2-蛋白質(zhì)4 生物化學(xué)復(fù)習(xí)資料

1、2 2 蛋白質(zhì)化學(xué)蛋白質(zhì)化學(xué) 一級(jí)結(jié)構(gòu)一級(jí)結(jié)構(gòu)(41） : : 氨基酸序列和二硫鍵的位置氨基酸序列和二硫鍵的位置 二級(jí)結(jié)構(gòu)二級(jí)結(jié)構(gòu)(57）：主鏈規(guī)律的空間排列：主鏈規(guī)律的空間排列 ( (-螺旋螺旋, -, -折疊折疊) )超二級(jí)結(jié)構(gòu)超二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域（結(jié)構(gòu)域（domaindomain） 三級(jí)結(jié)構(gòu)三級(jí)結(jié)構(gòu)(70）：所有原子空間位置：所有原子空間位置 四級(jí)結(jié)構(gòu)四級(jí)結(jié)構(gòu)(83）：多肽鏈間的相互關(guān)系：多肽鏈間的相互關(guān)系 維持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的因素維持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的因素上節(jié)回顧上節(jié)回顧2.1 氨基酸2.2 肽2.3 蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)2.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系2.5 蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)2.6 蛋白

2、質(zhì)的分類2.7 蛋白質(zhì)的分離與鑒定2.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與 功能的關(guān)系一、一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系一、一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系( (49)49)二、空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系二、空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系1 1、一級(jí)結(jié)構(gòu)的種屬差異與分子進(jìn)化、一級(jí)結(jié)構(gòu)的種屬差異與分子進(jìn)化2 2、一級(jí)結(jié)構(gòu)的變異與分子病、一級(jí)結(jié)構(gòu)的變異與分子病1 1、核糖核酸酶、核糖核酸酶2 2、肌紅蛋白和血紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能、肌紅蛋白和血紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能3 3、瘋牛病、瘋牛病1 1、一級(jí)結(jié)構(gòu)的種屬差異與分子進(jìn)化、一級(jí)結(jié)構(gòu)的種屬差異與分子進(jìn)化 細(xì)胞色素細(xì)胞色素c c是一是一種進(jìn)化上高度保守的種進(jìn)化上高度保守的蛋白質(zhì)，在植物、動(dòng)蛋白質(zhì)，在植物、動(dòng)物和許多

3、單細(xì)胞生物物和許多單細(xì)胞生物中存在。中存在。 同源蛋白質(zhì)同源蛋白質(zhì)(homologous proteins)：來(lái)自不同種類：來(lái)自不同種類生物、而序列和功能類似的蛋白質(zhì)。生物、而序列和功能類似的蛋白質(zhì)。馬馬不變殘基：對(duì)于同源蛋白的功能是必需的不變殘基：對(duì)于同源蛋白的功能是必需的可變殘基：變換不影響蛋白質(zhì)的功能可變殘基：變換不影響蛋白質(zhì)的功能 黑猩猩黑猩猩響尾蛇響尾蛇鯉魚(yú)鯉魚(yú)蝸牛蝸牛酵母酵母蛾蛾花椰菜花椰菜羊羊 進(jìn)化距離越進(jìn)化距離越遠(yuǎn)，同源蛋白質(zhì)的遠(yuǎn)，同源蛋白質(zhì)的殘基差異數(shù)越多。殘基差異數(shù)越多。歐歐洲洲防防風(fēng)風(fēng) 根據(jù)細(xì)胞色素根據(jù)細(xì)胞色素C C的順序種屬差異建的順序種屬差異建立起來(lái)的進(jìn)化樹(shù)立起來(lái)的進(jìn)

4、化樹(shù)序列比較提供蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的信息序列比較提供蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的信息BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)程序：程序：程序程序數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢查詢內(nèi)容內(nèi)容Blastp蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)使用取代矩陣尋找較遠(yuǎn)的關(guān)系：可以使用取代矩陣尋找較遠(yuǎn)的關(guān)系：可以進(jìn)行進(jìn)行SEG過(guò)濾。過(guò)濾。Blastn核苷酸核苷酸核苷酸核苷酸尋找較高分值的匹配，對(duì)較遠(yuǎn)關(guān)系不尋找較高分值的匹配，對(duì)較遠(yuǎn)關(guān)系不太適用。太適用。Blastx核苷酸核苷酸(翻譯翻譯)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)對(duì)于新的對(duì)于新的DNA序列和序列和ESTs的分析極為的分析極為有用。有用。Tblastn蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)核苷酸核苷

