功能微生物的篩選和育種

1、矯京師細人學(xué)微生物實驗論文Formal功能微生物的篩選和選育本科生：朱金風(fēng)指導(dǎo)教師：戴亦軍培養(yǎng)單位：教師教育學(xué)院學(xué)科專業(yè)：生物師范完成時間2011年12月4日功能微生物的篩選和選育摘要：微生物種類繁多，且生長快速，它不僅在生態(tài)環(huán)境、工農(nóng)業(yè)生 產(chǎn)中有重要作用，而且與人類健康密切相關(guān)。許多種類為人類開發(fā)利 用，造福社會。正因為它在各方各面都有著其巨大的影響，則要求我 們更好地掌握功能微生物的篩選和育種，所以我們對功能微生物進行 了實驗研究，以產(chǎn)淀粉酶細菌為例，在實驗過程中我們做了培養(yǎng)基的 配置和滅菌、產(chǎn)淀粉酶細菌的分離篩選和純化、研究了不同條件對產(chǎn) 淀粉酶細菌產(chǎn)酶的影響、學(xué)習(xí)了產(chǎn)淀粉酶細菌的鑒定和

2、它的紫外誘變 育種方法。通過實驗我們掌握了試管培養(yǎng)基的分裝、包扎，紗線的系 法，了解了高壓蒸汽滅菌的方法和原理，液體搖瓶培養(yǎng)技術(shù)，斜面接 種技術(shù)和倒平板技術(shù)以及平板劃線分離技術(shù)，還進一步掌握了稀釋涂 布分離菌種技術(shù)，學(xué)習(xí)了 PCR的操作技術(shù)，瓊脂凝膠電泳法。我們 完整地開展了一次應(yīng)用微生物課題研究的實訓(xùn)。不僅掌握了相關(guān)實驗 技術(shù)和方法還更好的掌握了如何應(yīng)用這些技術(shù)去解決科學(xué)實驗和生 產(chǎn)實踐中的具體問題，培養(yǎng)了學(xué)生的創(chuàng)新思維和動手能力。關(guān)鍵詞：功能微生物；產(chǎn)淀粉酚細菌；紫外誘變育種；高壓蒸汽滅菌; 液體搖瓶培養(yǎng)技術(shù)；PCR的操作技術(shù)；瓊脂凝膠電泳法。1、材料和方法1.1實驗材料及培養(yǎng)基1.1.1

3、實驗材料其它：pH試紙，牛角匙，廢舊報紙，試管塞，三角瓶塞，棉花， 紗布，紗繩，記號筆，酒精燈，火柴，吸耳球，無菌吸管，無菌離心管，微量移液槍，槍頭，PCR管，接種環(huán)，20 W紫外燈；儀器：移液管，高壓蒸汽滅菌鍋，電子臺秤，普通天平，搖床，分光光度計，光學(xué)顯微鏡，凝膠電泳儀，水平電泳槽，紫外檢測燈，PCR儀、磁力攪拌器、離心機;玻璃器皿:玻璃平1IIL,玻璃試管，玻璃三角瓶，玻璃燒杯，玻璃量筒，分裝漏斗，玻璃棒，玻璃涂棒，載玻片;藥品：配制牛肉膏蛋白豚培養(yǎng)基，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基相關(guān)的化學(xué)藥 品，試劑與原料，lmol/L的NaOH和HC1,新鮮土壤樣品（同學(xué) 自備），稀碘液，2%淀粉溶液，乙酸溶液，

4、無菌水三角瓶，帶有 玻璃珠裝有20niL菌種：各組分離獲得的產(chǎn)淀粉酶細菌1株（無 菌水），革蘭氏染色全套試劑，Taq酶，反應(yīng)緩沖液，dNTP, 16S rRNA基因上下游引物，模板（菌落） （PCR反應(yīng)試劑），瓊脂 糖，澳化乙錠，TAE電泳緩沖液，每組分離并鑒定的菌種。1.12培養(yǎng)基培養(yǎng)基：淀粉培養(yǎng)基，無菌培養(yǎng)皿，前一步制備的各種搖瓶發(fā)酵 培養(yǎng)基，產(chǎn)淀粉酶的待檢菌的平板菌落（提前24小時劃線接種）, 肉膏蛋白豚固體培養(yǎng)基。1.2實驗方法121培養(yǎng)基的配制和實驗材料的準(zhǔn)備與滅菌1.21.1淀粉培養(yǎng)基的配制（第一排負責(zé)）配方（g/L）：牛肉膏3,蛋白腺10, NaCl 5,可溶性淀粉2,瓊脂20,

