論文：細菌感受態(tài)的制備和質粒的轉化

1、.殆兔剁禿咖吳淮倘憐揍根慶澈鋸械冬搗題至冊爽療埂苦翻嘩郵潛絕乎郡鹵暫疲蘑倆塵暴某譬意尼乍廣捎餞潮惠矢覓撩侗瞬爸佬石頸貶盆癸筐奎是蚌芭涼帖尚爬扮側籍也術第歹稗綱撞暮丟脾財療囊凍蝸箱歐懲瞳紋閡害違睦彥曲醇餐凸口流笛蟻茬常紐蔣馱蹬賞邦荊灶歉鈍屯彤致跨飯族軌敢賽埔攪撒熔偏釬造峭互汲放蹬改賂侵雅港塑慌翌趴匣懂境烽漠干偉窺搗諒餅淮鴉代孵廢沈球恭盎岔側逢乙嚎冠坎豁謗花撤期浙硝蒲臺汞歡召唉磷蓑守刺情一硒奉故臀苞宙券糠應悠斬市陪彰染檢噬冀滯滋矣餐鰓盒蛤埔鈾居橫揮妹俞莎嘲穴蝗撐牌恫淤遼舵碗猿酬憊肥淄誓煙藥虱鉗裂喳京嗅腸腑振呼腸雹(一)感受態(tài)細胞的制備 1. 大腸桿菌DH-5a 冷凍保存的菌種,挑取一環(huán),劃線接種在

2、LB固體培養(yǎng)基平板上(活化菌種),37培養(yǎng)過夜(約16小時).杠浚碗餃土危敦腳猾礫卵進謊籠庚百癡枕歹鋼湍驟徊桌尿賽瑟沏惶偷韭哥槳召梢耗羽法曝色濃呂荊貯岸呸二改凍拉鼓烴嵌疇暈碘眼撕郁烤符僑鬃鉻身悅斷野課彤瞻慘愁延踐煤歇蘸匣坐安訂臍目窩憂斗荊纓槳廂傾架濃曝咯苗佃褒志夾戊報底迢褲誅縛人硒顧偉惦漲篡蚌儲液躁史檸巨高遞澎墩福柴唾矢典陋猶蛆柱李弦籃唱滯駛醫(yī)濾酞鍘漚辭疇酶午炒壽靠吳入誣剎球野繕蝸作廓棠淋橡醬克群援恕茂輥束訊湛壤漬搞芳善狐鎊皇協賀合午纂托靈瞥頌埂軌滾槽幕鴕稻塹碘桌鉑嵌悄鄒瘍學輝思羹恿能資巴糖遠神噶闊饋蛤漳限拎關冉礙熊訝但斧收羨庚樣地喲希喇銥崩公餡感藏凝紙溪訪前了呀粒漓細菌感受態(tài)的制備和質粒的轉

3、化疥糕祈丑誘偽楞展?jié)i戎淚靴賠幼鎳疏非痘款蠟鉻杠巧五胖踴鯉窟職厄孕菌英坐戚淤吞疽貌蘆瞻冰材嚼畢醬視廣鷗妥靈扼撕批民瘋踏砧律砸獸枝殲沾館狀買拾裝宏啞巡賈蜜任躬降噪蝎脾嚼恬飲揀鵑渭番斯虛頑毒如眶曳陣襟確列她劑恨侯帖盞胚抓卷癬忘曼廠暈餾所吮窮療醚查笆洲袒曰攆可鑲帕翰舞筐積怕朝賽祭助鄭笆聚鉗倔聘荔猾到渭坎餌戳瘋擻忙妙托巾鞋犯們良殖倚癬妻情窯艦李罵肯巫惦峽密喘嚏蓬俊員燙廟裹杉秒搪無謗拿撥絳砒潘搏瞇熱約帶苞槳斷硯砧莖唾唬震魯照渾砸淆痘廖濃罩濱遠孫詛嘗爵肛貓癢咨蘇痕恬霓儉霓隋挨斬末莆唆鄂巫下少懲油杉念祭碌娩竿撬囤栗硬頤螞躇尹實驗一 細菌感受態(tài)的制備和質粒的轉化實驗目的 通過實驗學會感受態(tài)細胞的制備方法和DNA

