一株高效解磷真菌的篩選及其解磷機(jī)理研究

1、    一株高效解磷真菌的篩選及其解磷機(jī)理研究    王偉偉摘要 為提高土壤中磷肥利用率，從耐貧瘠作物火龍果根際分離到一株具有高效解磷功能的真菌，命名為an-6，并對(duì)其解磷機(jī)理進(jìn)行研究。在以ca3（po）為唯一磷源的無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基中接種該菌株，培養(yǎng)96h后，可溶性磷含量達(dá)到764.4mg/l，且可溶性磷含量與發(fā)酵液ph呈極顯著負(fù)相關(guān)。通過(guò)高效液相色譜分析，發(fā)酵液中含有大量乙酸以及少量檸檬酸、草酸、酒石酸等酸性物質(zhì)，這可能是該真菌具有高效解磷功能的原因之一。經(jīng)形態(tài)學(xué)以及分子鑒定，初步確定該菌株為黑曲霉（aspergillus niger）。土壤接菌實(shí)驗(yàn)表

2、明，an-6可明顯增加土壤中有效磷含量，有望開(kāi)發(fā)為微生物磷肥。關(guān)鍵詞 解磷真菌;篩選;解磷機(jī)理;微生物磷肥中圖分類(lèi)號(hào) s154.3 a磷是植物生長(zhǎng)中必不可少的營(yíng)養(yǎng)元素之一，參與植物體內(nèi)多種代謝活動(dòng)。然而，土壤中磷的難溶性和難移動(dòng)性，導(dǎo)致有效磷含量低，只占土壤中總磷含量的1%5%，限制了植物的生長(zhǎng)發(fā)育1。長(zhǎng)期以來(lái)，人們通過(guò)施用化學(xué)磷肥來(lái)滿足作物對(duì)磷的需求。長(zhǎng)期施用磷肥，導(dǎo)致土壤板結(jié)、水體污染等環(huán)境問(wèn)題2;另一方面，磷礦資源開(kāi)發(fā)利用粗放，造成資源浪費(fèi)。據(jù)估計(jì)，我國(guó)磷礦資源開(kāi)采僅能維持到20502060年3。因而，如何將土壤中難溶性磷轉(zhuǎn)化為可溶性磷，提高土壤中磷的利用率是目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上迫切需要解決的

3、問(wèn)題。土壤中含有多種微生物，可以使土壤中難溶性磷轉(zhuǎn)化為可溶性磷，這些微生物被稱(chēng)作解磷菌或溶磷菌。此類(lèi)微生物種類(lèi)繁多，包括細(xì)菌、放線菌、真菌等12，尤其是真菌，其解磷效果是解磷細(xì)菌的幾倍甚至更多，而且遺傳性狀更穩(wěn)定4，近年來(lái)受到廣泛關(guān)注。本研究從耐貧瘠作物火龍果根際分離到一株解磷真菌，解磷效果良好，有望開(kāi)發(fā)為解磷菌菌劑，增加土壤中有效磷含量，減少磷肥的施用量。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 土壤樣品植物根際是解磷菌在土壤中的主要存在部位5-6，故用于解磷真菌分離的土壤樣品采自海南大學(xué)檐州校區(qū)農(nóng)科試驗(yàn)基地火龍果園表層以下510cm火龍果根際，取后放置在實(shí)驗(yàn)室晾干備用。另外，取有效磷含量較低的

4、土壤供試解磷真菌解磷效果驗(yàn)證，該土壤有效磷含量為4.13mg/kg，全磷含量為967.97mg/kg。1.1.2 培養(yǎng)基無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基4：葡萄-10g，（nh4）2so40.5g，nacl 0.3g，kcl 0.3g， mgso4.7h2o0.3g，feso4.7h2o0.03g， mnso4.7h2o0.03g，ca3（po4）25g，蒸餾水1000ml，調(diào)ph至7.07.5，分裝，每瓶100ml，于121高壓滅菌15min。無(wú)機(jī)磷固體培養(yǎng)基：在無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加瓊脂粉2%，于121高壓滅菌15min。解磷真菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米秸稈25g，麩皮25g，（nh4）2so40.5g，m