5、pH7.07.2o（注：配制3000111L,分裝于250mL三角瓶，每瓶200mL。）（第二排負責(zé)）配方（g/L）：牛肉膏3,蛋白腺10, NaCl5,可溶性淀粉2,瓊脂20, pH7.0-7.2o （注：分裝20支固體斜面試管（不超過試管高度的1/2）和20支液體試管（不超過試管高度的1/3）不超過試管高度的1/2不超過試管高度的（第三排負責(zé)） 不同pH值（每種每組1瓶，每瓶10mL） 配制 1 （g/L）：淀粉 3,蛋白豚 10, NaC15,pH4.0配制 2 （g/L）：淀粉 3,蛋白腺 10, NaCl 5,pH 7.2（第四排負責(zé)）不同碳源（每種每組1瓶，每瓶10mL）配制 3

6、(g/L)：淀粉 3,蛋白腺 10, K2HPO4 1.5, MgSO4 7H2O 1.5,去離子水 lOOOinL, pH 7.2配制 4 (g/L)：葡萄糖 3,蛋白豚 10, K2HPO4 1.5, MgSO4 7H2O 15去離子水 lOOOinL, pH 7.2（第五排負責(zé)） 不同氮源（每種每組1瓶，每瓶10mL） 配制 5 (g/L)：硝酸鈉 10,淀粉 3, K2HPO4 1.5, MgSO4*7H2O 1.5, 去離子水 lOOOinL, pH 7.2配制 6（g/L）：硫酸鍍 10,淀粉 3, K2HPO4 1.5, MgSO4 7H2O 1.5, 去離子水lOOOmL, p

7、H 7.21.21.2無菌水的準(zhǔn)備（第六排負責(zé)）501111三角瓶內(nèi)盛入18ml蒸僧水，放入810顆玻璃小珠，加蓋瓶塞, 包扎待滅菌；每2人準(zhǔn)備一瓶；50nil三角瓶內(nèi)盛入18-201111蒸憎水，加蓋瓶塞，包扎待滅菌；每4人準(zhǔn)備一瓶。1.21.3滅菌材料與器皿的包扎 1）試管的包扎：7支試管為一包扎單位，用報紙將試管塞部分包扎2）三角瓶的包扎：用報紙將瓶塞部分包扎嚴密，以紗線系之；3）培養(yǎng)皿的包扎：6個平皿為一包扎單位，用報紙以滾筒方式將其包緊；每2人扎一包；4）1.5mL離心管的包扎：6個離心管為包扎單位，用報紙包成小包。每人扎一包。B手滅菌俗1.2.1.4高壓蒸汽滅菌過程：加熱鍋體夾層中

8、的水至沸騰，當(dāng)飽和 蒸汽壓達到lkg/cm2的時候，鍋內(nèi)溫度即可 達到121°C,在該溫度下維持20-30 nuii即可 殺死包括細菌芽砲在內(nèi)的所有微生物，達到 徹底滅菌Z目的（滅菌釜內(nèi)的空氣是否排盡將直接影響到鍋體內(nèi)物品的滅菌效果）。（對1.2.1.3中的試管，三角瓶，培養(yǎng)皿，玻璃器皿，離心管進行高 壓蒸汽滅菌。）1.2 2產(chǎn)胞外淀粉酶細菌的分離和篩選1.2.2.1制備土壤稀釋液稱取土壤2g,放入18mL帶有玻璃珠的無菌水三角瓶中，振蕩5min（稀釋度已為10-1）,然后在離心管屮依次稀釋至103、10-4稀釋度。1.2.2.2制備淀粉培養(yǎng)基平板每組制5塊淀粉牛膏蛋豚培養(yǎng)基平板：微

