RAPD技術(shù)實(shí)用教案

1、一.RAPD技術(shù)(jsh)的提出RAPD技術(shù)是20世紀(jì)90年代初由美國(guó)杜邦公司農(nóng)產(chǎn)品研究(ynji)中心的J.G .K.Williams和美國(guó)加利福尼亞生物研究(ynji)所的J.Welsh兩個(gè)研究(ynji)小組幾乎同時(shí)建立的檢測(cè)隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA的分子生物學(xué)技術(shù)。第1頁(yè)/共16頁(yè)第一頁(yè)，共17頁(yè)。二. RAPD技術(shù)(jsh)的原理圖1. PCR過(guò)程(guchng)示意圖第2頁(yè)/共16頁(yè)第二頁(yè)，共17頁(yè)。理論基礎(chǔ)：不同物種的基因組中與引物相匹配的堿基序列的空間位置和數(shù)目都有可能(knng)不同，所以，擴(kuò)增產(chǎn)物的大小和數(shù)量也有可能(knng)不同，這些差異可以通過(guò)凝膠電泳顯示出來(lái)?；谶@種理論

2、，Williams將通常PCR擴(kuò)增中使用的兩個(gè)特定序列的引物改為單一的由10個(gè)堿基構(gòu)成的隨機(jī)序列引物，并運(yùn)用大量不同序列的引物進(jìn)行擴(kuò)增，最后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離和EB染色來(lái)檢測(cè)DNA片段的多態(tài)性。第3頁(yè)/共16頁(yè)第三頁(yè)，共17頁(yè)。三三. RAPD技術(shù)技術(shù)(jsh)的應(yīng)的應(yīng)用用在微生物分類鑒定中應(yīng)用(1). 在原核(yun h)生物分類中的應(yīng)用原核(yun h)生物基因組結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，常采用培養(yǎng)特性、表型特征、生理生化特點(diǎn)等傳統(tǒng)的分類鑒別方法，但這些方法不能完全準(zhǔn)確、可靠地鑒別不同的型或亞型。RAPD分型、分類鑒別方法正越來(lái)越受到廣泛的關(guān)注。Hilton 等以隨機(jī)引物“1254”(含10個(gè)寡核普酸堿

3、基)擴(kuò)增鑒別(jinbi)了20種不同血清型沙門氏菌，并進(jìn)一步把RAPD擴(kuò)增片段克隆到載體上，以地高辛雜交標(biāo)記探針驗(yàn)證相關(guān)的RAPD帶，證明RAPD這種快速的分子分型方法對(duì)沙門氏菌基因分型是完全適用的。第4頁(yè)/共16頁(yè)第四頁(yè)，共17頁(yè)。(2).在Frankia分類鑒定中的應(yīng)用 Frankia是一類共生固氮放線菌，能與多種樹木(shm)形成根瘤。目前共有8個(gè)科，25個(gè)屬，超過(guò)300個(gè)種，有極豐富的生物多樣。Frankia在自然界與宿主植物共生，無(wú)法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)，所以對(duì)Frankia的研究進(jìn)展較慢。傳統(tǒng)的分類方法對(duì)Frankia鑒定到種或亞種是很困難的。RAPD由于不需設(shè)計(jì)特異的引物，一次可獲

4、得大量DNA多態(tài)性片段，這為在同一屬或群下分類鑒別不同(b tn)Frankia 種或亞種提供了潛在可行的方法。第5頁(yè)/共16頁(yè)第五頁(yè)，共17頁(yè)。2.構(gòu)建(u jin)遺傳圖譜 遺 傳 圖 譜 構(gòu) 建 為 遺 傳 領(lǐng) 域 中 研 究 的 一 個(gè) 熱 點(diǎn) ， 迄 今 已 對(duì) 水 稻 、 玉 米 、 小 麥 等 許 多 重 要(zhngyo)作物進(jìn)行了圖譜構(gòu)建，而林木的遺傳圖譜構(gòu)建一直被視為作圖研究的難區(qū)。尹佟明等(1997)利用RAPD標(biāo)記和單株樹大配子體構(gòu)建馬尾松的分子標(biāo)記連鎖圖譜。他們利用300個(gè)隨機(jī)的寡聚核苷酸引物和馬尾松種子(zhng zi)的胚乳產(chǎn)生的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA(RAPD)分子

5、標(biāo)記，進(jìn)行松標(biāo)記連鎖圖譜的構(gòu)建。第6頁(yè)/共16頁(yè)第六頁(yè)，共17頁(yè)。3.抗性基因(jyn)研究 王京兆等(1996)篩選與楊樹抗云斑天牛基因連鎖的RAPD標(biāo)記，用RAPD方法篩選到的RAPD標(biāo)記不僅對(duì)分析和分離抗蟲基因十分有用，而且在抗性育種的早期鑒定中也有重要用途。在選育過(guò)程中，不需進(jìn)行抗蟲實(shí)驗(yàn)，只要在苗期提取微量DNA，用OPAD01，作引物進(jìn)行RAPD擴(kuò)增，凡是有OPAD011000這一多態(tài)性片段就是(jish)抗蟲材料，這必將大大節(jié)省育種時(shí)間，提高育種效率。第7頁(yè)/共16頁(yè)第七頁(yè)，共17頁(yè)。4.親緣(qn yun)關(guān)系分析李寬鈺(1997)用RAPD方法探討毛白楊起源，從而探討毛白楊與推

