sscp實(shí)驗(yàn)操作ppt課件

1、 PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性單鏈構(gòu)象多態(tài)性 (PCR-single-strand conformation polymorphism，SSCP) 單鏈單鏈DNA片段呈復(fù)雜的空間折疊構(gòu)象，這種片段呈復(fù)雜的空間折疊構(gòu)象，這種立體結(jié)構(gòu)主要是由立體結(jié)構(gòu)主要是由 其內(nèi)部堿基配對、氫鍵等分子內(nèi)其內(nèi)部堿基配對、氫鍵等分子內(nèi)相互作用力來維持的，當(dāng)有一個(gè)堿基發(fā)生改變時(shí)，相互作用力來維持的，當(dāng)有一個(gè)堿基發(fā)生改變時(shí)，會(huì)或多或會(huì)或多或 少地影響其空間構(gòu)象，使構(gòu)象發(fā)生改變，少地影響其空間構(gòu)象，使構(gòu)象發(fā)生改變，空間構(gòu)象有差異的單鏈空間構(gòu)象有差異的單鏈DNA分子在聚丙烯酰胺凝膠分子在聚丙烯酰胺凝膠中受排阻大小不同。因此，通過非

2、變性聚丙烯酰胺中受排阻大小不同。因此，通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠電泳(PAGE)，可以非常，可以非常 敏銳地將構(gòu)象上有差敏銳地將構(gòu)象上有差異的分子分離開。該方法即為單鏈構(gòu)象多態(tài)性異的分子分離開。該方法即為單鏈構(gòu)象多態(tài)性 (Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP)分析。分析?；驹砘驹?將將SSCP用于檢查用于檢查PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的基因突變，擴(kuò)增產(chǎn)物的基因突變，建立建立PCR-SSCP技術(shù)。技術(shù)。 基本過程：基本過程： PCR擴(kuò)增靶擴(kuò)增靶DNA; 將特異的將特異的PCR擴(kuò)增擴(kuò)增 產(chǎn)物變性，而后快速復(fù)產(chǎn)物變性，而后快速復(fù)性，使之成為具有一

3、定空間結(jié)構(gòu)的單鏈性，使之成為具有一定空間結(jié)構(gòu)的單鏈DNA分子；分子； 將適量的單鏈將適量的單鏈DNA進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠電泳; 最后通過放射性自顯影、銀染或溴化乙錠最后通過放射性自顯影、銀染或溴化乙錠顯色分析結(jié)果。顯色分析結(jié)果。 若發(fā)現(xiàn)單鏈若發(fā)現(xiàn)單鏈DNA帶遷移率與正常對照的相比發(fā)帶遷移率與正常對照的相比發(fā)生改變，就可以判定該鏈構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)而推斷該生改變，就可以判定該鏈構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)而推斷該DNA片段中有堿基突變。片段中有堿基突變。 PCR-SSCP基本過程基本過程SSCP的應(yīng)用的應(yīng)用 進(jìn)行人類進(jìn)行人類DNA多態(tài)性分析，大量地用于檢測多態(tài)性分析，大量地用于

4、檢測和腫瘤發(fā)生和腫瘤發(fā)生 有關(guān)的基因突變。有關(guān)的基因突變。 如檢測星形細(xì)胞瘤、如檢測星形細(xì)胞瘤、腦瘤、小細(xì)胞肺癌、胃癌、腸癌等腫瘤中的腦瘤、小細(xì)胞肺癌、胃癌、腸癌等腫瘤中的 p53基基因的突變、肺癌的因的突變、肺癌的ras基因突變等?；蛲蛔兊?。 用于檢用于檢 測引起人類遺傳性疾病的研究上測引起人類遺傳性疾病的研究上 。 如如在囊性纖維化中起作用的在囊性纖維化中起作用的CFTR基因、神經(jīng)纖維瘤基因、神經(jīng)纖維瘤 1型基因、家族性結(jié)腸息肉基因的研究中。型基因、家族性結(jié)腸息肉基因的研究中。 用于病毒的分型、監(jiān)測用于病毒的分型、監(jiān)測PCR實(shí)驗(yàn)中的污染實(shí)驗(yàn)中的污染 情情況、以及病原體傳播途徑的研究中。況

