實(shí)時(shí)定量PCR步驟詳細(xì)

1、半定量和實(shí)時(shí)定量 PCR步驟實(shí)驗(yàn)原理：RT-PCR將以RNA為模板的cDNA合成同PCR結(jié)合在一起，提供了一種分析基因表達(dá)的快速靈敏的方法。RT-PCR用于對(duì)表達(dá)信息進(jìn)行檢測(cè)或定量。另外，這項(xiàng)技術(shù)還可以用來檢測(cè)基因表達(dá)差異或不必構(gòu)建cDNA文庫(kù)克隆cDNA。RT-PCR比其他包括 Northern印跡、RNase保護(hù)分析、原位雜交及 S1核酸酶分析在內(nèi)的 RNA分析技術(shù)，更靈敏，更易于操作。RT-PCR的模板可以為總 RNA或poly（A）+選擇性RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可以使用逆轉(zhuǎn)錄酶，以隨機(jī)引物、 oligo（dT）或基因特異性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進(jìn)行。在兩

2、步法 RT-PCR 中，每一步都在最佳條件下進(jìn)行。cDNA的合成首先在逆轉(zhuǎn)錄緩沖液中進(jìn)行，然后取出1/10的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行PCR。在一步法 RT-PCR中，逆轉(zhuǎn)錄和 PCR在同時(shí)為逆轉(zhuǎn)錄和 PCR優(yōu)化的條件下，在一只管中順次進(jìn) 行。實(shí)驗(yàn)步驟：Trizol法RNA提取步驟 1、提取總RNA2、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)3、PCR反應(yīng)以下實(shí)驗(yàn)步驟僅供參考： 1樣品RNA的抽提 取凍存已裂解的細(xì)胞，室溫放置5分鐘使其完全溶解。 兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入 0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動(dòng)劇烈振蕩管體15秒后，15到30C孵育2到3分鐘。4C下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為

3、下層的紅色酚氯仿相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時(shí)加入的TRIZOL試劑的60%。 RNA沉淀將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無 RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA,混勻后15到30C孵育10分鐘后，于4C下12000rpm離心10分鐘。此時(shí)離心前不可見的 RNA沉淀將在 管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。 RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗 RNA沉淀?；靹蚝螅?C下7000rpm離心5分鐘。 RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使 RNA沉淀在室

4、溫空氣中干燥 5-10分鐘。 溶解RNA沉淀溶解RNA時(shí)，先加入無 RNA酶的水40 用槍反復(fù)吹打幾次，使其完全溶解，獲得的 RNA溶液保存于-80 C待用。2 RNA質(zhì)量檢測(cè)1）紫外吸收法測(cè)定先用稀釋用的TE溶液將分光光度計(jì)調(diào)零。然后取少量 RNA溶液用TE稀釋（1:100）后，讀取其在分光光 度計(jì)260nm和280nm處的吸收值，測(cè)定 RNA溶液 濃度和純度。 濃度測(cè)定A260下讀值為1表示40 g RNA/ml。樣品RNA濃度（肉/ml）計(jì)算公式為：A260 襦釋倍數(shù)X 40 g/mL具 體計(jì)算如下：RNA 溶于 40 lcDEPC 水中，取 5ul, 1:100 稀釋至 495 4 的

5、 TE 中，測(cè)得 A260 = 0.21RNA 濃度=0.21 100 40 g/ml = 840 g/l 或 0.84 g/ y取5ul用來測(cè)量以后，剩余樣品 RNA為35 L剩余RNA總量為：35 k 084 g/以=29.4 g 純度檢測(cè)RNA溶液的A260/A280的比值即為 RNA純度，比值范圍1.8到2.1。2）變性瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定 制膠1g瓊脂糖溶于72ml水中，冷卻至60C, 10 ml的10 XMOPS電泳緩沖液和18 ml的37%甲醛溶液（12.3 M）。10 >MOPS電泳緩沖液濃度成分0.4M MOPS , pH 7.00.1M 乙酸鈉0.01M EDTA灌制凝