9、波爐加熱融化淀粉培養(yǎng)基， 冷卻至不燙手的溫度，倒入滅菌的空培養(yǎng)1IIL中（20ml左右），并輕輕搖 晃混勻，冷卻。1.2 2.3稀釋涂布無菌操作法分別吸取103、104上壤稀釋液0.lniL,加在淀粉平板 培養(yǎng)基上（每個稀釋度一塊）。用無菌玻璃涂棒均勻涂布，靜置5mm 后，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1224劃線分離用接種環(huán)挑取一環(huán)10-1丄壤稀釋液，在一塊淀粉培養(yǎng)基上進行劃線 分離。倒置于恒溫箱培養(yǎng)。S V-4劃線分離示意圖1.2.2.5觀察水解圈和測量H/C值 24小時后（第二天天下午），在之前稀釋涂布和劃線的3塊淀粉 培養(yǎng)基上選取典型細菌菌落（盡量選取邊緣整齊和規(guī)則的菌落）, 并用記號筆進行編

10、號。將編號后的菌落用無菌牙簽挑取，在備用的1塊淀粉培養(yǎng)基平板大?。–）和水解圈大?。℉） o找到水解圈最大的12個菌落和編號，在對應(yīng)編號的點種平板上做好標(biāo)記。將點種平板繼續(xù)置于30°C培養(yǎng)。1.2.3不同營養(yǎng)和培養(yǎng)條件對淀粉酶產(chǎn)生菌生長的影響 123.1發(fā)酵液接種提前24h將平板菌種用接種環(huán)挑取，在液體試管中打散混勻，然后按0.5%接種量分別轉(zhuǎn)接如卜六種液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基。（pH 4.0; pH 7.2;碳源淀粉；碳源葡萄糖；氮源硝酸鈉；氮源硫酸鍍） 1.2.3.2菌種保藏挑取平板菌落，在斜面試管培養(yǎng)棊上劃線，30°C培養(yǎng)，然后置冰箱低 溫保藏。1233菌體生長量的測定1）

11、將培養(yǎng)24h后液體搖瓶培養(yǎng)物分別取出2inL于試管中，加入8inL 蒸慵水，進行5倍稀釋。2）將各稀釋液分別倒入比色杯中，在721型分光光度計600iun波長 下測定吸光值（OD600值）。3）如果菌液濃度過大，可繼續(xù)稀釋后再進行測量，保證OD600值應(yīng) 控制在0.11之間。4）分別記錄各種不同培養(yǎng)基和不同培養(yǎng)條件下OD600值大小，評價 對菌體生長量的影響。搖勻后40°C恒溫水浴保溫5minns蒸憎水02mL0.2mL1.2.3.4不同條件對淀粉酶活性的影響測定加入試劑測定管空白管1 %的淀粉溶液O.lmLO.lmL緩沖液O.lmLO.lmL搖勻后40°C保溫15min乙

12、酸溶液0.5mL0.5mLOOOrpm 離心 5min取上清加入lm席碘液試管中加蒸憎水稀釋至10mL124產(chǎn)淀粉酶菌種的鑒定1.2.4.1產(chǎn)淀粉酶待檢菌的培養(yǎng)特征與形態(tài)特征的觀察與鑒定a.培養(yǎng)特征的觀察:菌落形狀與人小，邊緣,表面，隆起形狀，透明度，菌落與培養(yǎng)基顏色等;b. 細菌細胞的顯微觀察：細胞形狀是桿狀（長桿或短桿）還是球狀?有無芽孑包？有無莢月莫?c. 細菌的革蘭氏染色：按照書上操作方法進行（設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)的革蘭氏 陽性和陰性菌為對照）。G+G-G+和G的混合1.2.4.2細菌的16S rRNA分子鑒定用滅菌槍頭挑取單菌落邊緣少許菌體，刮蹭于PCR管壁底部少許。反應(yīng)體系：在一個PCR管中用

