實驗九動物肝臟DNA提取和鑒定學習教案

1、會計學1實驗九動物肝臟實驗九動物肝臟(gnzng)DNA提取和鑒定提取和鑒定第一頁，共31頁。第1頁/共30頁第二頁，共31頁。設法除去設法除去RNARNA的污染；的污染；防止防止DNADNA酶的降解作用；酶的降解作用；（一）動物（一）動物(dngw)肝臟肝臟DNA制備原理制備原理第2頁/共30頁第三頁，共31頁。第3頁/共30頁第四頁，共31頁。細胞破碎細胞破碎(p su)方法方法機械物機械物理法：理法：第4頁/共30頁第五頁，共31頁。細胞破碎細胞破碎(p su)方法方法機械物理機械物理法法第5頁/共30頁第六頁，共31頁。第6頁/共30頁第七頁，共31頁。第7頁/共30頁第八頁，共31頁

2、。第8頁/共30頁第九頁，共31頁。第9頁/共30頁第十頁，共31頁。（二）瓊脂糖凝膠電泳分離核酸（二）瓊脂糖凝膠電泳分離核酸(h sun)的原的原理：理：l瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖凝膠作為支持介質的一種電泳分離瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖凝膠作為支持介質的一種電泳分離(fnl)方法，是一種簡便、快速分離方法，是一種簡便、快速分離(fnl)鑒定核酸的方法，已成鑒定核酸的方法，已成為分子生物學及基因工程研究中常用實驗方法之一。為分子生物學及基因工程研究中常用實驗方法之一。l瓊脂糖英文名瓊脂糖英文名agarose，是從瓊脂中提取出來的，由半乳糖和，是從瓊脂中提取出來的，由半乳糖和L- 半乳糖相互結合的

3、鏈狀多糖。瓊脂糖和瓊脂都可在不同濃度的水半乳糖相互結合的鏈狀多糖。瓊脂糖和瓊脂都可在不同濃度的水溶液下可形成多孔的凝膠，電泳中具有分子篩效應。但瓊脂糖含溶液下可形成多孔的凝膠，電泳中具有分子篩效應。但瓊脂糖含硫酸根比瓊脂少，電滲作用降低，因而分離硫酸根比瓊脂少，電滲作用降低，因而分離(fnl)效果明顯提高效果明顯提高。第10頁/共30頁第十一頁，共31頁。lDNADNA分子在分子在pHpH高于其等電點的溶液中帶負電荷，在電場中高于其等電點的溶液中帶負電荷，在電場中向正極移動（電荷效應）向正極移動（電荷效應） 。lDNADNA分子泳動速率的大小除與分子泳動速率的大小除與DNADNA分子的帶電量有

4、關外，分子的帶電量有關外，還與還與DNADNA分子的大小和空間構象有關（瓊脂糖凝膠的分子分子的大小和空間構象有關（瓊脂糖凝膠的分子篩效應）。篩效應）。l電泳時，用溴酚藍做前沿指示劑，用溴化乙啶電泳時，用溴酚藍做前沿指示劑，用溴化乙啶 （ethidium bromideethidium bromide，EBEB） 指示指示DNADNA樣品在凝膠中的確切位樣品在凝膠中的確切位置。置。l溴化乙啶是一種熒光染料，可插入溴化乙啶是一種熒光染料，可插入DNADNA雙螺旋結構的兩個雙螺旋結構的兩個堿基對之間，與堿基對之間，與DNADNA分子形成絡合物，在紫外光的激發(fā)分子形成絡合物，在紫外光的激發(fā)(jf)(j

5、f)下發(fā)出橙黃色的熒光。下發(fā)出橙黃色的熒光。第11頁/共30頁第十二頁，共31頁。第12頁/共30頁第十三頁，共31頁。瓊脂糖凝膠電泳分離核酸瓊脂糖凝膠電泳分離核酸(h sun)的影響因素的影響因素第13頁/共30頁第十四頁，共31頁。瓊脂糖凝膠電泳具有以下瓊脂糖凝膠電泳具有以下(yxi)優(yōu)點：優(yōu)點：（1 1）操作簡單、制備容易快速、凝膠機械性能好、電泳速度）操作簡單、制備容易快速、凝膠機械性能好、電泳速度(sd)(sd)快、分離快、分離DNADNA片段范圍廣、樣品不需事先處理就可以進行電片段范圍廣、樣品不需事先處理就可以進行電泳。泳。（2 2）凝膠結構均勻，對樣品吸附小，電泳圖譜清晰，分辨率

