《儀器分析》學(xué)生實驗：NBS-熒光素-CTAC化學(xué)發(fā)光體系測定尿素的含量

1、整理ppt儀器分析儀器分析學(xué)生實驗課件學(xué)生實驗課件NBS-NBS-熒光素?zé)晒馑?CTAC-CTAC化學(xué)發(fā)光體系化學(xué)發(fā)光體系測定尿素的含量測定尿素的含量 20102010年秋期年秋期整理ppt目目 錄錄 一、概述一、概述 二實驗的目的意義和要求二實驗的目的意義和要求 三、實驗原理三、實驗原理 1.1.實驗裝置示意圖實驗裝置示意圖 2.2.化學(xué)發(fā)光原理化學(xué)發(fā)光原理 四、儀器藥品四、儀器藥品 1 1主要儀器主要儀器 2 2主要藥品及儲備液配制主要藥品及儲備液配制 五、實驗內(nèi)容及操作步驟五、實驗內(nèi)容及操作步驟 1.1.實驗的主要內(nèi)容實驗的主要內(nèi)容 2.2.實驗操作步驟實驗操作步驟 六、數(shù)據(jù)處理六、數(shù)據(jù)

2、處理 七、思考題七、思考題整理ppt一、概述一、概述 1.化學(xué)發(fā)光及化學(xué)發(fā)光分析化學(xué)發(fā)光及化學(xué)發(fā)光分析 化學(xué)發(fā)光（Chemiluminescence）又稱為冷光（Cold Light），是在沒有任何光、熱或電場等激發(fā)的情況下，由化學(xué)反應(yīng)而產(chǎn)生的光輻射。 生命系統(tǒng)中的化學(xué)發(fā)光，稱為生物發(fā)光（Bioluminescence），它不依賴于有機體對光的吸收，而是一種特殊類型的化學(xué)發(fā)光。 化學(xué)發(fā)光分析（Chemiluminescence Analysis）就是利用化學(xué)反應(yīng)所產(chǎn)生的發(fā)光現(xiàn)象進行分析的方法。 是近30多年來發(fā)展起來的一種新型、高靈敏度的痕量分析方法。在痕量分析、環(huán)境科學(xué)、生命科學(xué)及臨床醫(yī)學(xué)、

3、食品安全等領(lǐng)域得到愈來愈廣泛的應(yīng)用。 整理ppt生物化學(xué)發(fā)光圖生物化學(xué)發(fā)光圖整理ppt2.2.化學(xué)發(fā)光分析的基本原理化學(xué)發(fā)光分析的基本原理化學(xué)發(fā)光是吸收化學(xué)反應(yīng)過程產(chǎn)生的化學(xué)能，使反應(yīng)產(chǎn)物分子或者其它物質(zhì)分子被激發(fā)而發(fā)射的光輻射。任何一個化學(xué)發(fā)光反應(yīng)都應(yīng)包括化學(xué)激發(fā)和發(fā)光兩個步驟，必須滿足如下條件：（1）化學(xué)反應(yīng)必須提供足夠的激發(fā)能，激發(fā)能主要來源 于反應(yīng)焓。（2）要有有利的化學(xué)反應(yīng)歷程，使化學(xué)反應(yīng)的能量至少 能被一種物質(zhì)所接受并生成激發(fā)態(tài)。（3）激發(fā)態(tài)能釋放光子或能夠轉(zhuǎn)移它的能量給另一個分 子，而使該分子激發(fā)，然后以輻射光子的形式回到基態(tài)。化學(xué)發(fā)光反應(yīng)效率cl，又稱化學(xué)發(fā)光的總量子產(chǎn)率，決定

4、于生成激發(fā)態(tài)產(chǎn)物分子的化學(xué)激發(fā)效率ce和激發(fā)態(tài)分子的發(fā)射效率em。定義為： clcl = =發(fā)射光子的分子數(shù)發(fā)射光子的分子數(shù)/ /參加反應(yīng)的分子數(shù)參加反應(yīng)的分子數(shù) = = cece emem整理ppt3.3.化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的類型化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的類型3.1 3.1 直接化學(xué)發(fā)光和間接化學(xué)發(fā)光直接化學(xué)發(fā)光和間接化學(xué)發(fā)光直接發(fā)光直接發(fā)光是被測物作為反應(yīng)物直接參加化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，生成電子激發(fā)態(tài)產(chǎn)物分子，此初始激發(fā)態(tài)能輻射光子。 A + B C* + D C* C + h式中A或B是被測物，通過反應(yīng)生成電子激發(fā)態(tài)產(chǎn)物C* ，當C* 躍遷回基態(tài)時，輻射光子。整理ppt間接發(fā)光間接發(fā)光是被測物A或B，通過化學(xué)反應(yīng)

