第3章生化(劉建華)

1、BiochemistrySixth EditionChapter 3:Exploring Proteins and ProteomesCopyright 2007 by W. H. Freeman and Company Berg Tymoczko Stryer 奶汁是所有哺乳動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)源。奶汁含有不同蛋白質(zhì)。用MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)研究奶汁的蛋白質(zhì)組成，依靠蛋白分子質(zhì)量/電荷比將奶汁蛋白質(zhì)各組分分開(kāi)。1. 幾乎在所有的生物過(guò)程中，蛋白質(zhì)都起關(guān)幾乎在所有的生物過(guò)程中，蛋白質(zhì)都起關(guān)鍵作用。生物化學(xué)的主要內(nèi)容包括蛋白質(zhì)鍵作用。生物化學(xué)的主要內(nèi)容包括蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能，以及蛋白質(zhì)執(zhí)行其生物功能結(jié)構(gòu)

2、和功能，以及蛋白質(zhì)執(zhí)行其生物功能的分子機(jī)制。的分子機(jī)制。2. 對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行深入研究有賴(lài)于純化蛋白質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行深入研究有賴(lài)于純化蛋白質(zhì)的獲得。有了純化蛋白，你能確定蛋白質(zhì)的獲得。有了純化蛋白，你能確定蛋白質(zhì)序列、測(cè)定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)、制備相應(yīng)的序列、測(cè)定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)、制備相應(yīng)的抗體進(jìn)行細(xì)胞定位、分析蛋白質(zhì)功能、研抗體進(jìn)行細(xì)胞定位、分析蛋白質(zhì)功能、研究蛋白質(zhì)執(zhí)行其功能的機(jī)制。究蛋白質(zhì)執(zhí)行其功能的機(jī)制。3. 可以從說(shuō)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得相關(guān)的數(shù)可以從說(shuō)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得相關(guān)的數(shù)據(jù)，尤其是序列數(shù)據(jù)，有助于你的研究。據(jù)，尤其是序列數(shù)據(jù)，有助于你的研究?；蚪M和蛋白質(zhì)組基因組和蛋白質(zhì)組1. 基因組：基

3、因組：一種生物的全基因組序列以及對(duì)DNA序列進(jìn)行的基因注釋。基因組信息提供了生物體各種基因，以及這些基因所編碼的功能產(chǎn)物?；蚪M是靜態(tài)的。2. 蛋白質(zhì)組：蛋白質(zhì)組：特定條件下，基因組的蛋白質(zhì)表達(dá)形式。包括該條件下蛋白質(zhì)種類(lèi)、結(jié)構(gòu)、修飾、功能、以及蛋白質(zhì)之間的相互作用等。不同類(lèi)型的細(xì)胞、同一類(lèi)型不同發(fā)育狀態(tài)的細(xì)胞、不同環(huán)境的同一類(lèi)型細(xì)胞將有不同的蛋白質(zhì)組。由于生物修飾蛋白方式多樣，因此蛋白質(zhì)組比基因組大得多。蛋白質(zhì)組是動(dòng)態(tài)的。研究蛋白質(zhì)功能的第一步是純化蛋白質(zhì)生物化學(xué)有個(gè)諺語(yǔ)：“別在不純的蛋白質(zhì)上別在不純的蛋白質(zhì)上浪費(fèi)你完美的思路。浪費(fèi)你完美的思路?！苯⒏櫮繕?biāo)蛋白的方案：建立跟蹤目標(biāo)蛋白的方