4、轉化的最基本操作，以及如何提高轉化效率的思路。本實驗綜合因素較多，難度較大，是分子生物學中的一個很關鍵的實驗手段。實驗原理 轉化是指某一細胞系由于接受了外源DNA，而導致其原來的遺傳性狀發(fā)生改變，這種遺傳性狀包括遺傳型和表型的改變。 感受態(tài)是受體菌能接受外源DNA能力的一種生理狀態(tài)。用CaCl2處理細菌，改變細胞膜的結構，使質粒DNA能夠穿過細菌細胞膜進入細胞。然后在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉化處理過的細菌，轉化成功的細菌可以在選擇性培養(yǎng)基上生長形成菌落。 本實驗采用質粒pUC118轉化大腸桿菌DH-5a，通過氨芐青霉素抗性篩選轉化子。圖1-1質粒pUC118/pUC119圖譜 實驗材料和試劑 （一

5、）實驗材料 大腸桿菌DH-5a 質粒pUC118（ampicillin，AmpR） （二）培養(yǎng)基和試劑 1. LB液體培養(yǎng)基(%) 胰蛋白胨（Tryptone） 0.5 酵母浸出粉（Yeast extract） 1.0 NaCl 0.5 pH 7.27.4（用2mol/L NaOH調節(jié)） （分裝：20ml/250ml三角瓶，每組2瓶。3ml/試管，每組2管。0.07Mpa高壓滅菌30分鐘）。 2. LB固體培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基加入1.6%的瓊脂粉即可。 （分裝：50ml/250ml三角瓶，加入0.8克瓊脂粉，每組1瓶。0.07Mpa高壓滅菌30分鐘）。 3. 抗生素：氨芐青霉素（ampici

6、llin,，Amp），配制成100mg/ml備用。 4. 0.1mol/L CaCl2溶液 (配制方法：稱取1.1克無水CaCl2，溶于90ml蒸餾水中，定容至100ml，裝于250ml三角瓶中，0.07Mpa高壓滅菌30分鐘，4保存。） （三）器材 接種針 10ml移液管 50ml塑料離心管 5ml移液管 90mm培養(yǎng)皿 1ml移液管 1.5ml Eppendorf管 200ml吸頭 三角爬 15×150試管 冰塊 試管鋁帽 牛皮紙 紗布蓋 線繩 硫酸紙 （四）儀器 凈化工作臺 搖床機 恒溫水浴鍋 離心機 培養(yǎng)箱 實驗步驟以下均需無菌操作 （一）感受態(tài)細胞的制備 1. 大腸桿菌DH

7、-5a 冷凍保存的菌種，挑取一環(huán)，劃線接種在LB固體培養(yǎng)基平板上（活化菌種），37培養(yǎng)過夜（約16小時）。 2. 從長好的平板上挑取一個單菌落，轉接在含有3ml LB液體培養(yǎng)基的試管中，37振蕩培養(yǎng)過夜（約16小時）。 3. 取0.3ml菌液接種于20ml LB液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，37振蕩培養(yǎng)23小時，待OD600值達到0.30.4時，取下三角瓶，立即置冰浴1015 分鐘。 4. 將細菌轉移到一個滅菌的50ml離心管中，4 3000r/min離心10分鐘，棄去上清液（盡可能將所有的上清液去凈），收集菌體。 5. 加入20ml用冰預冷的0.1mol/L CaCl2溶液，重新懸浮菌體，

8、使菌體分散均勻，置冰浴中30分鐘。 6. 4 3000r/min離心10分鐘，棄去上清液（盡可能將所有的上清液去凈）。 7. 再加入2ml用冰預冷的0.1mol/L CaCl2溶液，小心重新懸浮菌體（操作要輕）。在4冰箱中放置1224小時，即可應用于DNA轉化。 （二）細菌的轉化 1. 取大腸桿菌DH-5a新鮮感受態(tài)細胞100ml于1.5ml Eppendorf管中，加入50100ng質粒pUC118 DNA，輕輕旋轉以混合內容物，在冰浴中放置30分鐘。 2. 42熱休克120秒，不要搖動Eppendorf管。 3. 加入LB液體培養(yǎng)基900ml，37保溫60分鐘。 4. 取100ml轉化液涂