6、高，重）凝膠結構均勻，對樣品吸附小，電泳圖譜清晰，分辨率高，重復性好。復性好。（3 3）瓊脂糖透明無紫外吸收，電泳過程和結果可直接用紫外光檢測）瓊脂糖透明無紫外吸收，電泳過程和結果可直接用紫外光檢測及定量測定。及定量測定。（4 4）電泳后區(qū)帶易染色，樣品極易洗脫，便于定量測定。制成干膜）電泳后區(qū)帶易染色，樣品極易洗脫，便于定量測定。制成干膜可長期保存?？砷L期保存。因此，瓊脂糖凝膠電泳已成為分子生物學及基因工程研究中常用因此，瓊脂糖凝膠電泳已成為分子生物學及基因工程研究中常用實驗方法之一，實驗方法之一， DNA DNA樣本的分離、純化、鑒定以及相對分子質量測定樣本的分離、純化、鑒定以及相對分子質

7、量測定常用瓊脂糖凝膠電泳。常用瓊脂糖凝膠電泳。第14頁/共30頁第十五頁，共31頁。 熒光熒光(ynggung)染料染料EB染色后，在紫外燈染色后，在紫外燈(305nm)下觀察到的電下觀察到的電泳結果：泳結果：第15頁/共30頁第十六頁，共31頁。 * * 熒光染料熒光染料EBEB染色的原理和優(yōu)點是什么？染色的原理和優(yōu)點是什么？ 1 1、原理：、原理： EB EB：即：即3,8-3,8-二氨基二氨基-5-5-乙基乙基-6-6-苯基菲錠溴鹽苯基菲錠溴鹽(Ethidium (Ethidium Bromide)Bromide)。 EB EB是一種扁平分子是一種扁平分子(fnz)(fnz)，它可以嵌入

8、核酸，它可以嵌入核酸的堿基之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅橙色熒光。的堿基之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅橙色熒光。 激發(fā)的熒光的能量來源于兩個方面：一是核酸吸收激發(fā)的熒光的能量來源于兩個方面：一是核酸吸收260nm260nm的紫外線后將能量傳遞給的紫外線后將能量傳遞給EBEB，二是，二是EBEB本身吸收本身吸收302nm302nm和和360nm360nm的紫外線的能量。這兩方面的能量最終激發(fā)的紫外線的能量。這兩方面的能量最終激發(fā)EBEB發(fā)射發(fā)射波長為波長為590nm590nm的可見光（紅橙區(qū)）。的可見光（紅橙區(qū)）。第16頁/共30頁第十七頁，共31頁。 2 2、優(yōu)點：、優(yōu)點：（1 1）染色比較簡便、

9、快捷，一般在）染色比較簡便、快捷，一般在101015min15min就就可反應?？煞磻＃? 2）EBEB對核酸分子無破壞對核酸分子無破壞(phui)(phui)作用，這是作用，這是其它染料所不能做其它染料所不能做 到的。到的。（3 3）EBEB靈敏度高，可檢測出靈敏度高，可檢測出10ng10ng或更少的或更少的DNADNA含含量。量。（4 4）既可用于）既可用于DNADNA也可用于也可用于RNARNA的檢測。的檢測。（5 5）EBEB可加到樣品中，也可加到凝膠中，可隨可加到樣品中，也可加到凝膠中，可隨時用紫外時用紫外 燈檢測電泳的進程和效果。燈檢測電泳的進程和效果。（6 6）EB-DNAEB

10、-DNA復合物中的復合物中的EBEB發(fā)出的熒光比游離的發(fā)出的熒光比游離的EBEB強強1010倍，倍， 因此不需洗凈凝膠中游離的因此不需洗凈凝膠中游離的EBEB也可檢測出也可檢測出DNADNA的條帶。的條帶。第17頁/共30頁第十八頁，共31頁。3 3、缺點：、缺點： 溴化乙啶是一種強的致突變劑，在操作和配溴化乙啶是一種強的致突變劑，在操作和配制試劑制試劑(shj)(shj)時應戴手套。含溴化乙啶的溶液時應戴手套。含溴化乙啶的溶液不能直接倒入下水道，應進行處理。不能直接倒入下水道，應進行處理。（1 1）每）每100ml100ml溶液中加入溶液中加入100mg100mg粉狀活性炭；粉狀活性炭；（2

