不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳實用教案

1、第1頁/共32頁第一頁，共33頁。第2頁/共32頁第二頁，共33頁。實驗分組（每人做一管實驗分組（每人做一管(y un)，每組配一份膠），每組配一份膠） 認清試劑（試劑和吸管對號、量器的使用）認清試劑（試劑和吸管對號、量器的使用） 封管封管 分離膠配制與灌膠（濃度為分離膠配制與灌膠（濃度為6%，化學聚合，每組總體積為，化學聚合，每組總體積為10ml，灌膠高度為，灌膠高度為78cm）封正丁醇封正丁醇3mm（手法、高度、觀察界面變化和判斷凝固、（手法、高度、觀察界面變化和判斷凝固、時間掌握時間掌握25min）第3頁/共32頁第三頁，共33頁。第4頁/共32頁第四頁，共33頁。第5頁/共32頁第五頁

2、，共33頁。管固定于電泳槽上（豎直，防漏）5、加電極緩沖液（注意液面）第6頁/共32頁第六頁，共33頁。第7頁/共32頁第七頁，共33頁。第8頁/共32頁第八頁，共33頁。第9頁/共32頁第九頁，共33頁。第10頁/共32頁第十頁，共33頁。第11頁/共32頁第十一頁，共33頁。第12頁/共32頁第十二頁，共33頁。第13頁/共32頁第十三頁，共33頁。原原 理理聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(acrylamide(acrylamide，簡稱，簡稱Acr)Acr)和交聯(lián)劑和交聯(lián)劑N,N-N,N-甲甲叉雙丙烯酰胺叉雙丙烯酰胺(N(N，Nmethylene-bisac

3、ylamideNmethylene-bisacylamide，簡稱，簡稱Bis)Bis)在加速劑在加速劑N N，N N，N N，N N四甲基乙二胺四甲基乙二胺(N(N，N N，N N，N Ntetramethyl ethylenedia minetetramethyl ethylenedia mine，簡稱，簡稱TEMED)TEMED)和催化劑過硫酸銨和催化劑過硫酸銨(ammonium persulfate (NH4)2S2O8(ammonium persulfate (NH4)2S2O8，簡稱，簡稱AP)AP)或核黃素或核黃素(ribofavin(ribofavin即即vita min B2

4、vita min B2，C17H20O6N4)C17H20O6N4)的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結構的凝的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結構的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳膠，以此凝膠為支持物的電泳(din yn)(din yn)稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(din (din yn)(polyacrylamide gel electrophoresisyn)(polyacrylamide gel electrophoresis，簡稱，簡稱PAGE)PAGE)。第14頁/共32頁第十四頁，共33頁。聚丙烯酰胺凝膠有下列特性：(1)在一定濃度時，凝膠透明，有彈性，機械性能好；(2)化學(hu

5、xu)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(huxu)反應，在很多溶劑中不溶；(3)對pH和溫度變化較穩(wěn)定；(4)幾乎無吸附和電滲作用，只要Acr純度高，操作條件一致，則樣品分離重復性好；(5)樣品不易擴散，且用量少，其靈敏度可達10-6g(6)凝膠孔徑可調(diào)節(jié)，根據(jù)被分離物的分子量選擇合適的濃度，通過改變單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)凝膠的孔徑；(7)分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應為一體。因而較醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖電泳等有更高的分辨率。第15頁/共32頁第十五頁，共33頁。凝膠濃度(T)的選擇與被分離物質分子量密切相關。 分子量范圍與凝膠濃度的關系(gun x) 分子量范圍 適