5、酸(翻譯翻譯)對(duì)于尋找數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有標(biāo)注的編碼區(qū)對(duì)于尋找數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有標(biāo)注的編碼區(qū)極為有用。極為有用。tblastx核苷酸核苷酸(翻譯翻譯)核苷酸核苷酸(翻譯翻譯)對(duì)于分析對(duì)于分析EST極為有用。極為有用。 blastp:將待查詢的蛋白質(zhì)序列及其互補(bǔ)序列一起對(duì)蛋白質(zhì)將待查詢的蛋白質(zhì)序列及其互補(bǔ)序列一起對(duì)蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行查詢；序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行查詢；blastn:將待查詢的核酸序列及其互補(bǔ)序列一起對(duì)核酸序列將待查詢的核酸序列及其互補(bǔ)序列一起對(duì)核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行查詢；數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行查詢；blastx:先將待查詢的核酸序列按先將待查詢的核酸序列按6種可讀框架種可讀框架(逐個(gè)向前逐個(gè)向前3個(gè)個(gè)堿基和逐個(gè)向后堿

6、基和逐個(gè)向后3個(gè)堿基讀碼個(gè)堿基讀碼)翻譯成蛋白質(zhì)序列，然后將翻譯翻譯成蛋白質(zhì)序列，然后將翻譯結(jié)果對(duì)蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行查詢；結(jié)果對(duì)蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行查詢；tblastn:先將核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中的核酸序列按先將核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中的核酸序列按6種可讀框架種可讀框架翻譯成蛋白質(zhì)序列，然后將待查詢的蛋白質(zhì)序列及其互補(bǔ)序列翻譯成蛋白質(zhì)序列，然后將待查詢的蛋白質(zhì)序列及其互補(bǔ)序列對(duì)其翻譯結(jié)果進(jìn)行查詢；對(duì)其翻譯結(jié)果進(jìn)行查詢；tblastx:先將待查詢的核酸序列和核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中的核酸先將待查詢的核酸序列和核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中的核酸序列按序列按6種可讀框架翻譯成蛋白質(zhì)序列，然后再將種可讀框架翻譯成蛋白質(zhì)序列，然后再將

7、2種翻譯結(jié)果種翻譯結(jié)果從蛋白質(zhì)水平進(jìn)行查詢。從蛋白質(zhì)水平進(jìn)行查詢。使用使用BLAST的蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)：的蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)：數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)庫(kù)描述描述Nr融合了融合了Swiss-Prot,PIR,PRF以及從以及從GenBank序列編碼區(qū)中得到的序列編碼區(qū)中得到的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)和PDB中擁有原子坐標(biāo)的蛋白質(zhì)，絕非多余。中擁有原子坐標(biāo)的蛋白質(zhì)，絕非多余。MonthNr的字集，每月（的字集，每月（30天）更新，搜集了過(guò)去天）更新，搜集了過(guò)去30天中的最新序列。天中的最新序列。SwissprotSwiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)。數(shù)據(jù)庫(kù)。Pdb擁有三維空間結(jié)構(gòu)的原子坐標(biāo)的氨基酸序列庫(kù)。擁有三維空間結(jié)構(gòu)的原子坐標(biāo)的氨基

8、酸序列庫(kù)。Yeast由酵母基因組中基因編碼的全套蛋白質(zhì)。由酵母基因組中基因編碼的全套蛋白質(zhì)。ecoli有大腸桿菌基因組中基因編碼的全套蛋白質(zhì)。有大腸桿菌基因組中基因編碼的全套蛋白質(zhì)。一、一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系一、一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系( (49)49)二、空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系二、空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系1 1、一級(jí)結(jié)構(gòu)的種屬差異與分子進(jìn)化、一級(jí)結(jié)構(gòu)的種屬差異與分子進(jìn)化2 2、一級(jí)結(jié)構(gòu)的變異與分子病、一級(jí)結(jié)構(gòu)的變異與分子病1 1、核糖核酸酶、核糖核酸酶2 2、肌紅蛋白和血紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能、肌紅蛋白和血紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能3 3、瘋牛病、瘋牛病2 2、一級(jí)結(jié)構(gòu)的變異與分子病、一級(jí)結(jié)構(gòu)的變異與分子病 分子病