5、生成初始激發(fā)態(tài)產(chǎn)物C* ， C* 不直接發(fā)光，而是將其能量轉(zhuǎn)移給F，使F躍遷回基態(tài)，產(chǎn)生發(fā)光。 A + B C* + D C* + F F* + E F* F + h式中C*為能量給予體，而F為能量接受體3.2 3.2 氣相化學(xué)發(fā)光、液相和固相化學(xué)發(fā)光氣相化學(xué)發(fā)光、液相和固相化學(xué)發(fā)光按反應(yīng)體系的狀態(tài)分類，如化學(xué)發(fā)光反應(yīng)在氣相中進行稱為氣相化學(xué)發(fā)光；在液相或固相中進行稱為液相或固相化學(xué)發(fā)光；在兩個不同相中進行則稱為異相化學(xué)發(fā)光。（1 1）氣相化學(xué)發(fā)光）氣相化學(xué)發(fā)光主要有O3、NO、S的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，可用于監(jiān)測空氣中的O3、NO、SO2、H2S、CO、NO2等。（2 2）液相化學(xué)發(fā)光）液相化學(xué)發(fā)光

6、用于此類化學(xué)發(fā)光分析的發(fā)光物質(zhì)有魯米諾、光澤精等。整理ppt 3.3 化學(xué)發(fā)光、生物化學(xué)發(fā)光和電致化學(xué)發(fā)光分析法 根據(jù)供能反應(yīng)的特點，可將化學(xué)發(fā)光分析法分為： 1）普通化學(xué)發(fā)光分析法(供能反應(yīng)為一般化學(xué)反應(yīng)；簡稱CL)； 2）生物化學(xué)發(fā)光分析法(供能反應(yīng)為生物化學(xué)反應(yīng)；簡稱BCL)； 3）電致化學(xué)發(fā)光分析法(供能反應(yīng)為電化學(xué)反應(yīng)，簡稱ECL)等。整理ppt 3.4 直接測定、偶合反應(yīng)、時間分辯和酶免疫化學(xué)發(fā)光分析法 根據(jù)測定方法的不同又可分為： 1)直接測定 CL分析法； 2)偶合反應(yīng)CL分析法(通過反應(yīng)的偶合，測定體系中某一組份)； 3)時間分辨CL分析法(即利用多組份對同一化學(xué)發(fā)光反應(yīng)影響

7、的時間差實現(xiàn)多組份測定)； 4)酶免疫CL分析法等。整理ppt4. 化學(xué)發(fā)光的測量裝置化學(xué)發(fā)光的測量裝置化學(xué)發(fā)光分析法的測量儀器主要包括 樣品室、光檢測器、樣品室、光檢測器、放大器和信號輸出裝置。放大器和信號輸出裝置?；瘜W(xué)發(fā)光反應(yīng)在樣品室中進行，樣品和試劑混合的方式有不連續(xù)取樣體系不連續(xù)取樣體系，加樣是間歇的。將試劑先加到光電倍增管前面的反應(yīng)池內(nèi)，然后用進樣器加入分析物。另一種方法是連續(xù)流動體系連續(xù)流動體系，反應(yīng)試劑和分析物是定時在樣品池中匯合反應(yīng)，且在載流推動下向前移動，被檢測的光信號只是整個發(fā)光動力學(xué)曲線的一部分，以峰高進行定量測量。按照進樣方式，可將化學(xué)發(fā)光分析儀分為分離取樣式和流動注射