5、、以及病原體傳播途徑的研究中。 Yap用巢式用巢式PCR對來自不同國家和地區(qū)的對來自不同國家和地區(qū)的HBV標(biāo)品標(biāo)品 進(jìn)行了檢進(jìn)行了檢測，并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了測，并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了SSCP分析，發(fā)現(xiàn)每個(gè)標(biāo)分析，發(fā)現(xiàn)每個(gè)標(biāo)本的本的SSCP圖譜完全不同圖譜完全不同 ，不僅證明了，不僅證明了HBVDNA具具有地區(qū)性變異，而且排除了交叉性污染的可能性。有地區(qū)性變異，而且排除了交叉性污染的可能性。 PCR-SSCP的實(shí)驗(yàn)操作的實(shí)驗(yàn)操作 1.在進(jìn)行在進(jìn)行SSCP前首先要通過前首先要通過PCR擴(kuò)增出特異性好的產(chǎn)物擴(kuò)增出特異性好的產(chǎn)物(瓊脂糖電泳不能有過強(qiáng)的拖尾和引物二聚體瓊脂糖電泳不能有過強(qiáng)的拖尾和引物二聚體)

6、。2.制備聚丙烯酰胺凝膠制備聚丙烯酰胺凝膠(PAG) （1電泳槽玻璃板的處理：用洗滌劑清洗玻璃板，電泳槽玻璃板的處理：用洗滌劑清洗玻璃板，自來水反復(fù)沖凈洗滌劑，雙蒸水沖洗，自來水反復(fù)沖凈洗滌劑，雙蒸水沖洗，95乙醇擦拭，通乙醇擦拭，通風(fēng)櫥自然晾干。兩塊玻璃對齊，底部和兩側(cè)用橡膠條封好，風(fēng)櫥自然晾干。兩塊玻璃對齊，底部和兩側(cè)用橡膠條封好，用用1%瓊脂糖膠封底，固定在垂直電泳槽上。瓊脂糖膠封底，固定在垂直電泳槽上。 （2） 制膠：按照被分離制膠：按照被分離DNA片段的大小、含量及玻片段的大小、含量及玻璃板、襯條的大小決定凝膠的濃度與體積，一般來講使用璃板、襯條的大小決定凝膠的濃度與體積，一般來講使

7、用58的凝膠較為合適。的凝膠較為合適。 PCR-SSCP的實(shí)驗(yàn)操作的實(shí)驗(yàn)操作 在小于在小于1Kb長度的情況下，長度的情況下，DNA片段長度與丙烯酰片段長度與丙烯酰胺的濃度選擇如下胺的濃度選擇如下:DNA片段長度片段長度(核苷核苷酸數(shù)酸數(shù))丙烯酰丙烯酰胺胺(%)1Kb700b3.5700b500b5500b200b8200b10-12PCR-SSCP的實(shí)驗(yàn)操作的實(shí)驗(yàn)操作 PAGE的制備：的制備：成分：成分： 濃度：濃度：8% 10%40%丙烯酰胺丙烯酰胺 8ml 10mlddH2O 26ml 24ml甘油甘油 4ml 4ml10 TBE 2ml 2mlTEMED 40ul 40ul10%AP 6

8、00ul 600ulPCR-SSCP的實(shí)驗(yàn)操作的實(shí)驗(yàn)操作 10TBE：Tris 108 g，硼酸，硼酸 55 g，0.5 mol/L EDTApH8.040ml，定容至，定容至1000 ml，高壓滅菌，高壓滅菌，4儲存。儲存。 40%丙烯酰胺貯備液交聯(lián)度丙烯酰胺貯備液交聯(lián)度49:1）：）：39.2 g丙烯酰胺，丙烯酰胺，0.8 g甲叉雙丙烯酰胺，溶解后定容至甲叉雙丙烯酰胺，溶解后定容至100 ml，過濾，避，過濾，避光光4儲存。儲存。 10過硫酸銨：過硫酸銨過硫酸銨：過硫酸銨 0.1 g 溶于溶于1 ml蒸餾水，蒸餾水，4貯貯存數(shù)周。存數(shù)周。 2上樣緩沖液：甲酰胺上樣緩沖液：甲酰胺 9.5 g