9、：由于基因突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變分子?。河捎诨蛲蛔儗?dǎo)致蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變異，使蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能減退或喪失，甚至造成生理異，使蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能減退或喪失，甚至造成生理功能的變化而引起的疾病。功能的變化而引起的疾病。鐮刀狀細(xì)胞貧血?。ǔＨ旧w隱性遺傳?。?形狀異常形狀異常的紅細(xì)胞會(huì)的紅細(xì)胞會(huì)阻塞小血管阻塞小血管而傷及多種而傷及多種器官。器官。 By By Linus PaulingLinus Pauling in 1949 in 1949. TraitPatient(Normal)(defective)Normal指紋圖譜指紋圖譜HbAHbS雙向?yàn)V紙層析電泳雙向?yàn)V紙層析電泳-+-+水

10、平向?yàn)殡娪舅较驗(yàn)殡娪敬怪毕驗(yàn)閷游龃怪毕驗(yàn)閷游鲆鹊鞍酌敢鹊鞍酌?患者的血紅蛋白（表示為患者的血紅蛋白（表示為Hb-SHb-S）與正常人的血紅蛋）與正常人的血紅蛋白（表示為白（表示為Hb-AHb-A）的）的 亞基有一個(gè)氨基酸殘基不同。亞基有一個(gè)氨基酸殘基不同。一、一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系一、一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系( (49)49)二、空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系二、空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系1 1、一級(jí)結(jié)構(gòu)的種屬差異與分子進(jìn)化、一級(jí)結(jié)構(gòu)的種屬差異與分子進(jìn)化2 2、一級(jí)結(jié)構(gòu)的變異與分子病、一級(jí)結(jié)構(gòu)的變異與分子病1 1、核糖核酸酶、核糖核酸酶2 2、肌紅蛋白和血紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能、肌紅蛋白和血紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能3 3、

11、瘋牛病、瘋牛病1 1、核糖核酸酶、核糖核酸酶 天然狀態(tài)，有催化活性天然狀態(tài)，有催化活性非折疊狀態(tài)，無(wú)活性非折疊狀態(tài)，無(wú)活性尿素尿素-巰基乙醇巰基乙醇一、一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系一、一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系( (49)49)二、空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系二、空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系1 1、一級(jí)結(jié)構(gòu)的種屬差異與分子進(jìn)化、一級(jí)結(jié)構(gòu)的種屬差異與分子進(jìn)化2 2、一級(jí)結(jié)構(gòu)的變異與分子病、一級(jí)結(jié)構(gòu)的變異與分子病1 1、核糖核酸酶、核糖核酸酶2 2、肌紅蛋白和血紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能、肌紅蛋白和血紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能3 3、瘋牛病、瘋牛病2 2、肌紅蛋白、肌紅蛋白（MyoglobinMyoglobin）和血紅蛋白和血紅蛋白（Hemo

12、globinHemoglobin）的結(jié)構(gòu)與功能的結(jié)構(gòu)與功能 血紅蛋白和肌紅蛋白的氧合曲線血紅蛋白和肌紅蛋白的氧合曲線靜脈血靜脈血?jiǎng)用}血?jiǎng)用}血血紅蛋白血紅蛋白肌紅蛋白肌紅蛋白氧分壓氧分壓氧氧飽飽和和度度 別構(gòu)效應(yīng)別構(gòu)效應(yīng)( (allosteric effect)allosteric effect)：又稱變構(gòu)效應(yīng)，：又稱變構(gòu)效應(yīng)，是指寡聚蛋白與配基結(jié)合，改變蛋白質(zhì)構(gòu)象，導(dǎo)致蛋是指寡聚蛋白與配基結(jié)合，改變蛋白質(zhì)構(gòu)象，導(dǎo)致蛋白質(zhì)生物活性改變的現(xiàn)象白質(zhì)生物活性改變的現(xiàn)象. .一個(gè)亞基與氧結(jié)合后，引起該亞一個(gè)亞基與氧結(jié)合后，引起該亞基構(gòu)象改變基構(gòu)象改變進(jìn)而引起另三個(gè)亞基的構(gòu)象改變進(jìn)而引起另三個(gè)亞基的構(gòu)象改

