Westernblot技術(shù)詳細(xì)實(shí)用教案

1、定義定義(dngy)： 印跡法（blotting）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用(lyng)相應(yīng)的探測(cè)反應(yīng)來檢測(cè)樣品的一種方法。 1975年，Southern建立了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，并利用(lyng)DNARNA雜交檢測(cè)特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法。 而后人們用類似的方法，對(duì)RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行印跡分析，對(duì)RNA的印跡分析稱為Northern印跡法，對(duì)單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Western印跡法，對(duì)雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Eastern印跡法第1頁(yè)/共27頁(yè)第一頁(yè)，共28頁(yè)。Western Blot基本原理基本原理 在電場(chǎng)的

2、作用下將電泳分離的多肽(du ti)從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持體，然后用這種多肽(du ti)的特異抗體來檢測(cè)。快速、特異，信號(hào)快速、特異，信號(hào)(xnho)弱、弱、昂貴昂貴信號(hào)強(qiáng)、二抗選擇信號(hào)強(qiáng)、二抗選擇(xunz)多，非多，非特異性結(jié)合特異性結(jié)合第2頁(yè)/共27頁(yè)第二頁(yè)，共28頁(yè)。 SDS聚丙烯酰胺 凝膠電泳l轉(zhuǎn)膜l封閉(fngb)l一抗雜交l二抗雜交l底物顯色n蛋白(dnbi)樣品的制備第3頁(yè)/共27頁(yè)第三頁(yè)，共28頁(yè)。第4頁(yè)/共27頁(yè)第四頁(yè)，共28頁(yè)。裂解裂解(li ji)液液第5頁(yè)/共27頁(yè)第五頁(yè)，共28頁(yè)。SDSSDS聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳原理：原理： SDS 是一種離子性

3、的界面活性劑是一種離子性的界面活性劑,它有強(qiáng)離子性的硫酸根離它有強(qiáng)離子性的硫酸根離子也帶有疏水子也帶有疏水性的長(zhǎng)碳鏈性的長(zhǎng)碳鏈.當(dāng)當(dāng) SDS 與蛋白質(zhì)混合時(shí)與蛋白質(zhì)混合時(shí),它會(huì)以其碳鏈與蛋白質(zhì)它會(huì)以其碳鏈與蛋白質(zhì)之疏水性胺之疏水性胺基酸結(jié)合將蛋白質(zhì)包起來基酸結(jié)合將蛋白質(zhì)包起來,而以硫酸根離子外露與水分子而以硫酸根離子外露與水分子(fnz)作用作用.大多數(shù)蛋大多數(shù)蛋白質(zhì)和白質(zhì)和 SDS 的平均結(jié)合量是的平均結(jié)合量是 1:1.4 (以重量為單位以重量為單位),而蛋白而蛋白質(zhì)結(jié)合固定質(zhì)結(jié)合固定比例之比例之 SDS 後後,由於由於 SDS 帶強(qiáng)負(fù)價(jià)帶強(qiáng)負(fù)價(jià),使蛋白質(zhì)原先的帶電價(jià)使蛋白質(zhì)原先的帶電價(jià)微不

4、足道微不足道,且且每單位重量之蛋白質(zhì)帶電價(jià)一致每單位重量之蛋白質(zhì)帶電價(jià)一致 (charge density),所以決所以決定不同蛋白的泳動(dòng)速率就只剩下分子定不同蛋白的泳動(dòng)速率就只剩下分子(fnz)大小一項(xiàng)因素大小一項(xiàng)因素第6頁(yè)/共27頁(yè)第六頁(yè)，共28頁(yè)。M丙烯酰胺和N,N-亞甲雙丙烯酰胺 MSDSM配膠的Tris緩沖液MTEMEDM過硫酸銨(時(shí)間(shjin)MTris-甘氨酸電泳緩沖液凝膠成份凝膠成份(chng fn)第7頁(yè)/共27頁(yè)第七頁(yè)，共28頁(yè)。第8頁(yè)/共27頁(yè)第八頁(yè)，共28頁(yè)。第9頁(yè)/共27頁(yè)第九頁(yè)，共28頁(yè)。第10頁(yè)/共27頁(yè)第十頁(yè)，共28頁(yè)。第11頁(yè)/共27頁(yè)第十一頁(yè)，共28頁(yè)。

5、大于大于20KD0.45 um20KD0.2 um7KD0.1 um第12頁(yè)/共27頁(yè)第十二頁(yè)，共28頁(yè)。轉(zhuǎn)膜半干法半干法將凝膠和固相基質(zhì)象三明治一樣加在用緩沖液濕將凝膠和固相基質(zhì)象三明治一樣加在用緩沖液濕潤(rùn)濾紙之間。（小分子量蛋白潤(rùn)濾紙之間。（小分子量蛋白(dnbi)(dnbi)）濕法濕法將凝膠和固相基質(zhì)夾在濾紙中間，浸泡在轉(zhuǎn)移裝將凝膠和固相基質(zhì)夾在濾紙中間，浸泡在轉(zhuǎn)移裝置的緩沖液中。（大分子量蛋白置的緩沖液中。（大分子量蛋白(dnbi)(dnbi)） 第13頁(yè)/共27頁(yè)第十三頁(yè)，共28頁(yè)。濕轉(zhuǎn)第14頁(yè)/共27頁(yè)第十四頁(yè)，共28頁(yè)。半干轉(zhuǎn)第15頁(yè)/共27頁(yè)第十五頁(yè)，共28頁(yè)。第16頁(yè)/共27

