蛋白質(zhì)的鹽析

1、蛋白質(zhì)的鹽析Docume nt serial number NL89WT-NY98YT-NC8CB-NNUUT-NUT108蛋白質(zhì)的鹽析驗(yàn)證型一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私庠诠I(yè)化生產(chǎn)過程中使用NHJ $0,的情況.及NH V: S0 使用時(shí)的注意爭(zhēng)項(xiàng)。二、實(shí)驗(yàn)原理用商濃度中性鹽使貳白質(zhì)從溶液中沉淀出來的方法稱鹽析。常用的中性鹽有NHJ必0小XaCI等。島濃度中性鹽能使蛋白 質(zhì)沉淀是因?yàn)樗哂忻撍?，能脫去貴白質(zhì)膠粒水膜又有中和貴白質(zhì)膠粒外雙電層電荷的作用。不同蛋白質(zhì)鹽析時(shí)所需鹽濃度不同，故調(diào)節(jié)鹽濃度.可適十地將蛋白質(zhì)分幵。如球蛋白在半飽和硫酸錢溶液中沉淀？清蛋白在飽和硫酸餒溶液中沉淀，用鹽析法沉淀的蛋白質(zhì)

2、并未變性，用稀釋的方法或透析的方法可使之復(fù)溶。三、器材與試劑1 發(fā)酵溶液2、10%的三氯醋酸溶液3、飽和NH V 心溶液4、NH, £:粉末四、實(shí)驗(yàn)步驟1取發(fā)酵溶液5".加飽和訊鈕溶液ImI2mI3mI4mI5mE混勻，靜止數(shù)分鐘即有白色沉淀析出，應(yīng)為何物 ？過濾至淸.除去沉淀， 濾液備用。取少址沉淀加H4看是否復(fù)溶？2 取濾液0? 5ml.加10%的三氯醋酸數(shù)滴，有白色沉淀產(chǎn)生，應(yīng)為何物？然后在 721分光光度 0D& : o下進(jìn)行透光率的檢測(cè).檢 測(cè)時(shí)必須在倒入比色皿以后 10秒內(nèi)讀取為什么？。在進(jìn)行檢測(cè)時(shí)應(yīng)注慰將 721分光光度訃調(diào)整到0D曲 在測(cè)址前應(yīng)把機(jī)

3、器預(yù)熱 半小時(shí)左右。在檢測(cè)時(shí)應(yīng)注意有效的檢測(cè)范憎是 T值15弔以上到70弔以下o3另外，取濾液2. 5ml于小燒杯中.力【1 NH 另X粉末.隨加隨攪拌，直至NHJ不能溶解為止，有白色沉淀產(chǎn)生， 應(yīng)為何物？然后過濾至清.除去沉淀，過濾備用。4將1 - 3做的濾液中加10$三氯醋酸數(shù)滴觀察有無沉淀產(chǎn)生。找到?jīng)]有沉淀的加飽和 NHJ : S0j容液的點(diǎn)。然后在721 分光光度計(jì)0D&。下進(jìn)行透光率的檢測(cè)。并且作出曲線。5對(duì)大址的發(fā)酵液進(jìn)行處理，在濾液中加10%三氯醋酸數(shù)滴觀察有無沉淀產(chǎn)生。V 6鹽析曲線的制作方法：如果要?jiǎng)e離一種新的貴白質(zhì)和酶.沒有文獻(xiàn)數(shù)據(jù)可以借鑒，那么應(yīng)先確定沉淀該物質(zhì)的