4、案：測(cè)活；電泳；標(biāo)記；測(cè)活；電泳；標(biāo)記；抗體免疫等抗體免疫等蛋白質(zhì)釋放，離心使混合物分級(jí)蛋白質(zhì)釋放，離心使混合物分級(jí)透析去除小分子透析去除小分子（依據(jù)分子大小差異）（依據(jù)分子大小差異）凝膠過(guò)濾層析凝膠過(guò)濾層析 (記住分子越大，流過(guò)愈快)。離子交換層析離子交換層析， 依據(jù)蛋白質(zhì)的凈電荷差異離子交換層析的介質(zhì)離子交換層析的介質(zhì)陽(yáng)離子交換 陰離子交換親和層析：親和層析：依靠配基與蛋白質(zhì)之間特異的親和性。HPLC ( (凝膠過(guò)濾柱凝膠過(guò)濾柱) ) 支持物顆粒細(xì)，分離效果好，但需要施加高壓才有合理的流速。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳速度 u = Ez/f (1)球狀分子 f = 6

5、p h r (2)+ -mercaptoethanol破壞二硫鍵破壞二硫鍵每個(gè)SDS分子能夠結(jié)合多肽鏈的兩個(gè)氨基酸SDS-PAGE能夠測(cè)定多肽鏈的質(zhì)量。等電聚焦凝膠電泳二二維維凝凝膠膠電電泳泳大大腸腸桿桿菌菌的的二二維維電電泳泳結(jié)結(jié)果果純化方案合理性評(píng)價(jià)（考慮純化度和回收率）純化方案合理性評(píng)價(jià)（考慮純化度和回收率）超速離心分離大分子、測(cè)定大分子質(zhì)量超速離心分離大分子、測(cè)定大分子質(zhì)量1. 超速離心能分離大分子、測(cè)定大分子質(zhì)量。2. 能夠確定大分子形狀、密度、質(zhì)量等參數(shù)。3. 研究分子之間的相互作用。 在離心條件下，一個(gè)顆粒穿過(guò)液相介質(zhì)的移動(dòng)速率用沉降系數(shù)s表示： s = m (1-n r) /f

6、 其中m是顆粒的質(zhì)量，n是顆粒的體積（根據(jù)顆粒的密度計(jì)算)，r是離心介質(zhì)的密度，f是摩擦系數(shù)（顆粒形狀的評(píng)價(jià)參數(shù))。(1-nr)就是離心介質(zhì)施加給顆粒的浮力。1. 顆粒的沉降速度部分取決于該顆粒的質(zhì)量質(zhì)量。如果形狀和密度相同，質(zhì)量越大的顆粒沉降速度愈快。2. 形狀也影響沉降速度(因?yàn)轭w粒的形狀會(huì)影響顆粒沉降的粘度)。質(zhì)量和密度相同，球形顆粒摩擦系數(shù)小，沉降速度快。3. 質(zhì)量和形狀相同，顆粒密度大，浮力(1-nr)小，其沉降速度快。4. 沉降速度也依賴(lài)于溶液密度（r）。溶液r 大，顆粒沉降慢。實(shí)際上，nr 1顆粒上??；當(dāng)nr = 1顆粒不移動(dòng)； nr 1顆粒上浮。沉降系數(shù)單位是沉降系數(shù)單位是Sv

7、edberg單位單位(S)，相當(dāng)于，相當(dāng)于10-13s。S值愈小，在離心場(chǎng)移動(dòng)愈慢。值愈小，在離心場(chǎng)移動(dòng)愈慢。圖圖3.14 3.14 細(xì)胞組分的密度和沉降系數(shù)。細(xì)胞組分的密度和沉降系數(shù)。制備密度梯度制備密度梯度介質(zhì)用于密度介質(zhì)用于密度梯度離心。梯度離心。上樣上樣水平離心。水平離心?；厥找呀?jīng)分離回收已經(jīng)分離的蛋白質(zhì)條帶的蛋白質(zhì)條帶 離心沉降平衡技術(shù)能直接用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量。此時(shí)離心速度較慢使蛋白此時(shí)離心速度較慢使蛋白質(zhì)沉降和蛋白質(zhì)擴(kuò)散達(dá)到平衡質(zhì)沉降和蛋白質(zhì)擴(kuò)散達(dá)到平衡。用離心沉降平衡技術(shù)測(cè)定的蛋白質(zhì)質(zhì)量非常準(zhǔn)確非常準(zhǔn)確，條件溫和、保留多亞基蛋白質(zhì)天然的四級(jí)多亞基蛋白質(zhì)天然的四級(jí)結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)。而