6、測(cè)(tuc)親本親緣關(guān)系，由此研究毛白楊的起源及演化機(jī)制。馮麗春(1997)利用RAPD對(duì)桑屬植物種間親緣關(guān)系進(jìn)行了研究，認(rèn)為川桑與其他種的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，是分化較獨(dú)特的桑種之一，在UPGMA系統(tǒng)樹上由結(jié)合線L2所劃分的桑種類群與傳統(tǒng)的形態(tài)分類基本一致。第8頁(yè)/共16頁(yè)第八頁(yè)，共17頁(yè)。5. RAPD技術(shù)(jsh)在珍稀瀕危植物研究和保護(hù)中的作用RAPD技術(shù)不僅可以廣泛應(yīng)用于比較遺傳多樣性的復(fù)雜程度、探討物種的系統(tǒng)發(fā)育情況及種質(zhì)資源(zyun)的鑒定等諸多方面,而且還為珍稀瀕危植物的研究和保護(hù)提供了理論依據(jù),因此RAPD技術(shù)在研究珍稀瀕危植物遺傳多樣性方面有著廣泛的應(yīng)用前景。第9頁(yè)/共16頁(yè)第九

7、頁(yè)，共17頁(yè)。四. RAPD技術(shù)(jsh)的優(yōu)點(diǎn)1.與RFLP法相比，RAPD法所需的模板DNA量少，要求純度低，操作快，且無(wú)需知道DNA 序列的信息，而且獲得基因圖譜較迅速，標(biāo)記密度大。2. 不需要對(duì)每一種(y zhn)微生物進(jìn)行鑒定，但需要篩選和比較隨時(shí)間變化的不同樣品中微生物的變化情況。反應(yīng)引物是隨機(jī)排列的，無(wú)須專門設(shè)計(jì)，且引物較短(一般920 bp）故引物合成費(fèi)用低，總成本低。技術(shù)可以直接對(duì)所檢測(cè)的DNA多態(tài)性進(jìn)行分析(fnx),省去了許多如制備、克隆、同位素標(biāo)記、Southern印跡、分子雜交等繁雜的工作。第10頁(yè)/共16頁(yè)第十頁(yè)，共17頁(yè)。五. RAPD技術(shù)(jsh)的缺陷RAPD

8、技術(shù)(jsh)重復(fù)性，結(jié)果的可靠性低 模板質(zhì)量(zhling)和濃度短的引物序列PCR循環(huán)次數(shù)基因組DNA的復(fù)雜性 技術(shù)設(shè)備第11頁(yè)/共16頁(yè)第十一頁(yè)，共17頁(yè)。六.解決辦法(1). 引物合成時(shí)需要滿足以下兩個(gè)條件：G+C的含量不低于40%，5和3端的堿基順序非反向?qū)ΨQ，否則無(wú)法合成專一性的DNA片段；引物長(zhǎng)度以10個(gè)堿基為宜，若引物太短（少于9個(gè)核苷酸長(zhǎng)度），與模板結(jié)合有困難，聚合反應(yīng)( j h fn yng)則很難進(jìn)行。如果引物太長(zhǎng)，成本增加，合成多態(tài)性DNA片段的可能性就會(huì)降低。第12頁(yè)/共16頁(yè)第十二頁(yè)，共17頁(yè)。(2).操作規(guī)范,反應(yīng)體系的組成要力求一致,盡快(jnkui)可能地使R

9、APD反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化；(3).提高擴(kuò)增片段的分辨率；Valentin認(rèn)為毛細(xì)管區(qū)域電泳法是一種更為靈敏、準(zhǔn)確和經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)手段,同樣條件下,以獲得(hud)更多的RAPD擴(kuò)增片段；傅俊江等認(rèn)為通過(guò)延長(zhǎng)退火到延伸的ramp時(shí)間,可以提高RAPD技術(shù)的擴(kuò)增效率。另外用熒光RAPD法;并用4%聚丙烯酰胺凝膠電泳，對(duì)提高RAPD的穩(wěn)定性也極為有效。(4).將RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化(zhunhu)為SCAR標(biāo)記后,再進(jìn)行常規(guī) 的PCR分析,可以提高反應(yīng)的穩(wěn)定性及可靠性。第13頁(yè)/共16頁(yè)第十三頁(yè)，共17頁(yè)。七.參考文獻(xiàn)1.徐嘵飛, 林煒鐵, 彭智輝等. RAPD技術(shù)及其在微生物學(xué)方面的應(yīng)用 J. 生命的化學(xué)(hux

10、u), 2001, 5(21): 436-438.2.劉建鋒, 肖文發(fā), 馮霞. RAPD技術(shù)在珍稀瀕危植物遺傳多樣性研究中的應(yīng)用 J. 林業(yè)科學(xué), 2004, 3(40): 156-161.3.吳少慧, 張成剛, 張忠澤. RAPD技術(shù)在微生物生物多樣鑒定中的應(yīng)用 J.微生物學(xué)雜志, 2000, 2(20): 44-47.4.魯亮, 歸鴻. RAPD技術(shù)的特點(diǎn)及其在昆蟲分類中的應(yīng)用 J.昆蟲學(xué)報(bào), 1995, 1(38): 117-122.5.邢秀芹. RAPD技術(shù)的應(yīng)用 J.食品科技, 2010,12(35): 314-316.第14頁(yè)/共16頁(yè)第十四頁(yè)，共17頁(yè)。第15頁(yè)/共16頁(yè)第十五頁(yè)，共17頁(yè)。感謝您的觀看(gunkn)！第16頁(yè)/共16頁(yè)第十六頁(yè)，共17頁(yè)。NoImage內(nèi)容(nirng)總結(jié)一.RAPD技術(shù)的提出。傳統(tǒng)的分類方法對(duì)Frankia鑒定到種或亞種是很困難的