4、硫酸錢飽和度。具體操作方法如下：取已定址測(cè)定貴白質(zhì)或的的活性與濃度的待別離樣品溶液.冷至09? 5C,調(diào)至該貴白質(zhì)穩(wěn)定的pH值.分610次分別參加不同量的硫酸飯.第一次加硫酸錢至責(zé)白質(zhì)溶液剛幵始出現(xiàn)沉淀時(shí)，記下所加硫酸錢的：這是鹽析曲線的起點(diǎn)。繼續(xù)加硫酸飯至溶液微微混濁時(shí).靜止一段時(shí)間.離心得到第一個(gè)沉淀級(jí)分，然后取上清再加至混濁，離心得到第二個(gè)級(jí)分.如此連續(xù)可得到6? 10個(gè)級(jí)分，按照每次參加硫酸飲的址.査出相應(yīng)的硫酸錢飽和度。將每一級(jí)分沉淀物分別溶解在一定休積的適宜的pH緩沖液中.測(cè)定其貴白質(zhì)含雖和酶活力。以每個(gè)級(jí)分的蛋白質(zhì)含雖和酶活力對(duì)硫酸飲飽和度作圖.即可得到鹽 析曲線。五、鹽析本卷須

5、知：1?鹽析的成敗決定于溶液的 pH值與離子強(qiáng)度，溶液pH值越接近責(zé)白的等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)越容易沉淀。2?鹽析一般用的硫酸恢.容易吸潮？因而在使用前，一般先磨碎，平鋪放入烤箱內(nèi)60C烘干后再稱址.這樣更準(zhǔn)確。3?在參加鹽時(shí)應(yīng)該緩慢均勻.攪拌也要緩慢.越到后來速度應(yīng)該更注意緩慢，如果出現(xiàn)一些未溶解的鹽.應(yīng)該等其完全溶解后再 加鹽.以免引起局部的鹽濃度過高，導(dǎo)致酶失活。4.鹽析后最好攪拌40分鐘到一個(gè)小時(shí)而且再在冰浴中放宜一段時(shí)間。為門磁免鹽對(duì)酶的影響，一般脫鹽處理后再測(cè)酶活性。5?鹽析后的蛋白質(zhì)最好盡快脫鹽處理 .以免變性，透析較慢，一般可用超濾或者G-25. G-50處理。6.般粗提物蛋白完全沉淀

6、是在硫酸飲濃度在70%左右。兀、鹽析影響因素：1. 蛋白質(zhì)的濃度：中性鹽沉淀蛋白質(zhì)時(shí).溶液中蛋白質(zhì)的實(shí)際濃度對(duì)別離的效果有較大的影響。通常髙濃度的黃白質(zhì)用稍低的硫酸錢飽和度即可將其沉淀下來.但假設(shè)貳白質(zhì)濃度過島.那么易產(chǎn)生各種蛋白質(zhì)的共沉淀作用.除朵蛋白的效果會(huì)明顯下降。對(duì)低濃 度的貴白質(zhì)， 婆使用更大的硫酸飲飽和度，但共沉淀作用小，別離純化效果較好 .但回收率會(huì)降低。通常認(rèn)為比較適中的蛋白質(zhì) 濃度是 2? 5%3? 0%, 相當(dāng)于 25mg/mL ? 30mg/mL°2. 離子強(qiáng)度 : 各種蛋白質(zhì)的沉淀要求不同的離子強(qiáng)度。3. 鹽的性質(zhì)：最有效的鹽是多電荷陰離子。4. pH 值：一般說來，貴白質(zhì)所帶凈電荷越女 . 它的溶解度就越大。改變 pH 值可改變蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)，閃而就改變了蛋白質(zhì)的溶 解 度。遠(yuǎn)離等電點(diǎn)處溶解度大 . 在等電點(diǎn)處溶解度小 ?因此用中性鹽沉淀蛋白質(zhì)時(shí)， pH 值常選在該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)附近。5. 溫度：除對(duì)溫度敏感的蛋白質(zhì)在低溫 ro 操作外，一般可在室溫中進(jìn)行。一般溫度低蛋白質(zhì)溶介度降低。但有的蛋白質(zhì)如血紅貳白、肌紅蛋白、清蛋白在較舟的溫度 259比TC時(shí)溶解度低.見容易鹽析。黃白質(zhì)沉淀后宜在 4C放3小時(shí)以上或 過 夜，以形成較大沉淀而易于別離。鹽析時(shí) . 分子雖較小的黃白質(zhì)逐步沉