13、變整個(gè)分子構(gòu)象改變整個(gè)分子構(gòu)象改變與氧的結(jié)合能力增加與氧的結(jié)合能力增加血紅蛋白的別構(gòu)效應(yīng)血紅蛋白的別構(gòu)效應(yīng)齊變模式（齊變模式（concerted model）：）：由于一個(gè)底物或別構(gòu)調(diào)節(jié)劑的由于一個(gè)底物或別構(gòu)調(diào)節(jié)劑的結(jié)合，蛋白質(zhì)的構(gòu)相在結(jié)合，蛋白質(zhì)的構(gòu)相在T（對(duì)底物親和性低的構(gòu)象）和（對(duì)底物親和性低的構(gòu)象）和R（對(duì)底（對(duì)底物親和性高的構(gòu)象）之間變換。這一模式提出所有蛋白質(zhì)的亞物親和性高的構(gòu)象）之間變換。這一模式提出所有蛋白質(zhì)的亞基都具有相同的構(gòu)象，或是基都具有相同的構(gòu)象，或是T構(gòu)象，或是構(gòu)象，或是R構(gòu)象。構(gòu)象。序變模式（序變模式（sequential model）：）：一個(gè)配體的結(jié)合會(huì)誘導(dǎo)它結(jié)

14、合一個(gè)配體的結(jié)合會(huì)誘導(dǎo)它結(jié)合的亞基的三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，并使相鄰亞基的構(gòu)象發(fā)生很大的變的亞基的三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，并使相鄰亞基的構(gòu)象發(fā)生很大的變化。按照序變模式，只有一個(gè)亞基對(duì)配體具有高的親和力。化。按照序變模式，只有一個(gè)亞基對(duì)配體具有高的親和力。緊張狀態(tài)緊張狀態(tài) 松弛狀態(tài)松弛狀態(tài)一、一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系一、一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系( (49)49)二、空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系二、空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系1 1、一級(jí)結(jié)構(gòu)的種屬差異與分子進(jìn)化、一級(jí)結(jié)構(gòu)的種屬差異與分子進(jìn)化2 2、一級(jí)結(jié)構(gòu)的變異與分子病、一級(jí)結(jié)構(gòu)的變異與分子病1 1、核糖核酸酶、核糖核酸酶2 2、肌紅蛋白和血紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能、肌紅蛋白和血紅蛋白的結(jié)

15、構(gòu)與功能3 3、瘋牛病、瘋牛病蛋白質(zhì)構(gòu)象疾病：若蛋白質(zhì)的折疊發(fā)生錯(cuò)誤，蛋白質(zhì)構(gòu)象疾?。喝舻鞍踪|(zhì)的折疊發(fā)生錯(cuò)誤，盡管其一級(jí)結(jié)構(gòu)不變，但蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生改變，盡管其一級(jí)結(jié)構(gòu)不變，但蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生改變，仍可影響其功能，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致疾病發(fā)生。仍可影響其功能，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致疾病發(fā)生。 生物體內(nèi)的每一個(gè)基因均受到來(lái)自生物演化生物體內(nèi)的每一個(gè)基因均受到來(lái)自生物演化的選擇壓，其結(jié)果是每個(gè)蛋白質(zhì)均有其獨(dú)特（和的選擇壓，其結(jié)果是每個(gè)蛋白質(zhì)均有其獨(dú)特（和唯一的）的立體的結(jié)構(gòu)，和生化生理功能。唯一的）的立體的結(jié)構(gòu)，和生化生理功能。蛋白質(zhì)構(gòu)象改變導(dǎo)致疾病的機(jī)理蛋白質(zhì)構(gòu)象改變導(dǎo)致疾病的機(jī)理：有些蛋：有些蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊后相

16、互聚集，常形成抗蛋白水解白質(zhì)錯(cuò)誤折疊后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉樣纖維沉淀，產(chǎn)生毒性而致病，表現(xiàn)酶的淀粉樣纖維沉淀，產(chǎn)生毒性而致病，表現(xiàn)為蛋白質(zhì)淀粉樣纖維沉淀的病理改變。為蛋白質(zhì)淀粉樣纖維沉淀的病理改變。這類疾病包括這類疾病包括：人紋狀體脊髓變性病、老：人紋狀體脊髓變性病、老年癡呆癥、亨停頓舞蹈病、瘋牛病等。年癡呆癥、亨停頓舞蹈病、瘋牛病等。43%-helix30%-helix43%-sheet 一條肽一條肽鏈對(duì)應(yīng)一鏈對(duì)應(yīng)一個(gè)特定的個(gè)特定的空間結(jié)構(gòu)空間結(jié)構(gòu). . 這條法這條法則的破壞則的破壞是災(zāi)難性是災(zāi)難性的。導(dǎo)致的。導(dǎo)致瘋牛病的瘋牛病的就就是一個(gè)例是一個(gè)例子。子。瘋牛病中的蛋白質(zhì)構(gòu)象