13、微量移液槍加入下列物質(zhì)的混合液24.5U1,置于冰上備用。Taqbuffer (10X )2.5 ulMgC12 (25mM)1 U1dNTP (2.5111M)2.5 nlPiiiner Forward (50 inM)1 HiPiiiner Reverse (50 111M)1 u 116.5 ulddH2O振蕩，將菌體和反應(yīng)體系充分混勻最后加入：rTaq （2U/iil）0.5111PCR反應(yīng)條件：95°C預(yù)變性5】nin后,95°C變性lmin,59°C退火lmin，72°C延伸2min,共25個循環(huán),72°C延伸lOmin。1.2.4

14、.3瓊脂糖凝膠電泳1）制膠：配制0.7%瓊脂糖溶液20111L,用1 XTAE電泳緩沖液做溶 劑，加熱溶解，稍冷后，加入模具中，插入梳子，待膠凝固。2）制樣：PCR反應(yīng)結(jié)朿后，取出PCR管，用微量移液槍吸取5ul與 liil 6 Xloading Buffer混合后全部點入浸于TAE電泳緩沖液中的瓊 脂糖凝膠的樣品孔中。瓊脂糖凝膠電泳裝置3）電泳：100V電泳20分鐘。4）染色：將凝膠置于樣品染料漠化乙錠屮染色；10mm,然后將凝膠置于紫外燈下進行檢測，當(dāng)在凝膠上出現(xiàn)預(yù)期大小的DNA條帶（約1.5Kb）,則認為是PCR陽性，這時將與此電泳樣品對應(yīng)的PCR反應(yīng)管放置冰箱短期保存。1.2.5淀粉酶

15、產(chǎn)生菌的紫外誘變育種1251紫外線對細菌的誘變效應(yīng)a. 細菌懸液制備:取液體培養(yǎng)物（各組提前24小時，將之前保藏的試管斜面菌種轉(zhuǎn)接液體搖瓶過夜培養(yǎng)o） lniL于doif管屮，每 組3管，80001pm,離心5nun,棄上清；菌體用無菌水洗滌離心 一次，最后每個doif管各加1.5111L無菌水制成均勻的菌懸液。b. 平板制作：融化淀粉培養(yǎng)基，每組倒4塊平板，在平板上做好標(biāo) 識。c. 紫外線處理：將紫外燈打開預(yù)熱20分鐘；取6cm無菌平皿一個,加入2管菌懸液，共3ml；將上述平皿置于紫外燈下的脫色搖床上，打開IIIL蓋，距離紫外燈管30cm,照射3mm （單號排）或者6niiii （雙號排），

16、蓋上皿蓋。d. 稀釋菌液：在超凈臺內(nèi)，將照射后的菌懸液用無菌水按10倍稀釋法依次稀釋成10-1-10-5 （在dorf管中進行）。e. 涂布平板：取10-3. 10-4 （單號組）和10-4. 10-5 （雙號組）兩個稀釋度的菌懸液各O.lnil涂布均勻。以同樣的操作，取未經(jīng)紫外線處理的菌懸液稀釋涂布平板作為對照。1.2.5.2培養(yǎng)與觀察及結(jié)果判斷1）涂布好的平板置于瓷盤中，蓋上蓋子，置于30°C避光倒置培養(yǎng)48 小時。2）計數(shù)：將培養(yǎng)好的平板取出進行細菌菌落計數(shù)；根據(jù)對照板上的 CFU（colony foniiiiig xuiit）數(shù)計算出每毫升 菌懸液中的CFU數(shù)， 同樣計算出紫

17、外線處理后的CFU數(shù)。3）存活率（）=（處理后每毫升CFU數(shù)/對照每毫升CFU數(shù)）X1004）致死率（）=（對照每毫升CFU數(shù)-處理后每毫升CFU數(shù)）/ 對照每毫升CFU數(shù)X1005）觀察誘變效應(yīng)：測量淀粉水解圈直徑與菌落直徑并計算其比值（HC比值），和對照板相比較，說明誘變效應(yīng)。2實驗記錄與結(jié)果2.1平板劃線分離結(jié)果圖7-29枯草芽胞桿茴在血瓊脂平板上的 筒落特征（182肋）22觀察水解圈測量H/C值透明圈（H）與菌落直徑（C）比值的人小在一定程度上反映了菌株產(chǎn)生淀粉酶的能力：H/C值越大，表明分泌的淀粉酶越多，水解淀粉的能力也就越強。試管號12345678水解圈直徑（H）mm3.22.61

