線栓法制備大鼠局灶性腦缺血模型的改進與體會

1、    線栓法制備大鼠局灶性腦缺血模型的改進與體會【摘要】  目的建立一種操作簡便、穩(wěn)定可靠的局灶性腦缺血模型。方法分別按Zealonga線栓法和改進線栓法制作局灶性大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion， MCAO)模型，并于術(shù)后24 h從神經(jīng)行為學，腦梗塞率、腦梗塞率的相對標準偏差(RSD)和模型成功率4個方面對兩種模型進行評價。結(jié)果術(shù)后存活的動物均出現(xiàn)了神經(jīng)功能缺陷癥狀，兩組動物的腦梗塞率相比沒有顯著性差異（P > 0.05），但改進組較Zea-longa組的變異度小，模型成功率高

2、（2 =4.37，P < 0.05）。結(jié)論改進法簡便可靠，模型成功率高，是較理想的MCAO模型制作方法。 【關(guān)鍵詞】  線栓法 腦缺血 模型Abstract：To establish a simple， stable and reliable model of focal cerebral ischemia. MethodsAlong with Zealonga method and modified method， the models of middle cerebral artery occlusion were created. Then after 24 h

3、 of operation， these two kinds of model were evaluated by four aspects: the neurological behavior， the cerebral infarction ratio， the relative standard deviation (RSD) of cerebral infarction ratio and the achievement ratio of model.Results All the survival rats demonstrated neurological deficit symp

4、tom after 24 h of operation. The cerebral infarction ratio between the two groups was not significant. The RSD of cerebral infarction ratio in the modified group was lower than that in the Zea-longa group while the success rate in the modified group were higher than that in the Zealonga group（2 = 4.

5、37， P < 0.05）.ConclusionThe modified method of focal cerebral ischemia model is easier to carry out and more reliable. And it is an ideal method for model of MCAO with higher success rate.Key words：Suture-occluded method； Cerebral ischemia； Model腦卒中是當今嚴重危害人類健康的一種常見病，相當于中醫(yī)上的中風病。本病可分為缺血性和出血性兩大類，其中缺

6、血性約占本病的70%1。與出血性腦卒中相比，腦缺血具有“三高一低”的特點，即高發(fā)病率、高致殘率、高復發(fā)率、低死亡率。其致殘率和程度均超過腦出血。制備一種理想的動物模型是研究該類疾病的重要手段。目前腦缺血動物模型有許多種，其中線栓法制作的局灶性腦缺血模型具有不開顱、梗塞部位較確定、缺血時間可控、可用于研究腦缺血再灌注等優(yōu)點，在國內(nèi)外得到了廣泛的采用。但是，該模型的制作難度大、死亡率高、變異度大，成為腦缺血實驗研究中的攔路虎。本實驗室參照Zea Longa的制作方法并加以改進，通過使栓線前處理一致化，減少組織分離、加強術(shù)后護理等一系列措施，簡化了實驗的手術(shù)操作過程，提高了建模成功率和穩(wěn)定性?，F(xiàn)報道

7、如下。 1 器材 1.1 動物及分組Wistar大鼠50只，雌雄各半，體重250300 g，隨機分為2組：Zea Longa方法模型組（簡稱ZL組）和改進模型組，每組25只。1.2 材料、儀器與試劑手術(shù)顯微鏡（XSO-1B型，杭州醫(yī)用光儀廠），十萬分之一天平（HM-202型，日本A&G有限公司），HHS精密電熱恒溫水浴鍋(江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠)，市售魚線，手術(shù)器械。紅四氮唑（TTC，上海華東師范大學化工廠生產(chǎn)，批號2007507），氯化鈉注射液（山東魯抗晨欣藥業(yè)，批號：070511708）。磷酸二氫鉀（天津市天新精細化工開發(fā)中心，批號20079208）， 2 實驗方法 2.1 Zea

8、Longa制作模型的方法2 栓線的制備： 原Zea Longa用的是40的單股尼龍手術(shù)線，因來源困難采用同直徑的魚線代替，將魚線的頂端燙成光滑球面作為栓線。手術(shù)過程：大鼠麻醉后，取頸部正中切口，分離頸總動脈(common carotid artery， CCA)、頸外動脈(external carotid artery， ECA)和頸內(nèi)動脈(internal carotid artery， ICA)，分離結(jié)扎并切斷ECA及其分支，結(jié)扎ICA顱外的唯一分支-翼腭動脈(pterygopalatine artery， PPA)。用動脈夾夾閉CCA和ICA，將栓線由ECA殘端進線，經(jīng)分叉處進入ICA，