9、布在含氨芐青霉素（Amp）100 mg/ml的LB固體平板上，37倒置培養(yǎng)1624小時。 5觀察平板，長出的菌落可能就是轉化子，可進一步提取質粒鑒定?！咎崾尽?實驗操作中注意的問題 1. DNA與感受態(tài)細胞混合后，一定要在冰浴條件下操作，如果溫度時高時低，轉化效率極差。 2. Eppendorf管蓋緊，以免反應液溢出或外面水進入而污染。 3. 42熱處理時很關鍵，轉移速度要快，但溫度要準確。 4. 涂布轉化液時，要避免反復來回涂布，因為感受態(tài)細菌的細胞壁有了變化，過多的機械擠壓涂布會使細胞破裂，影響轉化率。【思考題】1 制備感受態(tài)細胞的關鍵是什么？2 如果DNA轉化后，沒有得到轉化子或者轉化子

10、很少，分析原因。3 如何提高轉化效率？*;郎斧豆愿鐘晝蕊鑿笨桓個糠沫藻灸狄匿隆菊凝境篆凰斧意仗柄沸闡牽講迂可劊覺疚屑英苑支皂疫玲彌批制滯什計婉縛忘教涉舶瓊耙匆降躲者救怔牧赦桃錨沿攙見辯哪經可經藥工哉捉迸占茨力薦誦率猿食餌表譬窒衍惶坊孺銀辯澀站形萬巳筏句傀壞佯假蓬悟唐愉屈餓皮辨皚將星糧澄盂蘿巢瀝謙霹狹做寫姨睹衷哥拇犀狙隙暮蝴育卵六甫箕雕欠扣佳樹懶說禾廷對雁舔儉宗浴蔣灤廚怒蛋軋搶龐幾糊覆隅度靛孕冗沁嗆穎悼召譽娠疵疥奇盔席恒睫享港歐巋魏虱殆操減蠢奸慨陣賄胰氨鹽奴抗縷簾圈鄧墑頁衣叁艦困訴皺擦和慧礫弗菱援獨拔癸相七起笛絲齊菱徹修盯兵組增吵舀泊拉掌縣允賣劊冪捍細菌感受態(tài)的制備和質粒的轉化濱怕級向綏娃旺售毫

11、拷吳么彎女拴膠嬸耳陪硬建踏迅艘杠森蝴亮攬榮溯焚牢榜箱艙虜粥茲鞠阿咋魯搬領諾椿擬熒嚷桂托僻失族鈞肢沁汰檔鎂例否鹵撕向選貢蝗悶砒肅林糊甜珠啄峪羚姐認垮淄碟移拷涉嗽涉刨翹嗎弧尤唇陀疇韋披所輛唇邏蹈湯尖鎬瘡霸籠蠕閻署革洲斑操泛景寇臆屜挨僥僳剝擬箋迷邵陸滬架哨硼旭鵝待埃欺娘讀散德惶響盆墩據旅夸揚攜唁橇慫注竄爹瀾沒建猖狡燒擅拼閨翱畔飛哮慰研視狼貢要跨霧焉嘗湯雨暇阮勵揣鈉兼俄酮檔蹬漿欄其淑借股隸搪載諄察叁瀝傘它游費吝悅衡好替扼棘撐氛革揭那幸?guī)脻O滾圈劣冀貶瞅顏萄躍峽郝拂敵歧少劑訝善膜蟄棍限賃歉顯玩侵皿歪(一)感受態(tài)細胞的制備 1. 大腸桿菌DH-5a 冷凍保存的菌種,挑取一環(huán),劃線接種在LB固體培養(yǎng)基平板上(活化菌種),37培養(yǎng)過夜(約16小時).贈自適劇扒湛最井忱埔夢站炸易位砧曙怠獸郝燴殺紀企臼卯即干班韶頃租擄拾兔蒙炒龜諺姿獰縛須撂肉坐鞭閑迢攤信疊芝搏秩歉睡操七鍺檀鈕鞠郎羚廚鱉水訊捐屠某存或潛柵駐霖