18、.82.92.42.03.12.2菌落直徑（C）min1.20.70.50.90.70.51.00.6H/C值2. 673.713.603. 223434.003. 103. 672.30D600值計算試管號123456OD600<a0. 7270. 8950. 7950. 0870.7190. 4832.4淀粉酶酶活顯色后，立即于660nm波長測定其吸光度（A）。計算各樣品吸光度大小酶活力。即以ImL粗酶液在40°C, pH6.0條件下15min所分解O.lmg的淀粉質(zhì)量為1個酹活力單位。離心管號1234560空白管）吸光度（A）1.0311.1161. 1340. 3210

19、. 7410. 6181.187淀粉酶活性6. 5712. 9912. 23336. 47918. 78723. 968A空白管一A測定管A空白管0.2150.125革蘭氏染色結(jié)果G+G-26瓊脂凝膠電泳結(jié)果第二條2/7常用的各類誘變劑物理誘變劑紫外線、快中子、誨 1線、卩刻線、Y射線、激光、高子?xùn)c化學(xué)誘變劑或星類似物2氨星碟吟、5漠尿啣;8氮叫碟 嶺與減基反應(yīng)的物質(zhì)硫腹二乙酯、甲基磕巖乙酯、亞硝基WL 亞硝基甲基JK、亞硝基乙基腺、亞硝嚴、 氮芥、四乙烯亞胺、務(wù)胺IEDNA分子中插入 或徐失一個或幾個或 基葉唳類染料生物誘變劑噬菌體、轉(zhuǎn)座子2.8經(jīng)紫外照射后的細菌存活率和致死率。紫外線照射處

20、理結(jié)果稀釋度10'310=4菌落數(shù)2183、討論3.1培養(yǎng)基配好后為什么要立即滅菌？如何檢查滅菌后的培養(yǎng)基是無 菌的？答：原因：培養(yǎng)菌配好后當(dāng)天裝袋、當(dāng)天滅菌，如果存放時間長不進 行滅菌培養(yǎng)料內(nèi)的微生物就會在料內(nèi)發(fā)酵生長，從而破壞培養(yǎng)基內(nèi)的 營養(yǎng)成分，并且由于這些微生物的生長過程中分分泌一種或多種毒素 從而抑制好菌的生長。檢査無菌的方法:就是將已經(jīng)滅完菌的菌棒放到25 28°C的恒溫環(huán)境中避光培養(yǎng)3天后，拿出來檢查看袋內(nèi)有沒有雜菌滋生的痕跡?？?菌袋內(nèi)有沒沒有導(dǎo)演變色、出現(xiàn)斑點等情況的發(fā)生，如果有就證明滅 菌不徹底。3.2高壓蒸汽滅菌應(yīng)注意哪些事項？答：空氣外排要徹底，滅菌釜

21、內(nèi)的空氣是否排盡將直接影響到鍋體內(nèi) 物品的滅菌效果；不要讓培養(yǎng)基傾斜以防溢出；滅菌物品Z間不要擺 放太擠，以保證高壓蒸汽滅菌能夠徹底，3.3雙酶水解法的過程是什么？答：雙酶水解法：a -淀粉酶糖化酶淀粉糊精、低聚糖葡萄糖，麥芽糖液化糖化34溫度為何設(shè)定為40-C? 答：原因：因為40°C是產(chǎn)淀粉酶菌的最適溫度。3.5淀粉酶活測定還有哪些方法？答：方法：初始速率法；DNS比色法。3.6 (DNA)瓊脂糖凝膠電泳原理是什么？有哪些影響因素？答：原理：帶電顆粒在電場的作用下，向著與其電性相反的電極泳動 的現(xiàn)象。在本實驗中，DNA分子帶負電荷，向正極泳動。影響泳動率的因素：電荷效應(yīng)和分了篩效應(yīng)(R卩DNA分了本身的人 小和構(gòu)型)。在本實驗中，分子量越小，泳動越快。37紫外線誘變的機制是什么？答：機制：DNA對紫外線有強烈的吸收作用，尤其是堿基中的喘唏， 它比瞟吟更為敏感。紫外線引起