8、SDS-PAGE只能提供解離多肽鏈解離多肽鏈的質(zhì)量質(zhì)量。注意，如果我們既知道一個(gè)多聚體蛋白質(zhì)在變性條件下各個(gè)多肽的估算值，也知道沉降平衡離心的完整多亞基蛋白的質(zhì)量，我們就能夠確定該多亞基蛋白各個(gè)多肽鏈的拷貝數(shù)。蛋白質(zhì)氨基酸組成分析蛋白質(zhì)氨基酸組成分析1. 6N HCl，110oC加熱24小時(shí) 2. 用離子交換層析分離氨基酸，根據(jù)出峰體積確定各氨基酸組分（圖3.16）。3. 除了脯氨酸外，用茚三酮處理氨基酸產(chǎn)生深藍(lán)藍(lán)色色（但脯氨酸顯黃色黃色)。茚三酮衍生物的光吸收與氨基酸濃度成正比（氨基酸檢測(cè)極限：1微克或10 nmol，相當(dāng)于一個(gè)指紋的氨基酸含量）。用熒光胺代替茚三酮更靈敏，低至一奈克（10

9、pmol）的氨基酸也可以測(cè)出。 洗滌采用洗滌采用pH值逐漸增加的檸檬酸鈉溶液。值逐漸增加的檸檬酸鈉溶液。熒光胺熒光胺 茚三酮茚三酮 Figure 3.18. The Edman Degradation. The labeled amino-terminal residue (PTH-alanine in the first round) can be released without hydrolyzing the rest of the peptide. Three more rounds of the Edman degradation reveal the complete sequen

10、ce of the original peptide.Figure 3.19. Separation of PTH-Amino Acids. PTH-amino acids can be rapidly separated by HPLC. In this HPLC profile, a mixture of PTH-amino acids is clearly resolved into its components.An unknown amino acid can be identified by its elution position relative to the known on

11、es.Edman降解的降解的長(zhǎng)度不能超過(guò)長(zhǎng)度不能超過(guò)50氨基酸。氨基酸。CNBr斷裂多肽鏈的位點(diǎn)：斷裂多肽鏈的位點(diǎn)：Met-XTrypsin斷裂多肽鏈的位點(diǎn)：斷裂多肽鏈的位點(diǎn)：Lys-X Arg-X圖3.22 重疊肽段?；谝饶榈鞍酌该盖泻蟮碾亩闻c胰蛋白酶酶切后的肽段序列重疊，構(gòu)建肽段排列順序。 二硫鍵交聯(lián)多肽鏈的分離二硫鍵交聯(lián)多肽鏈的分離：（1）用還原試劑如）用還原試劑如b b-巰基乙?guī)€基乙醇或醇或DTT處理。處理。（2）然后用碘代乙酸處理）然后用碘代乙酸處理將巰基烷基化形成穩(wěn)定的將巰基烷基化形成穩(wěn)定的S-羧甲基衍生物，能夠阻止半羧甲基衍生物，能夠阻止半胱氨酸重新氧化形成二硫鍵胱氨酸重新氧

12、化形成二硫鍵（圖（圖3.23）。）。 對(duì)角線(xiàn)電泳技術(shù)對(duì)角線(xiàn)電泳技術(shù) (diagonal electrophoresis) ：確定蛋白：確定蛋白質(zhì)的二硫鍵位置。第一步在質(zhì)的二硫鍵位置。第一步在二硫鍵保持完整的條件下裂二硫鍵保持完整的條件下裂解蛋白質(zhì)。將裂解混合物上解蛋白質(zhì)。將裂解混合物上樣到點(diǎn)用用濾紙的一個(gè)角落樣到點(diǎn)用用濾紙的一個(gè)角落，沿一個(gè)方向電泳。第二步，沿一個(gè)方向電泳。第二步將濾紙置于過(guò)甲酸蒸汽環(huán)境將濾紙置于過(guò)甲酸蒸汽環(huán)境中，二硫鍵發(fā)生斷裂生成磺中，二硫鍵發(fā)生斷裂生成磺酸類(lèi)半胱氨酸。采用同樣的酸類(lèi)半胱氨酸。采用同樣的條件，在垂直方向電泳。條件，在垂直方向電泳。確定二硫鍵位置確定二硫鍵位置蛋