5、gso40.125g，kh2po40.125g，加水50ml，裝于1000ml，三角瓶中，121高壓滅菌30min。1.2 方法1.2.1 解磷真菌的分離及初篩將試驗(yàn)基地采回的土樣晾干并研磨，過(guò)20目篩備用。稱(chēng)取10g研磨處理的土樣于90ml的無(wú)菌水中，于28搖床中振蕩培養(yǎng)30min，轉(zhuǎn)速為150r/min。吸取1ml土壤懸浮液按照10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的梯度進(jìn)行稀釋?zhuān)瑢?duì)最后3個(gè)稀釋濃度各取200l涂布于加有100g/ml硫酸鏈霉素的無(wú)機(jī)磷固體培養(yǎng)基上，每個(gè)濃度3次重復(fù)，置于28的恒溫箱中培養(yǎng)7。用無(wú)菌接種針挑取具有較大透明圈的單菌落轉(zhuǎn)至pda培養(yǎng)基上進(jìn)行純化，并于4

6、冰箱保存?zhèn)溆?。用打孔器取解磷真菌菌落邊緣菌塊，接種在無(wú)機(jī)磷固體培養(yǎng)基中央，于28恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周，測(cè)量菌落直徑（d）以及解磷圈直徑（d），并計(jì)算比值d/d，通過(guò)該比值的大小對(duì)分離到的解磷真菌進(jìn)行初篩。1.2.2 解磷真菌的復(fù)篩將初篩獲得的解磷真菌接種于pda培養(yǎng)基上，28培養(yǎng)培養(yǎng)7d后收集分生孢子，并利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。將收集的分生孢子接種在100ml，無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基中，調(diào)整濃度至105個(gè)/ml，于28搖床中震蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速200r/min，7個(gè)重復(fù)。每天定時(shí)取樣，每次取1瓶，測(cè)定發(fā)酵液ph，然后5000r/min離心10min后取上清，用鉬銻抗比色法測(cè)定可溶性磷的含量8。1.2.3 解磷

7、真菌的分子鑒定解磷真菌活化后收集菌絲100mg，利用天根一植物基因組dna提取試劑盒提取gdna，以引物對(duì)its1（tccgtaggtgaacctgcgg）和its4（tcctccgcttattgatatgc）為引物9，擴(kuò)增rdna-its序列，回收后送生工測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)。1.2.4 發(fā)酵液中有機(jī)酸種類(lèi)的測(cè)定將第6天發(fā)酵液離心后獲得的上清經(jīng)0.45m微孔濾膜過(guò)濾，利用高效液相色譜分析其中有機(jī)酸的種類(lèi)及含量10。1.2.5 解磷真菌對(duì)土壤解磷效果驗(yàn)證參照1.2.2中方法收集解磷真菌分生孢子，并將收集的分生孢子接種在100ml， pd培養(yǎng)基中，調(diào)整分生孢子濃度至105個(gè)

8、/ml，于28搖床中振蕩培養(yǎng)（轉(zhuǎn)速200r/min），制備種子液。24h后取5ml，種子液并加無(wú)菌水至50ml，加入固體發(fā)酵培養(yǎng)基中搖勻，于28培養(yǎng)。一周后，將真菌固體發(fā)酵產(chǎn)物按質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、5%、10%（濕重）加入經(jīng)高溫滅菌的低有效磷土壤中混勻，裝于營(yíng)養(yǎng)缽中，每個(gè)營(yíng)養(yǎng)缽400g，以不加菌土壤作為對(duì)照，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。將營(yíng)養(yǎng)缽放置于28，期間要保持土壤濕度。15d后將土壤自然風(fēng)干，然后研磨過(guò)20目標(biāo)準(zhǔn)篩，利用鉬銻抗比色法測(cè)定土壤中有效磷含量。2 結(jié)果與分析2.1 an-6具有較強(qiáng)的解磷效果通過(guò)初篩，從火龍果根際土壤中分離純化到一株具有解磷效果的真菌，命名為an-6。其菌落形態(tài)見(jiàn)圖1-a，菌落

9、中間黑色，邊緣白色;光學(xué)顯微鏡觀察菌絲為有隔菌絲，分生孢子梗頂端球狀，分生孢子橢圓形。該菌株在無(wú)機(jī)磷固體培養(yǎng)基上具有明顯的解磷圈（圖1-b），解磷圈與菌落直徑比值（d/d）為1.38（表1），表明該菌株具有較強(qiáng)的解磷能力。將供試解磷真菌an-6接種在含有難溶性無(wú)機(jī)磷的液體培養(yǎng)基中，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵液變得澄清（圖2），可溶性磷含量逐漸增加，且在048h內(nèi)增速較快（圖3），在48h之后增速趨于平緩，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到96h時(shí)，培養(yǎng)液中的可溶性磷含量達(dá)到最高值764.4mg/l，隨后又有所下降，但降幅趨于穩(wěn)定，可能是菌株開(kāi)始衰老的結(jié)果，也可能是真菌將無(wú)機(jī)磷轉(zhuǎn)化成為自身結(jié)構(gòu)磷的結(jié)果。以上證明該真菌

