí)的供試液，照方法適用性 試驗(yàn)確認(rèn)的方法加至適量稀釋液中，立即過濾，沖洗，沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于胰酪大豆 胨瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)。3.5.1培養(yǎng)和計(jì)數(shù)培養(yǎng)條件和計(jì)數(shù)方法同平皿法，每張濾膜上的菌落數(shù)應(yīng)不超過100cfu。3.5.2菌數(shù)報(bào)告規(guī)則以相當(dāng)于lg、Iml或10cm

28、2供試品的菌落數(shù)報(bào)告菌數(shù)；若濾膜上無菌落生長，以v1報(bào)告菌數(shù)（每張濾膜過濾lg、Iml或10cm2供試品），或v1乘以最低稀釋 倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。3.6 MPN法取規(guī)定量供試品，按方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法進(jìn)行供試液制備和供試品接種，所有試驗(yàn)管 在3035C：培養(yǎng)35天，如果需要確認(rèn)是否有微生物生長，按方法適用性試驗(yàn)確定的方法進(jìn) 行。記錄每一稀釋級(jí)微生物生長的管數(shù)， 從表3査每I g或lm l供試品中需氧菌總數(shù)的最可能數(shù)。3.7結(jié)果判斷需氧菌總數(shù)是指胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上生長的總菌落數(shù)（包括真菌菌落數(shù)）；霉菌和酵母菌總數(shù)是指沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長的總菌落數(shù)（包括細(xì)菌菌落數(shù)）。若因沙氏葡萄糖瓊

29、脂培養(yǎng)基上生長的細(xì)菌使霉菌和酵母菌的計(jì)數(shù)結(jié)果不符合微生物限度要求，可使用含抗生素（如氯霉素、慶大霉素）的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或其他選擇性培養(yǎng)基（如玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基）進(jìn)行霉菌和酵母菌總數(shù)測(cè)定。使用選擇性培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基適用性檢查。若采用MPN法，測(cè)定結(jié)果為需氧菌總數(shù)。各品種項(xiàng)下規(guī)定的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)解釋如下：101cfu:可接受的最大菌數(shù)為20;102cfu:可接受的最大菌數(shù)為200;310 cfu:可接受的最大菌數(shù)為2000,依此類推。若供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的檢査結(jié)果均符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定，判供試品符合規(guī)定；若其中任何一項(xiàng)不符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定，判供試品不符合 規(guī)定。4稀

30、釋液、沖洗液及培養(yǎng)基SOP-ZL-TY040-01微生物計(jì)數(shù)檢查法第11頁共15頁稀釋液配制后，應(yīng)采用驗(yàn)證合格的滅菌程序滅菌。pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液、pH 7.2無菌磷酸鹽緩沖液、SOP-ZL-TY040-01微生物計(jì)數(shù)檢查法第12頁共15頁P(yáng)H7.6無菌磷酸鹽緩沖液照緩沖液配制后，過濾，分裝，滅菌。如需要，可在上述稀釋液滅菌前 或滅菌后加人表面活性劑或中和劑等。0.9%無菌氯化鈉溶液取氯化鈉9.0g,加水溶解使成1000ml，過濾，分裝，滅菌。5培養(yǎng)基及其制備方法培養(yǎng)基可按以下處方制備，也可使用按該處方生產(chǎn)的符合要求的脫水培養(yǎng)基。配制后，應(yīng)按7.3.

31、2，加入葡萄糖，分裝，滅菌。胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基置加人葡萄糖，搖勻，分裝，滅菌。40.0g除葡萄糖、瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)驗(yàn)證過的咼壓滅菌程序滅菌。5.1胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB)胰酪胨17.0g氯化鈉5.0g大豆木瓜蛋白酶水解物3. 0g磷酸氫二鉀2.5g葡萄糖/無水葡萄糖2. 5g/2. 3g水1000ml胰酷胨17.0g氯化鈉5.0g大豆木瓜蛋白酶水解物3.0g磷酸氫二鉀2.5g葡萄糖/無水葡萄糖2.5g/2.3g水1000ml除葡萄糖外，取上述成分，混合,微溫溶解，濾過，調(diào)節(jié)pH使滅菌后在2025C培養(yǎng)。5.2胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(TSA)胰酪胨15.0g瓊脂15

32、.0g大豆木瓜蛋白酶水解物5.0g1000ml氯化鈉5.0g除瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH使滅菌后在25C的p H值為7.3 ).2,加人瓊脂，加熱溶化后，搖勻，分裝，滅菌。5.3沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基(SDB)動(dòng)物組織胃蛋白酶水解物葡萄糖20.0g和胰酪胨等量混合物10.0g1000ml除葡萄糖外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH使滅菌后在25C的pH值為5.6.2,5.4沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 動(dòng)物組織胃蛋白酶水解物(SDA)瓊脂15.0g和胰酪胨等量混合物10.0g1000ml葡萄糖pH使滅菌后在SOP-ZL-TY040-01微生物計(jì)數(shù)檢查法第13頁共15頁5.6.2,加