13、白質(zhì)氨基酸序列用途蛋白質(zhì)氨基酸序列用途u了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能。了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能。氨基酸序列與序列已知蛋白質(zhì)進(jìn)行比較，尋找序列相似性，確定該蛋白質(zhì)的家族屬性。推測(cè)該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能。u研究蛋白質(zhì)進(jìn)化。研究蛋白質(zhì)進(jìn)化。與不同物種的同一蛋白進(jìn)行序列比較，找出該蛋白質(zhì)的進(jìn)化關(guān)系。u搜尋內(nèi)部的序列重復(fù)。搜尋內(nèi)部的序列重復(fù)。搜尋蛋白質(zhì)內(nèi)部有無(wú)重復(fù)序列。內(nèi)部重復(fù)能揭示蛋白質(zhì)本身的進(jìn)化史。很很多蛋白質(zhì)是原型基因重復(fù)后差異化的結(jié)果。多蛋白質(zhì)是原型基因重復(fù)后差異化的結(jié)果。u了解了解定位信號(hào)定位信號(hào)的有無(wú)。的有無(wú)。u作為抗原制備抗體。作為抗原制備抗體。u基因探針?；蛱结?。Figure 3.25. Repea

14、ting Motifs in a Protein Chain. Calmodulin, a calcium sensor, contains four similar units in a single polypeptide chain shown in red, yellow, blue, and orange. Each unit binds a calcium ion (shown in green).重組重組DNA技術(shù)技術(shù)極大地促進(jìn)蛋白質(zhì)序列測(cè)定。Figure 3.27. Antibody Structure. (A) IgG antibodies consist of four c

15、hains, two heavy chains (blue) and two light chains (red), linked by disulfide bonds. The heavy and light chains come together to form Fab domains, which have the antigen-binding sites at the ends. The two heavy chains form the Fc domain. The Fab domains are linked to the Fc domain by flexible linke

16、rs. (B) A more schematic representation of an IgG molecule.Figure 3.28. Antigen-Antibody Interactions. A protein antigen, in this case lysozyme, binds to the end of an Fabdomain from an antibody. The end of the antibody and the antigen have complementary shapes, allowing a largeamount of surface to

17、be buried on binding.Figure 3.29. Polyclonal and Monoclonal Antibodies. Most antigens have several epitopes. Polyclonal antibodies areheterogeneous mixtures of antibodies, each specific for one of the various epitopes on an antigen. Monoclonal antibodiesare all identical, produced by clones of a sin

18、gle antibody-producing cell. They recognize one specific epitope.Figure 3.30. Preparation of Monoclonal Abs. Hybridoma cells are formed by fusion of antibody-producingcells and myeloma cells. The hybrid cells are allowed to proliferate by growing them in selective medium. They are thenscreened to de

19、termine which ones produce antibody of the desired specificity.Figure 4.31. Fluorescence Micrograph of a Developing Drosophila Embryo. The embryo was stained with afluorescent-labeled monoclonal antibody for the DNA-binding protein encoded by engrailed, an essential gene inspecifying the body plan.F

20、igure 3.32. Indirect ELISA and Sandwich ELISA (A) In indirect ELISA, the production of color indicates the amount of an antibody to a specific antigen. (B) In sandwich ELISA, the production of color indicates the quantity of antigen.測(cè)抗體測(cè)抗體測(cè)抗原測(cè)抗原Figure 3.33. Western Blotting. Proteins on an SDS-polya