10、具有溶解難溶性磷的能力。2.2 an-6解磷解磷機(jī)理初探通過(guò)定時(shí)測(cè)定上述發(fā)酵液ph，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液ph逐漸降低（圖3），且與可溶性磷含量呈極顯著線性負(fù)相關(guān)，其線性方程為y=-229.2x+1275.4（r=-0.986，p<0.01）。解磷菌an-6的解磷能力可能是由于向周?chē)h(huán)境分泌有機(jī)酸，從而降低了發(fā)酵液的ph。通過(guò)高效液相色譜技術(shù)對(duì)解磷真菌an-6第6天發(fā)酵液中有機(jī)酸成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中含有較多的乙酸和檸檬酸，濃度分別為1041.6mg/kg和63.6mg/kg，另外還有少量草酸和酒石酸（表2）。這些有機(jī)酸的分泌是發(fā)酵液中ph降低的主要原因，也是不溶性磷被溶解的原因之一。2.3 解

11、磷真菌an-6的分子鑒定將獲得的rdna-its序列（pcr電泳見(jiàn)圖4）在ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該序列與黑曲霉（aspergillus niger）同源性達(dá)99%，結(jié)合菌落形態(tài)（圖1-a）以及顯微觀察，確定該菌為黑曲霉。2.4 an-6對(duì)土壤解磷效果解磷真菌an-6固體發(fā)酵物接種在有效磷含量比較低的土壤中，15d后測(cè)定有效磷含量。土壤中解磷真菌含量為1%（濕重，下同）時(shí)，解磷效果只有1.42%，當(dāng)真菌含量增加到10%時(shí)，解磷效果增加到10.33%（表3）。土壤中解磷真菌含量越多，有效磷含量越多，說(shuō)明真菌an-6在土壤中具有一定解磷效果，有望開(kāi)發(fā)為解磷菌劑。3 結(jié)論與討論火龍果是一種耐鹽堿、

12、耐貧瘠的熱帶、亞熱帶農(nóng)作物，適應(yīng)性極強(qiáng)，在多種生態(tài)環(huán)境下均可成功種植。為了提高土壤中磷的利用率，本研究對(duì)火龍果根際微生物進(jìn)行篩選，通過(guò)解磷圈（d/d）測(cè)定分析，獲得一株具有較強(qiáng)解磷能力的真菌，命名為an-6，經(jīng)形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定，初步確定為黑曲霉。在以無(wú)機(jī)磷la3（po4）2為唯一磷源的液體培養(yǎng)基中，an-6對(duì)不溶性磷酸三鈣具有強(qiáng)的溶解效果，培養(yǎng)96h后，培養(yǎng)液中的可溶性磷含量達(dá)到最高值764.4mg/l。難溶性無(wú)機(jī)磷占土壤磷總量的大多數(shù)11，解磷微生物降解難溶性無(wú)機(jī)磷的機(jī)理很復(fù)雜，其中最普遍、也最被廣泛接受的是有機(jī)酸理論13-14。本文對(duì)an-6的解磷機(jī)理進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液中可溶

13、性磷含量與溶液ph呈顯著負(fù)相關(guān)（p<0.01），并經(jīng)高效液相色譜分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液中含有大量乙酸以及少量檸檬酸、草酸、酒石酸等酸性物質(zhì)，這可能是an-6具有解磷功能的原因之一。本文對(duì)an-6在土壤中的解磷能力進(jìn)行了試驗(yàn)，將該解磷真菌的固體發(fā)酵物與土壤混合，經(jīng)培養(yǎng)，該真菌可明顯增加土壤中有效磷含量，說(shuō)明an-6具有開(kāi)發(fā)為微生物磷肥的潛能。關(guān)于解磷真菌an-6的解磷機(jī)理、在植物根際的溶磷機(jī)制及其發(fā)酵工藝、制劑配方等還需進(jìn)一步深入探究，以為其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中推廣利用提供理論指導(dǎo)。參考文獻(xiàn)1李露莉，邱樹(shù)毅.解磷真菌的研究進(jìn)展j.貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（7）：125-128.2魏自民，王世平，席北

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