17、改變瘋牛病中的蛋白質(zhì)構(gòu)象改變瘋牛病是由朊病毒蛋白瘋牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, (prion protein, PrP)PrP)引起的一組人和動(dòng)物神經(jīng)退行性病變。引起的一組人和動(dòng)物神經(jīng)退行性病變。正常的正常的PrPPrP富含富含-螺旋，稱為螺旋，稱為PrPPrPc c。PrPPrPc c在某種蛋白的作用下可轉(zhuǎn)變成全為在某種蛋白的作用下可轉(zhuǎn)變成全為-折疊的折疊的PrPPrPscsc，從而致病。，從而致病。PrPPrPc c-螺旋螺旋PrPPrPscsc-折疊折疊正常正常瘋牛病瘋牛病PrionPrion在病理組織中的纖維狀聚合體在病理組織中的纖維狀聚合體2.1 氨基酸2.2 肽

18、2.3 蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)2.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系2.5 蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)2.6 蛋白質(zhì)的分類2.7 蛋白質(zhì)的分離與鑒定2.5 蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)蛋白質(zhì)的分離與鑒定蛋白質(zhì)的分離與鑒定兩性解離及等電點(diǎn)兩性解離及等電點(diǎn)膠體性質(zhì)膠體性質(zhì)沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng)變性與復(fù)性變性與復(fù)性紫外吸收與呈色反應(yīng)紫外吸收與呈色反應(yīng)沉降速度法沉降速度法鹽析分離鹽析分離離子交換層析離子交換層析疏水層析疏水層析凝膠過(guò)濾層析凝膠過(guò)濾層析親和層析親和層析蛋白質(zhì)電泳蛋白質(zhì)電泳-SDS-SDS丙烯酰胺凝膠電丙烯酰胺凝膠電泳（泳（SDS-PAGESDS-PAGE）1 1、沉降速度法、沉降速度法用光學(xué)方法測(cè)定界面移動(dòng)的速度即為蛋白質(zhì)的離用

19、光學(xué)方法測(cè)定界面移動(dòng)的速度即為蛋白質(zhì)的離心沉降速度心沉降速度蛋白質(zhì)的沉降速度與分子大小和形狀有關(guān)蛋白質(zhì)的沉降速度與分子大小和形狀有關(guān)沉降系數(shù)是溶質(zhì)顆粒在單位離心場(chǎng)中的沉降速度，沉降系數(shù)是溶質(zhì)顆粒在單位離心場(chǎng)中的沉降速度，用用s s表示。表示。一個(gè)一個(gè)S S單位，為單位，為1 11010-13-13秒秒相對(duì)分子質(zhì)量越大，相對(duì)分子質(zhì)量越大，S S值越大值越大蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)：蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)：1 1200S200S2 2 凝凝膠膠過(guò)過(guò)濾濾法法(35)葡聚糖葡聚糖凝膠珠凝膠珠 基于蛋白基于蛋白質(zhì)分子在質(zhì)分子在大大小小和和形狀形狀的的差異差異3 3、蛋白質(zhì)電泳、蛋白質(zhì)電泳SDSSDS聚丙烯酰胺凝膠電泳

20、法聚丙烯酰胺凝膠電泳法(38)聚丙烯酰胺凝膠：大小、形狀和電荷數(shù)量聚丙烯酰胺凝膠：大小、形狀和電荷數(shù)量SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝膠：大小聚丙烯酰胺凝膠：大小帶負(fù)電（帶負(fù)電（SDSSDS帶負(fù)電）帶負(fù)電）荷質(zhì)比相同（分子大，結(jié)合荷質(zhì)比相同（分子大，結(jié)合SDSSDS多；分子小，結(jié)合多；分子小，結(jié)合SDSSDS少）少）棒狀棒狀十二烷基十二烷基硫酸鈉硫酸鈉十二烷基硫酸鈉十二烷基硫酸鈉用用SDS-PAGE測(cè)定蛋白質(zhì)的測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量相對(duì)分子質(zhì)量雙向電泳雙向電泳二、蛋白質(zhì)的兩性解離及等電點(diǎn)二、蛋白質(zhì)的兩性解離及等電點(diǎn) 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pHpH時(shí)，蛋白質(zhì)解離成正、負(fù)時(shí)，蛋白質(zhì)