6、膠板，預(yù)留加樣孔至少可以加入25 jl溶液。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內(nèi)，加足量的1 >MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個(gè)毫米。 準(zhǔn)備RNA樣品取3四RNA，加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10四/ml。加熱至70 C孵育15分鐘使樣品變性。 電泳上樣前凝膠須預(yù)電泳 5min，隨后將樣品加入上樣孔。5 -6V/cm電壓下2h,電泳至漠酚蘭指示劑進(jìn)膠至少2 -3cm。 紫外透射光下觀察并拍照28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃（其大小決定于用于抽提RNA的物種類型），上面一條帶的密度大約是下面一條帶的 2倍。還有可能觀察到一個(gè)更小稍微擴(kuò)散的帶，它由低分子

7、量的RNA （tRNA和5S核糖體RNA ）組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質(zhì)，可能是由 mRNA和其它異型RNA組成。RNA制備過程中如果出現(xiàn) DNA污染，將會(huì)在28S核糖體RNA帶的上面出現(xiàn)，即更 高分子量的彌散遷移物質(zhì)或者帶，RNA的降解表現(xiàn)為核糖體 RNA帶的彌散。用數(shù)碼照相機(jī)拍下電泳結(jié)果。3樣品cDNA合成 反應(yīng)體系序號(hào)反應(yīng)物劑量序號(hào)反應(yīng)物劑量1逆轉(zhuǎn)錄buffer2引5逆腥MMLV0.5引2上游引物0.2引6DEPC 水5引3下游引物0.2引7RNA模版214dNTP0.1引8總體積10 4輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。 混合液在加入逆轉(zhuǎn)錄

8、酶MMLV 之前先70C干浴3分鐘，取出后立即冰水浴至管內(nèi)外溫度一致，然后加逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 1 37 C水浴60分鐘。 取出后立即95C干浴3分鐘，得到逆轉(zhuǎn)錄終溶液即為cDNA溶液，保存于-80C待用。4梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣品的管家基因（3-actin）實(shí)時(shí)定量PCR 3-actin陽性模板的標(biāo)準(zhǔn)梯度制備陽性模板的濃度為1011,反應(yīng)前取3胺10倍稀釋（加水27并充分混勻）為1010,依次稀釋至109、108、107、106、105、104,以備用。 反應(yīng)體系如下：標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)體系序號(hào)反應(yīng)物劑量序號(hào)反應(yīng)物劑量1SYBR Green 1 染料1015Taq酶1引2陽性模板上游引物F0.5 卬

9、16陽性模板DNA5引3陽性模板下游引物R0.5 卬 17ddH2O32.5 引4dNTP0.5 卬 18總體積50引輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。管家基因反應(yīng)體系：序號(hào)反應(yīng)物劑量序號(hào)反應(yīng)物劑量1SYBR Green 1 染料1015Taq酶1引2內(nèi)參照上游引物F0.5 卬 16待測(cè)樣品cDNA5引3內(nèi)參照下游引物R0.5 卬 17ddH2O32.5 引4dNTP0.5 卬 18總體積50引輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。 制備好的陽性標(biāo)準(zhǔn)品和檢測(cè)樣本同時(shí)上機(jī)，反應(yīng)條件為： 93 C 2分鐘，然后93C 1分鐘，55C 2分 鐘，共40個(gè)循環(huán)。5制備用于繪制梯度稀釋標(biāo)

10、準(zhǔn)曲線的DNA模板針對(duì)每一需要測(cè)量的基因，選擇一確定表達(dá)該基因的cDNA模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系：序號(hào)反應(yīng)物劑量序號(hào)反應(yīng)物劑量110 XPCR緩沖液2.5 ul5dNTP混合液312MgCl 2溶液1.516Taq酶1 (113上游引物F0.5 卬 17cDNA1 (114下游引物R0.5 卬 18加水至總體積為25引輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。35個(gè)PCR循環(huán)（94 C 1分鐘；55C 1分鐘；72 C 1分鐘）； 72oC延伸5分鐘。 PCR產(chǎn)物與DNA Ladder在2 %瓊脂糖凝膠電泳， 漠化乙錠染色，檢測(cè)PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴(kuò)增 條帶。 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行10