9、進約18 mm稍有阻力感時即已達阻斷大腦中動脈(middle cerebral artery， MCA)的入口，即可造成MCA的栓塞。2.2 改進后的模型制作方法栓線的制備：將直徑0.235 mm的魚線剪成3 cm長的小段，將頭段靠近酒精燈的外焰，調(diào)節(jié)距離以不使魚線過熱打卷為度，加熱約10 min，在顯微鏡下篩選出頭端圓滑的魚線，酒精擦拭晾干備用。手術(shù)過程：用質(zhì)量分數(shù)為2.5%戊巴比妥鈉(0.05 g·kg-1體重)腹腔注射麻醉，仰臥位固定。頸部左側(cè)正中切口，從兩側(cè)頜下腺之間剪開淺筋膜，顯露一側(cè)胸鎖乳突肌。鈍性分離胸鎖乳突肌與胸骨舌骨肌間的肌間隙，暴露頸總動脈和迷走神經(jīng)。滴上少許利多

10、卡因，以減少對迷走神經(jīng)的刺激。手術(shù)顯微鏡下仔細分離CCA約5 mm，并于近心端結(jié)扎，僅分離ICA及ECA近分叉處一小段，能穿線即可。在ECA根部近分叉處結(jié)扎，ICA根部近分叉處打一活結(jié)。 剪斷CCA，將栓線由CCA殘端插入ICA。調(diào)整魚線頭端的方向使其略朝向腹兩側(cè)，進約18 mm稍有阻力感時應立即停止，收緊頸內(nèi)動脈的活結(jié)，如果只插進10 mm就有明顯阻力則提示誤插進了PPA。這時拔出后調(diào)整方向再插，直到正確插入。仔細清理凈手術(shù)創(chuàng)口，縫合手術(shù)切口，注射抗生素。將動物放置于溫暖環(huán)境修養(yǎng)，定時對動物進行按摩護理。2.3 檢測指標及方法2.3.1 神經(jīng)行為學評分在術(shù)后24 h參照Zea-longa的分

11、級標準進行行為學評分：0分，無神經(jīng)缺損體征；1分，不能充分屈曲右側(cè)前爪；2分，向右側(cè)轉(zhuǎn)；3分，向右側(cè)傾倒；4分，不能自發(fā)行走，意識喪失。2.3.2 腦梗塞率及穩(wěn)定性的評定兩組大鼠在術(shù)后24 h冰上斷頭取腦，-20冷凍約15 min。待其稍變硬時，用刀片將腦切成厚2 mm的冠狀切片。浸于質(zhì)量分數(shù)為2%的TTC磷酸鹽緩沖液中（pH=7.4）3，恒溫浴槽中37避光孵育約15 min，翻面繼續(xù)染15 min。正常腦組織染為深紅色，腦梗塞區(qū)不染色(蒼白色)。通過重量法測量腦的梗塞率，即：先稱取全腦的重量Tm，隨后仔細分離腦組織中梗塞部分并稱重Pm，梗塞率(%)=（Pm / Tm）×100%，并

12、 計算 出相對標準偏差（RSD）。2.3.3 模型成功率的計算 將存活的動物進行TTC腦片染色，如果出現(xiàn)梗死灶則視為模型成功。模型成功率(%)=成功動物數(shù)/該組動物總數(shù)×100%. 2.3.4 統(tǒng)計學處理兩組間腦梗塞率的比較采用t檢驗，模型成功率的比較采用2檢驗。 3 結(jié)果 3.1 神經(jīng)功能評估和術(shù)后存活情況 兩組動物在術(shù)后均出現(xiàn)了神經(jīng)功能缺陷癥狀。在術(shù)后24 h內(nèi)，ZL組共有12只動物死亡，其中6只死于呼吸困難，4只死于顱內(nèi)血管刺破出血，1只死于失血過多，1只死于梗塞面積過大；改進組中共有5只死亡，其中3只死于顱內(nèi)出血，2只死于呼吸困難。3.2 腦梗死率及穩(wěn)定性的評定所有動物均出現(xiàn)