21、解離成正、負(fù)離子的趨勢(shì)相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時(shí)離子的趨勢(shì)相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時(shí)溶液的溶液的pHpH稱為蛋白質(zhì)的稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)等電點(diǎn)(isoelectric point, (isoelectric point, pI)pI) 。 在不含任何鹽的純水中進(jìn)行等電點(diǎn)測(cè)定，此時(shí)測(cè)得在不含任何鹽的純水中進(jìn)行等電點(diǎn)測(cè)定，此時(shí)測(cè)得的等電點(diǎn)稱為蛋白質(zhì)的等離子點(diǎn)。的等電點(diǎn)稱為蛋白質(zhì)的等離子點(diǎn)。pH=pI 凈電荷凈電荷=0=0pHpI凈電荷為負(fù)凈電荷為負(fù)PrCOOHNH3+ + H+ OH- + H+ OH-PrCOO-NH2PrCOO-NH3+pHpI凈電荷為正凈電荷為正 電泳：

22、在外電場(chǎng)的作用下，帶電顆粒，將電泳：在外電場(chǎng)的作用下，帶電顆粒，將向著與其電性相反的電極移動(dòng)。向著與其電性相反的電極移動(dòng)。 例如，不處于等電狀態(tài)的蛋白質(zhì)分子例如，不處于等電狀態(tài)的蛋白質(zhì)分子 蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)，相同電荷間的相互排斥，蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)，相同電荷間的相互排斥，最不穩(wěn)定，溶解度最小，極易形成沉淀析出；粘最不穩(wěn)定，溶解度最小，極易形成沉淀析出；粘度、滲透壓、膨脹性和導(dǎo)電能力均為最小度、滲透壓、膨脹性和導(dǎo)電能力均為最小三、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)三、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)透透析析四、蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)四、蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)+帶正電荷的蛋白質(zhì)帶正電荷的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)在等

23、電點(diǎn)的蛋白質(zhì)水化水化膜膜+帶正電荷的蛋白質(zhì)帶正電荷的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒酸酸堿堿酸酸堿堿酸酸堿堿脫水作用脫水作用脫水作用脫水作用脫水作用脫水作用溶液中蛋白質(zhì)的聚沉溶液中蛋白質(zhì)的聚沉沉淀方法類別沉淀方法類別: : 1 1、高濃度中性鹽、高濃度中性鹽(32) 2 2、有機(jī)溶劑、有機(jī)溶劑 3 3、重金屬鹽、重金屬鹽 4 4、生物堿試劑、生物堿試劑 鹽析法鹽析法: :在蛋白質(zhì)溶液中加入高濃度的中性鹽，可在蛋白質(zhì)溶液中加入高濃度的中性鹽，可有效地破壞蛋白質(zhì)顆粒的水化層。同時(shí)又中和了蛋白質(zhì)有效地破壞蛋白質(zhì)顆粒的水化層。同時(shí)又中和了蛋白質(zhì)表面的電荷，從而

24、使蛋白質(zhì)顆粒集聚而生成沉淀，這種表面的電荷，從而使蛋白質(zhì)顆粒集聚而生成沉淀，這種現(xiàn)象稱為鹽析（現(xiàn)象稱為鹽析（salting outsalting out）。）。 分段鹽析分段鹽析：不同蛋白質(zhì)析出時(shí)需要的鹽濃度不同，：不同蛋白質(zhì)析出時(shí)需要的鹽濃度不同，調(diào)節(jié)鹽濃度以使混合蛋白質(zhì)溶液中的幾種蛋白質(zhì)分段析調(diào)節(jié)鹽濃度以使混合蛋白質(zhì)溶液中的幾種蛋白質(zhì)分段析出，這種方法稱為分段鹽析。出，這種方法稱為分段鹽析。 鹽溶鹽溶: :通過(guò)提高中性鹽濃度，在低離子強(qiáng)度溶液中通過(guò)提高中性鹽濃度，在低離子強(qiáng)度溶液中使蛋白質(zhì)溶解度增加，這是因蛋白質(zhì)的荷電基團(tuán)由于活使蛋白質(zhì)溶解度增加，這是因蛋白質(zhì)的荷電基團(tuán)由于活度系數(shù)降低而趨