9、，0.5mol/L EDTA 0.4 ml，二甲苯藍(lán)二甲苯藍(lán)FF 5 mg,溴酚蘭溴酚蘭 5 mg，加水溶解，定容到，加水溶解，定容到10ml。 試劑配制：試劑配制：PCR-SSCP的實(shí)驗(yàn)操作的實(shí)驗(yàn)操作 （3按上表配制合適濃度的膠液，輕輕搖勻。用按上表配制合適濃度的膠液，輕輕搖勻。用1ml移液器吸取膠液，緩慢注入兩玻璃板間的空隙中，移液器吸取膠液，緩慢注入兩玻璃板間的空隙中，直至灌滿模具頂部，立即插入相應(yīng)的點(diǎn)樣梳，（小心直至灌滿模具頂部，立即插入相應(yīng)的點(diǎn)樣梳，（小心勿使梳齒下帶進(jìn)氣泡，并且不要將梳齒全部插入膠內(nèi)，勿使梳齒下帶進(jìn)氣泡，并且不要將梳齒全部插入膠內(nèi)，留約留約2mm梳齒于玻璃板上端，以

10、免拔梳時(shí)把膠孔拔梳齒于玻璃板上端，以免拔梳時(shí)把膠孔拔斷）。由于凝膠在聚合過程中有回縮，所以應(yīng)小心添斷）。由于凝膠在聚合過程中有回縮，所以應(yīng)小心添加些膠液于梳子處，水平放置，室溫聚合加些膠液于梳子處，水平放置，室溫聚合1hr。小心。小心取出點(diǎn)樣梳，在電泳槽內(nèi)灌入取出點(diǎn)樣梳，在電泳槽內(nèi)灌入 1TBE電泳緩沖液，電泳緩沖液，用槽內(nèi)的緩沖液反復(fù)沖洗點(diǎn)樣孔，以去除可能存在的用槽內(nèi)的緩沖液反復(fù)沖洗點(diǎn)樣孔，以去除可能存在的未聚合的聚丙烯酸胺和氣泡。樣品上膠前預(yù)電泳約未聚合的聚丙烯酸胺和氣泡。樣品上膠前預(yù)電泳約30分鐘。分鐘。PCR-SSCP的實(shí)驗(yàn)操作的實(shí)驗(yàn)操作 3.擴(kuò)增產(chǎn)物的處理：取擴(kuò)增產(chǎn)物的處理：取0.4

11、-1.2lPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物，加入加入15l 2上樣緩沖液中，混勻。上樣緩沖液中，混勻。100C變性變性10min，立即冰浴驟冷立即冰浴驟冷2分鐘以上。然后將分鐘以上。然后將10l混合物上樣，混合物上樣，以微量加樣器上樣。上樣時(shí)要注意不要有氣泡沖散樣以微量加樣器上樣。上樣時(shí)要注意不要有氣泡沖散樣品，而且速度要快，時(shí)間長了樣品易于擴(kuò)散。品，而且速度要快，時(shí)間長了樣品易于擴(kuò)散。 PCR-SSCP的實(shí)驗(yàn)操作的實(shí)驗(yàn)操作 4.電泳：根據(jù)擴(kuò)增片段的大小及電泳槽和凝膠的大電泳：根據(jù)擴(kuò)增片段的大小及電泳槽和凝膠的大小，決定電泳的電壓及電泳時(shí)間。通常室溫下以小，決定電泳的電壓及電泳時(shí)間。通常室溫下以l5V

12、cm電泳。電泳。 5.剝膠：電泳結(jié)束后，回收電泳緩沖液，取下電泳剝膠：電泳結(jié)束后，回收電泳緩沖液，取下電泳膠玻璃，用塑料楔子從玻璃板底部一角小心分開玻璃，膠玻璃，用塑料楔子從玻璃板底部一角小心分開玻璃，凝膠應(yīng)附著在一塊玻璃上，切去凝膠左上角，作為點(diǎn)樣凝膠應(yīng)附著在一塊玻璃上，切去凝膠左上角，作為點(diǎn)樣順序標(biāo)記。順序標(biāo)記。 PCR-SSCP的實(shí)驗(yàn)操作的實(shí)驗(yàn)操作 6.銀染法銀染法 試劑：試劑： 1.固定液固定液10%無水乙醇）：無水乙醇無水乙醇）：無水乙醇50ml，雙蒸水定，雙蒸水定容至容至500ml。 2.1%硝酸溶液：硝酸溶液：5ml硝酸，雙蒸水定容至硝酸，雙蒸水定容至500ml。 3.0.2%硝