11、倍梯度稀釋：將PCR產(chǎn)物進(jìn)行10倍梯度稀釋：設(shè)定PCR產(chǎn)物濃度為1X1010,依次 稀釋至109、108、107、106、105、104幾個(gè)濃度梯度。6待測(cè)樣品的待測(cè)基因?qū)崟r(shí)定量PCR所有cDNA樣品分別配置實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系。體系配置如下：序號(hào)反應(yīng)物劑量序號(hào)反應(yīng)物劑量1SYBR Green 1 染料1015Taq酶212上游引物F1 16待測(cè)樣品cDNA5引3下游引物R1 17ddH2O30 14dNTP1 18總體積50卬1輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。將配制好的PCR反應(yīng)溶液置于 Realtime PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件為：93C 2分鐘預(yù)變性，然后按9

12、3C 1分鐘，55C 1分鐘，72C 1分鐘，共40做個(gè)循環(huán)，最后 72C 7分鐘延伸。7實(shí)時(shí)定量PCR使用引物列表引物設(shè)計(jì)軟件：Primer Premier 5.0,并遵循以下原則：引物與模板的序列緊密互補(bǔ)；引物與引物之間避免形成 穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)；引物不在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA聚合反應(yīng)（即錯(cuò)配）。PCR實(shí)驗(yàn)步驟RNAM 度吸光度比值，計(jì)算一、組織抽提：1. 取組織塊50-100嘩用液氮在研缽中研磨成粉末2. 移入玻璃勻漿器加入1ml Trizol抽打勻漿3. 移入1.5ml新離心管用5 ml針頭抽打4. 冰上孵育5分鐘5. 離心12,000g 4 C 5 分鐘 取上清液移入 1.

13、5ml新離心管6. 加0.2 ml氯仿，震蕩，冰上孵育 5分鐘7. 離心12,000g 4 C 10 分鐘 取上層液相移入1.5ml新離心管8. 加0.5 ml異丙醇，震蕩，冰上孵育5分鐘9. 離心12,000g 4 C 5 分鐘 棄去上清液10. 加入1 ml 75%乙醇，震蕩11. 離心7,500g, 4C ,5分鐘 棄去上清液12. 室溫下使之變透明13. 加入DEPCM理水10 1 -351溶解RNA 可保存在液氮或低溫冰箱）14. 走RNA變性電泳觀察18s , 28s條帶，分光光度 計(jì)檢測(cè)260/280、RT反應(yīng)體系RT反應(yīng)體系（第一步）：約20分鐘RN用由提物5110mM dNT

14、P 1 卬 1Radome 引物 215X RT緩沖液 41RNA sin0.5125mM MgC12 411.65C 15 分鐘AMV逆車穌酶312.立即放入冰浴1.37 C 1.5 小時(shí)RT反應(yīng)體系（第二步）：約2小時(shí)2. 94 C 5 -10分鐘RNA sin0.513.反應(yīng)物保存于-20C或進(jìn)行PCRPCRK應(yīng)體系1）、PC版應(yīng)體系：25mM MgCl210X PCR緩7中液10mM dNTP上下游引物10pmo1/4.51 1小時(shí)1.94 C 2 分鐘，55C 12.94 C 45 秒，55C 403.72 C 10 分鐘4.取出后4C 5分鐘后-20 C保存或走電泳11111I 1X272 C 2分鐘為第一個(gè)步2.5分鐘，秒，72 C 1分鐘 為第二步30個(gè)循環(huán)CDNA 莫板 ddH2O Taq酶 輕質(zhì)石蠟油 1個(gè)循環(huán)2.5340.5501 11111002）、PCR應(yīng)體系：約 25mM MgC12 3110X PCR緩7中液510mM dNTP 1 上下游引物10pmol/11.94 C 2 分鐘，55C 12.94 C 45 秒，50C 403. 72 C 10 分鐘4. 取出后4C 5分鐘后-20C保存或走電泳5小時(shí)1 X2CDNA 莫板 ddH2O Taq酶 輕質(zhì)石蠟油53012.5分鐘，72