13、了梗塞灶，ZL對照組和改進組的腦梗塞率分別為(22.39±9.82)%和(21.18±5.65)%，兩組相比沒有顯著性差異（P > 0.05）。兩組的RSD分別為43.86%和26.68%，提示改進組較ZL組腦梗塞率穩(wěn)定。3.3 模型成功率的比較 如表所示，改進組的模型成功率高于ZL組（2 = 4.37， P =0.037）。表1 兩組實驗動物模型成功率的比較（略）2=4.37， P0.05;n=25 4 討論 4.1 動物的體重的選擇要適當在預實驗發(fā)現(xiàn)，體重越小，死亡率越高。180 g以下的大鼠死亡率可達70%，而350 g以上的大鼠死亡率則在10%以下，但是體重過

14、大的大鼠由于血管變粗，模型成功率并不高。本實驗選擇體重在250300 的大鼠，發(fā)現(xiàn)獲得的模型成功率較理想（80%）。4.2 栓線的質(zhì)量很重要 栓線的前端須光滑，否則易刺破血管造成顱內(nèi)出血。Zea Longa將栓線頭端燒制成球狀，但其直徑不易控制，很難到達一致，因而影響模型的穩(wěn)定性和重復性。我們將栓線頭端在高溫處烤光滑而不燒成球狀，大小均勻，既不易刺破血管又可減小變異度。4.3 采取頸左側(cè)切口出血較頸正中切口少，手術(shù)視野暴露充分。4.4 滴上少許利多卡因可以減輕對迷走神經(jīng)和氣管的刺激。4.5 從CCA進線，結(jié)扎ECA近分叉處的根部Zea Longa從ECA殘端進線，這種方法需要分離出一定長度的E

15、CA，并要切斷ECA及其分支的血流，結(jié)果會造成同側(cè)ECA供血區(qū)的缺血4，導致血液濃縮、腦組織微循環(huán)功能下降、動物活動次數(shù)減少5。 在改進的模型中，只結(jié)扎ECA近分叉的根部，這樣既可減少手術(shù)操作損傷，節(jié)省操作時間，又可通過周圍血管吻合支途徑在一定程度上補償ECA供血區(qū)的缺血，減輕ECA缺血造成的損傷，提高了動物的存活率。4.6 不分離PPA PPA是頸內(nèi)動脈在顱外的惟一分支，插線過程中非常容易誤插進去。許多人主張分離或結(jié)扎PPA。但該分支的位置深，結(jié)扎PPA非常困難，操作過程對組織的損傷很大。我們的改進方法不分離PPA，只通過調(diào)整插線方向即可順利地插進顱內(nèi)，這樣既減少了組織的損傷，又節(jié)省了手術(shù)時

16、間。4.7 術(shù)后圍手術(shù)期間的護理極其重要動物在術(shù)后48 h內(nèi)的死亡率最高，如果能度過這段危險期則多能長期存活。術(shù)后采取了以下護理措施：將動物安置在溫暖的環(huán)境中（24左右），左手托起動物，右手的四指指腹循順時針方向輕撫動物腹部，每次進行10 min。隨后用手指拿捏動物的足掌，用拇指揉搓動物的足掌至微發(fā)熱。如果術(shù)中失血較多可灌胃2 ml左右的溫生理鹽水，術(shù)后大鼠的吞咽反射差，要注意不要灌到氣管里。每隔2 h做1次護理，護理23次后可以視動物狀況適當延長護理間隔時間。經(jīng)過上述改進，建模成功率達到了80%，模型更為穩(wěn)定，且所需材料常見易得。由于簡化了手術(shù)操作步驟，一般30 min內(nèi)即可完成一只模型。本

17、實驗表明，改進的模型是成功的，值得推廣。【 參考  文獻 】 1 李 忠缺血性腦血管疾病，第1版M. 北京:北京 科學 技術(shù)出版社，2002:2.2 Zea-longa EL， Weinstein PR， Carlson S .et a1.Reversible Middle Cerebral Artery Occlusion without Craniectomy in Rats J.Stroke，1989，20(1):84.3 國家藥典委員會 中國 藥典，部S. 北京:化學 工業(yè) 出版社，2005: 158.4 Dittmar M， Spruss T，Schuierer G，et al. External Carotid Artery Territory Ischemia Impairs Outcome in the Endovascular Filament Model