13、酸銀溶液現(xiàn)配）：硝酸銀溶液現(xiàn)配）：1g硝酸銀，雙蒸水定容硝酸銀，雙蒸水定容至至500ml。 4.顯色液：顯色液：15g無水碳酸鈉，溶于無水碳酸鈉，溶于500ml雙蒸水，同時(shí)加雙蒸水，同時(shí)加入入250ul甲醛，混勻。臨用時(shí)配制。甲醛，混勻。臨用時(shí)配制。 PCR-SSCP的實(shí)驗(yàn)操作的實(shí)驗(yàn)操作 步驟：步驟：1.凝膠用固定液浸泡凝膠用固定液浸泡5-10分鐘，雙蒸水漂洗分鐘，雙蒸水漂洗2遍，每次遍，每次2 min ；2.1%硝酸溶液浸泡硝酸溶液浸泡5分鐘，雙蒸水漂洗分鐘，雙蒸水漂洗2遍；遍；3.0.2%硝酸銀溶液浸泡硝酸銀溶液浸泡20分鐘，雙蒸水漂洗分鐘，雙蒸水漂洗2遍，每次約遍，每次約10 s，輕輕漂

14、洗，輕輕漂洗 ；4.顯色液中顯色至條帶清晰而背景不至于過深，雙蒸水漂顯色液中顯色至條帶清晰而背景不至于過深，雙蒸水漂洗洗2遍；遍；5.銀染后的凝膠經(jīng)銀染后的凝膠經(jīng)SmartView成像，拍攝，電腦保存。成像，拍攝，電腦保存。PCR-SSCP的實(shí)驗(yàn)操作的實(shí)驗(yàn)操作 由于在由于在SSCP分析中非變性分析中非變性PAG電泳不是根據(jù)單鏈電泳不是根據(jù)單鏈DNA分子和帶電量的大小來分離的，而是以單鏈分子和帶電量的大小來分離的，而是以單鏈DNA片段空間構(gòu)片段空間構(gòu)象的立體位阻大小來實(shí)現(xiàn)分離的，因此，這種分離不能反映象的立體位阻大小來實(shí)現(xiàn)分離的，因此，這種分離不能反映出分子量的大小。有時(shí)正常鏈與突變鏈的遷移率很

15、接近，很出分子量的大小。有時(shí)正常鏈與突變鏈的遷移率很接近，很難看出兩者之間的差別。因此一般要求電泳長度在難看出兩者之間的差別。因此一般要求電泳長度在16-18cm以上，以檢測限為指標(biāo)來判定結(jié)果。檢測限是指突變以上，以檢測限為指標(biāo)來判定結(jié)果。檢測限是指突變DNA片片段與正常段與正常DNA片段可分辨的電泳距離差的最小值。大于檢片段可分辨的電泳距離差的最小值。大于檢 測限則判定鏈的遷移率有改變，說明該測限則判定鏈的遷移率有改變，說明該DNA序列有變化，小序列有變化，小于檢測限則說明鏈之間無變化。例如，一般檢測限定為于檢測限則說明鏈之間無變化。例如，一般檢測限定為3mm，那么當(dāng)兩帶間距離在那么當(dāng)兩帶間

16、距離在3mm以上，則說明兩鏈之間有以上，則說明兩鏈之間有 改動(dòng)。改動(dòng)。另外檢測限不能定的太低，否則主觀因素太大，易造成假陽另外檢測限不能定的太低，否則主觀因素太大，易造成假陽性結(jié)果。另外，性結(jié)果。另外，SSCP 分析中其它條件，如分析中其它條件，如PCR產(chǎn)物的上樣產(chǎn)物的上樣量，量，PAG的交聯(lián)度、以及膠的濃度等，都應(yīng)根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)進(jìn)的交聯(lián)度、以及膠的濃度等，都應(yīng)根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)進(jìn)行選擇確定。行選擇確定。SSCP結(jié)果結(jié)果SSCP結(jié)果結(jié)果 對出現(xiàn)異常泳動(dòng)條帶的樣品，從對出現(xiàn)異常泳動(dòng)條帶的樣品，從PCR擴(kuò)增到擴(kuò)增到SSCP，均重復(fù)，均重復(fù)3次，獲相同結(jié)果，再送測序確證，以次，獲相同結(jié)果，再送測序確證，以排