33、人瓊脂，加熱溶化后，再加入葡萄糖，搖勻，分裝，滅菌。如使用含抗生素的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，應(yīng)確認(rèn)培養(yǎng)基中所加的抗生素量不影SOP-ZL-TY040-01微生物計(jì)數(shù)檢查法第14頁共15頁響供試品中霉菌和酵母菌的生長。5.5馬鈴署葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）馬鈴薯（去皮）200g瓊脂14.0g葡萄糖20.0g水1000ml取馬鈴薯，切成小塊，加水1000ml,煮沸2030分鐘，用68層紗布過濾，取濾液補(bǔ)水至1000m l,調(diào)節(jié)pH使滅菌后在25C的pH值為5.6.2，加入瓊脂,加熱溶化后，再加入葡萄糖，勻，分裝，火菌。5.6玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基胨5.0g玫瑰紅鈉0.0133g葡萄糖10.0g瓊脂14.

34、0g磷酸二氫鉀l.Og水1000ml硫酸鎂0. 5g除 葡 萄 糖 、 玫 瑰 紅 鈉 外 ， 取 上 述 成 分 ， 混 合 ， 微 溫 溶 解 ， 加 入 葡 萄 糖 、 玫 瑰 紅 鈉 ， 搖 勻 ， 分，滅菌。5.7硫乙酵酸鹽流體培養(yǎng)基胰酪胨15.0g氯化鈉2.5g酵母浸出粉5.0g新配制的0.1%刃天青溶液1.0ml無水葡萄糖5.0gL-胱氨酸0. 5g硫乙醇酸鈉0.5g瓊脂0.75g（或硫乙醇酸）(0.3ml)水1000ml除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH為弱堿性，煮沸，濾清,加人葡萄糖和刃天青溶液，搖勻，調(diào)節(jié)pH ,使滅菌后在25C的pH值為7.1土0.

35、2。分裝至適宜的容器中，其裝量與容器高度的比例應(yīng)符合培養(yǎng)結(jié)束后培養(yǎng)基氧化層（粉紅色）不超過培養(yǎng)基深度的1/2。滅菌。在供試品接種前，培養(yǎng)基氧化層的高度不得超過培養(yǎng)基深度的1/5，否則,須經(jīng)100C水浴加熱至粉紅色消失（不超過20分鐘），迅速冷卻，只限加熱一次，并防止被污染。除另有規(guī)定外，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基置3035C培養(yǎng)。明膠胰酶水解物10.0g二水合磷酸氫二鈉8.0g牛膽鹽20.0g亮綠5mg葡萄糖5.0g水1000ml磷酸二氫鉀2.0g5.8腸道菌增菌液體培養(yǎng)基除葡萄糖、亮綠外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)p H使加熱后在25C的pH值為SOP-ZL-TY040-01微生物計(jì)數(shù)檢查法

36、第15頁共15頁7.22，加人葡萄糖、亮綠，加熱至100 C 30分鐘，立即冷卻。5.9紫紅膽鹽匍萄糖瓊脂培養(yǎng)基酵母浸出粉3 .0g中性紅30mg明膠胰酶水解物7.0g結(jié)晶紫2mg脫氧膽酸鈉1.5g瓊脂15.0g葡萄糖10.0g水1000ml氯化鈉5.0g除葡萄糖、中性紅、結(jié)晶紫、瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解,調(diào)節(jié)p H使加熱后在25C的p H值為7.42。加入匍萄糖、中性紅、結(jié)晶紫、瓊脂，加熱煮沸（不能在咼壓火菌器中加熱）。5.10麥康凱液體培養(yǎng)基明膠胰酶水解物20.0g溴甲酚紫10mg乳糖10.0g水1000ml牛膽鹽5.0g除乳糖、溴甲酚紫外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH使

37、火菌后在25C的pH值為7.3.2,加入乳糖、溴甲酚紫， 分裝，火菌。5.11麥康凱瓊脂培養(yǎng)基明膠胰酶水解物17.0g中性紅30.Omg胨5.0g結(jié)晶紫1mg乳糖10.0g瓊脂13.5g脫氧膽酸鈉1.5g水1000ml氯化鈉5.0g除乳糖、中性紅、結(jié)晶紫、瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH使火菌后在25C的pH值為7.1.2,加人乳糖、 中性紅、結(jié)晶紫、瓊脂，加熱煮沸1分鐘，并不斷振搖，分裝，火菌。5.12 RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基大豆胨4.5g六水合氯化鎂29.Og氯化鈉8.0g孔雀綠36mg磷酸氫二鉀0.4g水1000ml磷酸二氫鉀0.6g除孔雀綠外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH使滅菌后在25C的pH值為5.2.2。加人孔雀綠，分裝，滅菌，滅菌溫度不能超過115C。5.13木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基不SOP-ZL-TY040-01微生物計(jì)數(shù)檢查法第16頁共15頁酵母浸出粉3.0g氯化鈉5.OgL-賴氨酸5.0g硫代硫酸鈉6.8g木糖3.5g枸櫞