8、式兩類。整理pptBPCLBPCL型微弱發(fā)光測量儀型微弱發(fā)光測量儀 整理pptIFFM-DIFFM-D型流動注射化學(xué)發(fā)光分析儀型流動注射化學(xué)發(fā)光分析儀整理ppt5.5.流動注射分析介紹流動注射分析介紹 流動注射分析是70年代中期誕生并迅速發(fā)展起來的溶液自動在線處理及測定的現(xiàn)代分析技術(shù)。 流動注射分析方法主要有： 流動注射分光光度法、 流動注射原子光譜法、 流動注射電化學(xué)分析法、 流動注射酶分析法、 流動注射熒光及化學(xué)發(fā)光法、 流動注射免疫分析法、 流動注射在線分離濃集、在線消解等操作方法和技術(shù)。 整理ppt流動注射法具有以下優(yōu)點流動注射法具有以下優(yōu)點 測量在動態(tài)條件下進行，反應(yīng)條件和分析操作能

9、自動保持一致，結(jié)果重現(xiàn)性好; 耗樣量少、分析速度快，特別適合于大批量樣品分析； 不僅易于實現(xiàn)連續(xù)自動分析，且可方便地用于比色、離子電極、原子吸收分析。 整理ppt6.6.流動注射化學(xué)發(fā)光分析儀簡介流動注射化學(xué)發(fā)光分析儀簡介 IFFM-E型流動注射化學(xué)發(fā)光分析儀是國內(nèi)最早推出的全自動化學(xué)發(fā)光檢測分析系統(tǒng)。 儀器集成了高精度雙蠕動泵數(shù)控寬調(diào)速流動注射進樣系統(tǒng)，多功能超微弱化學(xué)發(fā)光檢測器及功能強大的化學(xué)發(fā)光檢測與數(shù)據(jù)采集及化學(xué)分析動力學(xué)譜圖分析軟件。 可進行靜態(tài)注射化學(xué)發(fā)光分析、流動注射化學(xué)發(fā)光等分析。 整理ppt7.7.尿素及其分析方法尿素及其分析方法 尿素，又稱為脲，其作用與山梨醇基本相同，為滲

10、透性利尿藥。 臨床用于腦水腫、顱內(nèi)壓增高、青光眼，燒傷、創(chuàng)傷和術(shù)后的尿少癥，外用可治療某些皮膚病。 尿液和血清尿素氮的測定，對急性腎功能衰竭，尤其是尿毒癥的診斷有特殊價值，其增高程度與病情的嚴重性成正比，對判斷病情和預(yù)后的估價有重要作用。 建立快速、準確、靈敏的尿素測定方法，在藥物分析、臨床治療、醫(yī)學(xué)診斷等方面有重要的意義。 測定尿素的方法主要有：生物傳感器法，紫外/可見法，HPLC法等。 整理ppt 在堿性條件下，熒光素作為能量轉(zhuǎn)移劑， NBS氧化尿素產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光， 十六烷基三甲基氯化銨（CTAC）對該體系具有強烈的增敏作用， 據(jù)此建立NBS-熒光素-CTAC流動注射化學(xué)發(fā)光體系測定尿素的分

11、析方法。 具有更寬的線性范圍和更低的檢出限。測定的線性范圍為：310-5710-8g/mL，方法的相對標準偏差（RSD）為4.6%(510-8g/mL，n=11）,檢出限（3）為3.010-9g/mL。 本法可用于人體尿液中尿素含量的測定。 整理ppt二實驗的目的意義和要求二實驗的目的意義和要求 1.鞏固化學(xué)發(fā)光分析法理論知識。 2.了解流動注射化學(xué)發(fā)光分析儀的結(jié)構(gòu)，掌握儀器操作、化學(xué)發(fā)光實驗原理。 3.掌握化學(xué)發(fā)光實驗條件優(yōu)化的操作步驟，建立流動注射化學(xué)發(fā)光分析法。整理ppt三、實驗原理三、實驗原理 1.1.實驗裝置示意圖實驗裝置示意圖 P1,P2.蠕動泵；V.八通閥；F.流通池；PMT.光