21、crylamide gel are transferred to a polymer sheet and stained with radioactive antibody. A band corresponding to the protein to which the antibody binds appears in the autoradiogram.Figure 4.34. Actin Filaments. Fluorescence micrograph of actin filaments in a cell stained with an antibody specific to

22、 actin.Figure 3.35. Nuclear Localization of a Steroid Receptor. (A) The receptor, made visible by attachment of the green fluorescent protein, is located predominantly in the cytoplasm of the cultured cell. (B) Subsequent to the addition of corticosterone (a glucocorticoid steroid), the receptor mov

23、es into the nucleus.圖圖3.36 免疫電子顯微免疫電子顯微圖譜。圖譜。神經(jīng)突觸的膜泡有一種通道蛋白，用金粒標(biāo)記該蛋白的抗體。然后用這種抗體與神經(jīng)突觸結(jié)合，在電子顯微鏡下觀察顯示金粒結(jié)合的抗體聚集，呈直徑達(dá)150A的不透明顆粒。甲酰甲硫氨酸甲酰甲硫氨酸(fMet)肽肽圖圖3.37 后葉加壓素及合成的后葉加壓素類(lèi)似物。后葉加壓素及合成的后葉加壓素類(lèi)似物。后葉加壓素能夠促進(jìn)水分重新吸收。后葉加壓素結(jié)構(gòu)式（A）和合成的后葉加壓素結(jié)果類(lèi)似物（B）。圖圖3.38 氨基酸活化氨基酸活化。二環(huán)己基碳二亞胺（DCCI）用來(lái)活化氨基酸的羧基。圖圖3.39 多肽的固相合成。多肽的固相合成。固相合

24、成的步驟是：（1）C-端氨基酸錨定于樹(shù)脂載體，（2）脫去N-端保護(hù)基團(tuán)，（3）與下一個(gè)氨基酸殘基交聯(lián)。重復(fù)第2步和第3步操作。最后，第4步從樹(shù)脂釋放合成多肽。 圖圖3.40 MALDI-TOF質(zhì)譜。質(zhì)譜。（1）與適當(dāng)介質(zhì)混合的蛋白質(zhì)，用激光束離子化。（2）電場(chǎng)加速使離子穿過(guò)飛行管到達(dá)探測(cè)器。（3）最輕的離子最先到達(dá)。（4）離子化激光束同時(shí)啟動(dòng)離子飛行時(shí)間(TOF)計(jì)時(shí)器。圖圖3.41 胰島素和胰島素和b-b-乳球蛋白的乳球蛋白的MALDI-TOF質(zhì)譜。質(zhì)譜。胰島素（I）和b-乳球蛋白（L）各5 pmole，用MALDI離子化，產(chǎn)生的主峰是單質(zhì)子峰(I + H)+或（L+H)+、還有少量的胰島素

25、二體（2I+ H)+峰。圖圖3.42 質(zhì)譜進(jìn)行蛋白組學(xué)分析。質(zhì)譜進(jìn)行蛋白組學(xué)分析。用trypsin處理酵母核孔復(fù)合物（來(lái)自凝膠電泳的條帶），然后進(jìn)行質(zhì)譜分析。質(zhì)譜圖譜有很多峰與酵母基因組所編碼的三種蛋白質(zhì)（Nup120p, Kap122p,和Kap120p）的多肽片段吻合。該條帶的表觀分子量是100kD。圖圖3.43 3.43 x-光晶體衍射光晶體衍射實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)。x-線(xiàn)源產(chǎn)生一束x-光，后者為晶體衍射。檢測(cè)器收集衍射圖譜。圖圖3.44 3.44 x-射線(xiàn)衍射圖譜。射線(xiàn)衍射圖譜。肌球蛋白晶體的x-射線(xiàn)衍射圖譜截面。圖圖3.45 3.45 肌球蛋白電子密度圖截面肌球蛋白電子密度圖截面。該截面的電子密度圖顯示血紅素。中心區(qū)域是鐵原子。圖圖3.46 美國(guó)地理圖譜。美國(guó)地理圖譜。Colora