17、除排除PCR反應(yīng)中的錯(cuò)配或電泳條件差異引起的偶然現(xiàn)反應(yīng)中的錯(cuò)配或電泳條件差異引起的偶然現(xiàn)象，既使結(jié)果可靠，又避免不必要的測序。象，既使結(jié)果可靠，又避免不必要的測序。 質(zhì)量控制質(zhì)量控制 1.DNA片段的大小和組成片段的大小和組成:用于用于SSCP分析的分析的DNA片段片段越小，檢測的敏感性越高。越小，檢測的敏感性越高。200 bp的的DNA片段檢出率為片段檢出率為90%，200500 bp的的DNA片段檢出率為片段檢出率為7080%，而，而500 bp的的DNA片段檢出率片段檢出率50%。對于大于。對于大于400bp的的PCR產(chǎn)物就需要設(shè)法進(jìn)一步處理，可以用限制性酶消化產(chǎn)物就需要設(shè)法進(jìn)一步處理，

18、可以用限制性酶消化PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生小于產(chǎn)物，產(chǎn)生小于400bP的的DNA片段，再進(jìn)行片段，再進(jìn)行SSCP分析。分析。另一方面，核酸片段中堿基的組成以及突變位點(diǎn)臨近的核另一方面，核酸片段中堿基的組成以及突變位點(diǎn)臨近的核酸序列也可能影響其電泳速度，如富嘌呤序列較富嘧啶序酸序列也可能影響其電泳速度，如富嘌呤序列較富嘧啶序列對堿基變異更敏感。列對堿基變異更敏感。 PCR-SSCP注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) 2.PCR產(chǎn)量和特異性：產(chǎn)量和特異性：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的高度特異擴(kuò)增產(chǎn)物的高度特異性是性是SSCP成功的前提。首先要優(yōu)化成功的前提。首先要優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，以反應(yīng)條件，以免非特異擴(kuò)增帶干擾結(jié)果分析；其次要避免

19、免非特異擴(kuò)增帶干擾結(jié)果分析；其次要避免PCR操作操作過程的污染。在使用大量過程的污染。在使用大量PCR產(chǎn)物時(shí)，變性的單鏈產(chǎn)物時(shí)，變性的單鏈DNA會(huì)很快地復(fù)性，從而影響會(huì)很快地復(fù)性，從而影響SSCP檢測的敏感性；但檢測的敏感性；但如果減少如果減少PCR產(chǎn)量，則可能因?yàn)閱捂湲a(chǎn)量，則可能因?yàn)閱捂淒NA太少而降低太少而降低敏感性，所以上樣量也要進(jìn)行摸索。敏感性，所以上樣量也要進(jìn)行摸索。PCR-SSCP注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) 3. 游離引物游離引物: 游離引物可能同游離引物可能同 PCR產(chǎn)物結(jié)合而改變產(chǎn)物結(jié)合而改變其泳動(dòng)率，即使游離引物量為其泳動(dòng)率，即使游離引物量為6nM都有明顯影響。因此，都有明顯影響。因此

20、，應(yīng)盡可能除去游離引物。可以采用不對稱引物擴(kuò)增方法，應(yīng)盡可能除去游離引物?？梢圆捎貌粚ΨQ引物擴(kuò)增方法，盡可能消耗多余的引物。也可以運(yùn)用過柱或磁性球方法盡可能消耗多余的引物。也可以運(yùn)用過柱或磁性球方法純化純化PCR產(chǎn)物?；蛘呤窍♂尞a(chǎn)物?；蛘呤窍♂孭CR產(chǎn)物，減少游離引物的產(chǎn)物，減少游離引物的干擾。干擾。PCR-SSCP注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) 4.低濃度變性劑低濃度變性劑: 凝膠中加入低濃度的變性劑，如凝膠中加入低濃度的變性劑，如5-10甘油、甘油、5尿素或甲酸胺、尿素或甲酸胺、10二甲亞砜二甲亞砜DMSO或蔗糖等有助于提高敏感性，可能是因?yàn)檩p或蔗糖等有助于提高敏感性，可能是因?yàn)檩p微改變單鏈微改變單鏈D