6、頁(yè)第十六頁(yè)，共28頁(yè)。一抗、二抗孵育(f y) 把硝酸纖維素濾膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，根據(jù)濾膜面積以0.1ml/cm2的量加入加入一抗溶液與濾膜溫育。37一小時(shí)，4 過夜。 倒掉一抗溶液，用TBST漂洗液濾膜3次，每次10min。 加入用封閉液配制的二抗，搖床上緩慢(hunmn)搖動(dòng)， 37一小時(shí)，4 過夜。 倒掉二抗溶液，用TBST漂洗液濾膜3次，每次10min。第17頁(yè)/共27頁(yè)第十七頁(yè)，共28頁(yè)。辣根過氧化物(u yn hu w)酶法（HRP）堿性磷酸酶法（AP）化學(xué)發(fā)光顯色法(HRP)DAB 顯色法：方便、經(jīng)濟(jì)，反應(yīng)慢、不易保存、不能重新剝離顯色法：方便、經(jīng)濟(jì)，反應(yīng)慢、不易保存、

7、不能重新剝離(bl)檢測(cè)檢測(cè)ECL發(fā)光法：靈敏、快速、反應(yīng)快、能重新剝離發(fā)光法：靈敏、快速、反應(yīng)快、能重新剝離(bl)檢測(cè)檢測(cè)第18頁(yè)/共27頁(yè)第十八頁(yè)，共28頁(yè)。第19頁(yè)/共27頁(yè)第十九頁(yè)，共28頁(yè)。第20頁(yè)/共27頁(yè)第二十頁(yè)，共28頁(yè)。第21頁(yè)/共27頁(yè)第二十一頁(yè)，共28頁(yè)。第22頁(yè)/共27頁(yè)第二十二頁(yè)，共28頁(yè)。背景(bijng)太高1.1.膜沒有均勻浸濕膜沒有均勻浸濕2.2.膜或者緩沖液污染膜或者緩沖液污染3.3.封閉不充分封閉不充分4.4.抗體與封閉劑出現(xiàn)交抗體與封閉劑出現(xiàn)交叉反應(yīng)叉反應(yīng)5.5.抗體濃度過高抗體濃度過高 原因?qū)Σ?.1.轉(zhuǎn)膜前用轉(zhuǎn)膜前用100%100%甲醇將膜完甲醇將

8、膜完全浸濕全浸濕2.2.拿取膜與吸水紙時(shí)要戴手拿取膜與吸水紙時(shí)要戴手套，更換新鮮轉(zhuǎn)膜緩沖液套，更換新鮮轉(zhuǎn)膜緩沖液3.3.檢測(cè)一抗、二抗與封閉劑檢測(cè)一抗、二抗與封閉劑是否有交叉反應(yīng)是否有交叉反應(yīng)4.4.雜交前檢測(cè)一抗、二抗的雜交前檢測(cè)一抗、二抗的工作濃度工作濃度第23頁(yè)/共27頁(yè)第二十三頁(yè)，共28頁(yè)。沒有陽(yáng)性(yngxng)條帶或比較弱1.1.抗體染色不充分抗體染色不充分2.2.靶蛋白含量太低靶蛋白含量太低3.3.HRPHRP抑制劑抑制劑4.4.轉(zhuǎn)膜時(shí)間不夠轉(zhuǎn)膜時(shí)間不夠5.5.曝光時(shí)間過短曝光時(shí)間過短 原因?qū)Σ?.1.增加抗體滴度，延長(zhǎng)孵育增加抗體滴度，延長(zhǎng)孵育時(shí)間時(shí)間2.2.增加樣本上樣量增加

9、樣本上樣量3.3.所用溶液和容器中避免含所用溶液和容器中避免含有疊氮化鈉有疊氮化鈉4.4.大分量蛋白相應(yīng)增加轉(zhuǎn)膜大分量蛋白相應(yīng)增加轉(zhuǎn)膜時(shí)間及曝光時(shí)間時(shí)間及曝光時(shí)間第24頁(yè)/共27頁(yè)第二十四頁(yè)，共28頁(yè)。彌散(msn)性條帶或非特異性條帶1.1.抗體濃度太高抗體濃度太高2.2.蛋白上樣量太多蛋白上樣量太多3.3.交叉交叉(jioch)(jioch)反應(yīng)反應(yīng) 原因原因(yunyn)對(duì)策1.1.降低抗體濃度降低抗體濃度2.2.降低樣本上樣量降低樣本上樣量第25頁(yè)/共27頁(yè)第二十五頁(yè)，共28頁(yè)。第26頁(yè)/共27頁(yè)第二十六頁(yè)，共28頁(yè)。謝謝您的觀看(gunkn)！第27頁(yè)/共27頁(yè)第二十七頁(yè)，共28頁(yè)。NoImage內(nèi)容(nirng)總結(jié)定義：?？焖?、特異，信號(hào)弱、昂貴。對(duì)于難溶解蛋白，應(yīng)選(yn xun)用裂解強(qiáng)度更高的裂解液（如RIPA, SDS)。把硝酸纖維素濾膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)