12、電倍增管；HV.負高壓；PC.計算機控制的化學(xué)發(fā)光分析儀。 A.樣品，B.NBS，C.熒光素NaOHCTAC溶液。整理ppt 2.2.化學(xué)發(fā)光原理化學(xué)發(fā)光原理 堿性條件下，NBS的氧化性來自其水解產(chǎn)物HBrO，其氧化特性類似于HBrO，但較HBrO穩(wěn)定。 尿素分子中含有還原性的胺基（-NH2），可被HBrO氧化，產(chǎn)生的化學(xué)能激發(fā)共存的熒光素，從而產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。 可能的反應(yīng)機理如下： NBS H2O NHS HBrO 即 尿素 HBrO OH- 產(chǎn)物* 產(chǎn)物* 熒光素 熒光素* 產(chǎn)物 熒光素* 熒光素 h整理ppt四、儀器藥品四、儀器藥品 1主要儀器主要儀器 IFFMD型流動注射化學(xué)發(fā)光分析儀（

13、西安瑞邁電子科技有限公司生產(chǎn)）； 離心機（04000r/min，常州國華電器有限公司生產(chǎn)）； 電子分析天平（EL104，梅特勒-托利多（上海）有限公司）。 2主要藥品及儲備液配制主要藥品及儲備液配制整理ppt五、實驗內(nèi)容及操作步驟五、實驗內(nèi)容及操作步驟 1.實驗的主要內(nèi)容實驗的主要內(nèi)容 1.1樣品稀釋的酸堿性選擇實驗 鹽酸、硫酸、氫氧化鈉、碳酸氫鈉，水稀釋作對照，濃度為0.05 mol/L。 1.2熒光物質(zhì)種類的選擇實驗 羅丹明-6G、熒光素鈉、熒光素、二氯熒光素，水稀釋作對照，濃度為810-5 mol/L。 1.3熒光物質(zhì)濃度的選擇實驗 熒光素濃度在110-6810-4 mol/L范圍內(nèi)選擇

14、。 1.4反應(yīng)介質(zhì)的種類選擇實驗 氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸氫鈉，水稀釋作對照，濃度為0.05 mol/L。整理ppt 1.5反應(yīng)介質(zhì)的濃度選擇實驗 考察熒光素中氫氧化鈉在0.03-0.50 mol/L濃度范圍內(nèi)對化學(xué)發(fā)光信號強度的影響。 1.6表面活性劑的種類選擇實驗 十二烷基苯磺酸鈉（SDBS）、吐溫80、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、十六烷基三甲基氯化銨（CTAC），水稀釋作對照，濃度為310-3 mol/L。 1.7表面活性劑的濃度選擇實驗 考察CTAC物質(zhì)的量濃度在510-4710-3 mol/L范圍內(nèi)對化學(xué)發(fā)光信號強度的影響。 1.8 NBS濃度的選擇實驗 實驗考察NBS物質(zhì)的量

15、濃度在0.0080.03 mol/L濃度范圍內(nèi)對化學(xué)發(fā)光體系的影響。整理ppt 2.2.實驗操作步驟實驗操作步驟 2.1化學(xué)發(fā)光儀的使用 A連接好蠕動泵、化學(xué)發(fā)光儀主機、分離式檢測器、計算機主機及打印機電源線、信號線和聚四氟乙烯管路系統(tǒng)，仔細檢查管線連接無誤。 B打開總電源開關(guān)，啟動化學(xué)發(fā)光儀主機電源、打印機電源、蠕動泵電源，再按下計算機電源啟動電腦，點擊IFFM分析系統(tǒng)，啟動分析應(yīng)用軟化程序，進入主界面。 C編輯或者打開參數(shù)文件。 D所配制的各種溶液插入聚四氟乙烯管。 E點擊啟動測量按鈕，儀器開始測量過程，根據(jù)需要調(diào)整測量時間、主副泵轉(zhuǎn)速，根據(jù)信號大小調(diào)整負高壓及增益。 F測量完畢，用蒸餾水洗滌各流路，洗滌時間不少于5分鐘，抽干5分鐘，松開蠕動泵。 G保存用戶文件，關(guān)閉應(yīng)用程序。運行計算機系統(tǒng)退出程序，關(guān)閉各儀器電源，最后關(guān)閉總電源開關(guān)。 整理ppt 2.2樣品處理 取健康人體的新鮮尿液50 mL， 用移液管移取10.0 mL， 以3500r/min的轉(zhuǎn)速進行離心處理10min，取上層清液0.25