21、NA的構(gòu)象，增加分子的表面積，降低單鏈的構(gòu)象，增加分子的表面積，降低單鏈DNA的泳動(dòng)率。但有些變異序列卻只能在沒有甘油的凝的泳動(dòng)率。但有些變異序列卻只能在沒有甘油的凝膠中被檢出。因此，對同一序列使用膠中被檢出。因此，對同一序列使用23種條件做種條件做SSCP，可能提高敏感性?？赡芴岣呙舾行?。 PCR-SSCP注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) 5.凝膠濃度、交聯(lián)度及厚度凝膠濃度、交聯(lián)度及厚度: 凝膠濃度和交聯(lián)度決定凝膠濃度和交聯(lián)度決定凝膠孔徑大小，因而影響單鏈凝膠孔徑大小，因而影響單鏈DNA泳動(dòng)速度和對構(gòu)象的泳動(dòng)速度和對構(gòu)象的分辨率。不同大小分辨率。不同大小DNA片段的最適濃度不同，本人以往片段的最適濃度不同，

22、本人以往實(shí)驗(yàn)根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)選擇了實(shí)驗(yàn)根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)選擇了8%凝膠。凝膠濃度不同，突變凝膠。凝膠濃度不同，突變帶的相對位置也不相同，如果在進(jìn)行未知突變種類的帶的相對位置也不相同，如果在進(jìn)行未知突變種類的SSCP分析時(shí)，最好采用兩種以上凝膠濃度，這樣可以提分析時(shí)，最好采用兩種以上凝膠濃度，這樣可以提高突變種類的檢出率。凝膠的厚度對高突變種類的檢出率。凝膠的厚度對SSCP分析也很重要，分析也很重要，凝膠越厚，背景越深，在上樣量較多的前提下，盡量使凝膠越厚，背景越深，在上樣量較多的前提下，盡量使凝膠越薄越好。凝膠越薄越好。PCR-SSCP注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) 6.電泳溫度：單鏈電泳溫度：單鏈DNA的構(gòu)象取決于

23、溫度和分子內(nèi)的構(gòu)象取決于溫度和分子內(nèi)部弱的穩(wěn)定力之間的平衡，溫度是部弱的穩(wěn)定力之間的平衡，溫度是SSCP分析中至關(guān)重分析中至關(guān)重要的影響因素，不同的要的影響因素，不同的DNA片段應(yīng)盡可能調(diào)試在最適片段應(yīng)盡可能調(diào)試在最適溫度下進(jìn)行電泳，一般溫度下進(jìn)行電泳，一般4-15之間。但由于在電泳時(shí)之間。但由于在電泳時(shí)溫度會(huì)升高，為確保電泳溫度相對恒定，應(yīng)采取以下溫度會(huì)升高，為確保電泳溫度相對恒定，應(yīng)采取以下措施：減少凝膠厚度，降低電壓，有效的空氣冷卻或措施：減少凝膠厚度，降低電壓，有效的空氣冷卻或循環(huán)水冷卻等。循環(huán)水冷卻等。 PCR-SSCP注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)PCR-SSCP注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) 7.電泳電壓的

24、影響電泳電壓的影響: 在電泳過程中除環(huán)境溫度外，在電泳過程中除環(huán)境溫度外，電壓過高也是引起溫度升高的主要原因，因此，在沒有電壓過高也是引起溫度升高的主要原因，因此，在沒有冷卻裝置的電泳槽上進(jìn)行冷卻裝置的電泳槽上進(jìn)行SSCP時(shí)，開始的時(shí)，開始的5min應(yīng)用較應(yīng)用較高的電壓高的電壓(550V)，以后用，以后用400V左右電壓進(jìn)行電泳。這主左右電壓進(jìn)行電泳。這主要是由于開始的高電壓可以使不同立體構(gòu)象的單鏈要是由于開始的高電壓可以使不同立體構(gòu)象的單鏈DNA初步分離，而凝膠的溫度不會(huì)升高初步分離，而凝膠的溫度不會(huì)升高.隨后的低電壓電泳可隨后的低電壓電泳可以使之進(jìn)一步分離。在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)條件確定以使之進(jìn)一步分離。在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)根