25、于穩(wěn)定所致。度系數(shù)降低而趨于穩(wěn)定所致。五、蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性五、蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性( (78)78) 在某些物理和化學(xué)因素作用下，其特定的空間構(gòu)象在某些物理和化學(xué)因素作用下，其特定的空間構(gòu)象被破壞，也即有序的空間結(jié)構(gòu)變成無(wú)序的空間結(jié)構(gòu)，從被破壞，也即有序的空間結(jié)構(gòu)變成無(wú)序的空間結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致其理化性質(zhì)改變和生物活性的喪失。而導(dǎo)致其理化性質(zhì)改變和生物活性的喪失。2 2、變性的本質(zhì)、變性的本質(zhì) 破壞非共價(jià)鍵和二硫鍵，不改變蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)破壞非共價(jià)鍵和二硫鍵，不改變蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)1 1、蛋白質(zhì)的變性、蛋白質(zhì)的變性(denaturation)(denaturation)3 3、蛋白質(zhì)的變性伴有的表

26、現(xiàn)、蛋白質(zhì)的變性伴有的表現(xiàn)喪失生物活性喪失生物活性溶解度降低，粘度增大，擴(kuò)散系數(shù)變小溶解度降低，粘度增大，擴(kuò)散系數(shù)變小某些原來(lái)埋藏再蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的疏水側(cè)鏈基某些原來(lái)埋藏再蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的疏水側(cè)鏈基團(tuán)暴露于變性蛋白質(zhì)表面，導(dǎo)致光學(xué)性質(zhì)變化團(tuán)暴露于變性蛋白質(zhì)表面，導(dǎo)致光學(xué)性質(zhì)變化對(duì)蛋白酶降解的敏感性增大對(duì)蛋白酶降解的敏感性增大4 4、復(fù)性、復(fù)性 若蛋白質(zhì)變性程度較輕，去除變性因素后，蛋白若蛋白質(zhì)變性程度較輕，去除變性因素后，蛋白質(zhì)仍可恢復(fù)或部分恢復(fù)其原有的構(gòu)象和功能，稱為復(fù)質(zhì)仍可恢復(fù)或部分恢復(fù)其原有的構(gòu)象和功能，稱為復(fù)性性(renaturation) (renaturation) 。Native

27、 ribonucleaseDenative reduced ribonucleaseNative ribonuclease8 M urea and -mercapotoethanolDialysis變性變性復(fù)性復(fù)性核糖核酸酶變性與復(fù)性作用六、蛋白質(zhì)的紫外吸收與呈色反應(yīng)六、蛋白質(zhì)的紫外吸收與呈色反應(yīng)1 1、蛋白質(zhì)的紫外吸收、蛋白質(zhì)的紫外吸收 在在280nm280nm波長(zhǎng)處有特征光吸收。蛋白質(zhì)的波長(zhǎng)處有特征光吸收。蛋白質(zhì)的ODOD280280與與其濃度呈正比關(guān)系，因此可作蛋白質(zhì)定量測(cè)定。其濃度呈正比關(guān)系，因此可作蛋白質(zhì)定量測(cè)定。蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/ /（mg/mlmg/ml）=1.55A=1.55A1cm 1cm - - 0.76A 0.76A1cm1cm280 280 260260測(cè)定范圍：測(cè)定范圍：0.10.10.5mg/ml0.5mg/ml2 2、蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)、蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng) 氨基酸與水化茚三酮氨基酸與水化茚三酮( (苯丙環(huán)三酮戊烴苯丙環(huán)三酮戊烴) )作作用時(shí)，產(chǎn)生藍(lán)色反應(yīng)用時(shí)，產(chǎn)生藍(lán)色反應(yīng)茚三酮反應(yīng)茚三酮反應(yīng)(Ninhydrin Reaction)(Ninhydrin Reaction) 蛋白質(zhì)在堿性溶液中與硫酸銅作用呈現(xiàn)紫紅色，蛋