11、 2）室溫下放置）室溫下放置1 1小時，不時的搖動；小時，不時的搖動；（3 3）用新華一號濾紙過濾，棄濾液；）用新華一號濾紙過濾，棄濾液；（4 4）用塑料袋封裝濾紙和活性炭，作為有害廢物）用塑料袋封裝濾紙和活性炭，作為有害廢物處理。處理。* *溴化乙啶在溴化乙啶在260260分解，在標準條件下進行焚化后分解，在標準條件下進行焚化后不會有危險性。不會有危險性。第18頁/共30頁第十九頁，共31頁。第19頁/共30頁第二十頁，共31頁。第20頁/共30頁第二十一頁，共31頁。自動取液器的構造自動取液器的使用吸入液體吸入液體 排出液體排出液體使用注意事項：不超量程使用；不倒置；使用完畢使用注意事項：

12、不超量程使用；不倒置；使用完畢(wnb)調至最大刻度上。調至最大刻度上。第21頁/共30頁第二十二頁，共31頁。第22頁/共30頁第二十三頁，共31頁。第23頁/共30頁第二十四頁，共31頁。第24頁/共30頁第二十五頁，共31頁。第25頁/共30頁第二十六頁，共31頁。8.8.凝膠板的制備：凝膠板的制備：（1 1）取瓊脂糖）取瓊脂糖0.7 g0.7 g，加，加1 1TBETBE緩沖溶液緩沖溶液100ml100ml，于沸水浴中至熔化，制成，于沸水浴中至熔化，制成0.7%0.7%的瓊脂糖膠液的瓊脂糖膠液。（2 2）膠床兩頭貼上防水膠帶，形成）膠床兩頭貼上防水膠帶，形成8mm8mm高的擋高的擋墻，

13、壓緊膠帶，置水平臺面上。墻，壓緊膠帶，置水平臺面上。（3 3）插入梳子）插入梳子(sh zi)(sh zi)，梳齒下端離板底，梳齒下端離板底0.50.51mm1mm。（4 4）g/mLg/mL的的EBEB溶液。溶液。（5 5）將）將6060凝膠不間斷倒入膠床，高凝膠不間斷倒入膠床，高3 34mm4mm，避免氣泡，搖勻，室溫下凝固。避免氣泡，搖勻，室溫下凝固。（6 6）完全凝固后，撕掉膠帶，置于電泳槽中，）完全凝固后，撕掉膠帶，置于電泳槽中，加入電泳緩沖液，高于膠面加入電泳緩沖液，高于膠面1 12mm2mm，從一頭輕，從一頭輕輕斜拉出梳子輕斜拉出梳子(sh zi)(sh zi)，除去產生的氣泡。

14、，除去產生的氣泡。第26頁/共30頁第二十七頁，共31頁。9.9.加樣：加樣： 將樣品將樣品DNADNA溶液與加樣緩沖液以溶液與加樣緩沖液以5 5 ：1 1的體積的體積比混合，用微量移液器加樣，每加完一個樣品，沖比混合，用微量移液器加樣，每加完一個樣品，沖洗三次。加樣量洗三次。加樣量151520 20 l l （加樣時應防止碰壞（加樣時應防止碰壞樣品孔周圍的凝膠面以及穿透樣品孔周圍的凝膠面以及穿透(chun tu)(chun tu)凝膠凝膠底部）。底部）。10.10.電泳：電泳： 為了獲得電泳分離為了獲得電泳分離DNADNA片段的最大分辨率，片段的最大分辨率，電場強度不應高于電場強度不應高于5

15、V/cm5V/cm（兩電極間的距離）開始（兩電極間的距離）開始時用較高電壓時用較高電壓(80V)(80V)，樣品一進入膠內則將電壓調，樣品一進入膠內則將電壓調至至5V/cm 5V/cm 。當染料前沿移至底邊。當染料前沿移至底邊1-2mm1-2mm時，電泳畢時，電泳畢。11. 11. 觀察觀察 關閉電源，取出膠床，在紫外檢測儀下觀察關閉電源，取出膠床，在紫外檢測儀下觀察凝膠中的凝膠中的DNADNA（紅橙色熒光）。（紅橙色熒光）。第27頁/共30頁第二十八頁，共31頁。五、思考題：五、思考題： 1 1、用熒光、用熒光(ynggung)(ynggung)染料染料EBEB染色的染色的原理和優(yōu)缺點是什么？原理和優(yōu)缺點是什么？