6、用的凝膠濃度/(%) 蛋 白 質 104 20-30 1-4104 15-20 1-5104-1105 10-15 1105 5-10 5105 2-5 核酸(RNA) 104 1520 104105 5-10 105-2106 2-2.6第16頁/共32頁第十六頁，共33頁。 聚丙烯酰胺凝膠電泳分為連續(xù)系統(tǒng)與不連續(xù)系統(tǒng)兩大類。 目前常用的多為圓盤(yun pn)電泳(如圖1)和板狀電泳(如圖2)，兩者電泳原理完全相同。 第17頁/共32頁第十七頁，共33頁。第18頁/共32頁第十八頁，共33頁。第19頁/共32頁第十九頁，共33頁。第20頁/共32頁第二十頁，共33頁。第21頁/共32頁第二

7、十一頁，共33頁。蛋白質在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時，它的遷移率取決于它所帶凈電荷以及分子的大小 和形狀等因素。如果加入一種試劑使電荷因素消除，那電泳遷移率就取決于分子的大 小，就可以用電泳技術測定蛋白質的分子量。1967年，Shapiro等發(fā)現(xiàn)陰離子去污劑 十二烷基硫酸鈉（SDS）具有這種作用。當向蛋白質溶液中加入足夠量SDS和巰基乙 醇，巰基乙 醇可使蛋白質分子中的二硫鍵還原。由于十二烷基硫酸根帶負電(fdin)，使各種蛋白 質SDS復合物都帶上相同密度的負電(fdin)荷，它的量大大超過了蛋白質分子原的電荷量， 因而掩蓋了不同種蛋白質間原有的電荷差別，SDS與蛋白質結合后，還可引起構象改 變

8、，蛋白質SDS復合物形成近似“雪茄煙”形的長橢圓棒，不同蛋白質的SDS復合物 的短軸長度都不一樣，約為18A，這樣的蛋白質SDS復合物，在凝膠中的遷移率，不 再受蛋白質原來的電荷和形狀的影響，而取決于分子量的大小，因而SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳可以用于測定蛋白質的分子量。 SDS-PAGE第22頁/共32頁第二十二頁，共33頁。第23頁/共32頁第二十三頁，共33頁。第24頁/共32頁第二十四頁，共33頁。Gly -Pro -Cl- Gly -Pro -Cl- Cl- Cl- Cl- Pro -Pro -Pro -Gly -Gly -Gly -第25頁/共32頁第二十五頁，共33頁。 不連續(xù)(l

9、inx)體系由電極緩沖液、濃縮膠及分離膠所組成。濃縮膠是由AP催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為pH6.7的Tris-HC1。分離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為pH8.9 Tris-HC1。電極緩沖液是pH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液。2種孔徑的凝膠、2種緩沖體系、3種pH值使不連續(xù)(linx)體系形成了凝膠孔徑、pH值、緩沖液離子成分的不連續(xù)(linx)性，這是樣品濃縮的主要因素。第26頁/共32頁第二十六頁，共33頁。 樣品濃縮效應 (1)凝膠孔徑不連續(xù)性： (2)緩沖體系離子成分及pH值的不連續(xù)性； 在pH6.7的凝膠緩沖體系中 前導離子或快離子：HC1解離出的氯根(C1

10、-) 尾隨離子(trailing ion)或慢離子：甘氨酸根(甘氨酸等電點：5.97) mclclmppmGG(Cl代表氯根，P代表蛋白質，G代表甘氨酸根)有效遷移率=m，m為遷移率，為解離度) 當進入pH8.9的分離(fnl)膠時，甘氨酸解離度增加，其有效遷移率超過蛋白質； (3)電位梯度的不連續(xù)性： 分子篩效應 電荷效應第27頁/共32頁第二十七頁，共33頁。四、實驗四、實驗(shyn)(shyn)結果的結果的分析分析 第28頁/共32頁第二十八頁，共33頁。第29頁/共32頁第二十九頁，共33頁。第30頁/共32頁第三十頁，共33頁。第31頁/共32頁第三十一頁，共33頁。謝謝您的觀看(gunkn)！第32頁/共32頁第三十二頁，共33頁。NoImage內(nèi)容(nirng)總結不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳。認清試劑(shj)（試劑(shj)和吸管對號、量器的使用）。4、配膠后立即