基因組RNA的復(fù)制呂遠(yuǎn)生工A

1、 基因組基因組RNA的復(fù)制的復(fù)制提綱提綱一依賴于RNA的RNA合成1.雙鏈RNA病毒的RNA復(fù)制2.單鏈RNA病毒的RNA復(fù)制二以DNA為中間物的RNA復(fù)制1.逆轉(zhuǎn)錄病毒的RNA復(fù)制2.逆轉(zhuǎn)座子3.端聚酶催化的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)4.某些DNA病毒生活史中的逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象依賴于依賴于RNA的的RNA合成合成1. RdRP主要由病毒基因組編碼，有的還需要宿主細(xì)胞編碼的輔助蛋白2. 合成的方向總是533. 絕大多數(shù)在模板的一端從頭啟動(dòng)合成，少數(shù)需要合成引物4. 屬于易錯(cuò)、高突變合成 5. 對(duì)放線菌素D不敏感，但對(duì)核糖核酸酶敏感6. 復(fù)制的場(chǎng)所絕大多數(shù)在宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，少數(shù)在細(xì)胞核 正鏈正鏈RNA和負(fù)鏈和負(fù)鏈R

2、NA基因組的復(fù)制基因組的復(fù)制 逆轉(zhuǎn)錄病毒的發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄病毒的發(fā)現(xiàn)C上世紀(jì)60年代，Howard Temin觀察到某些RNA病毒的復(fù)制和增殖受到DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的抑制劑放線菌素D的抑制，于是他大膽地推測(cè)到這些病毒的生活史中有DNA中間物的存在或者有從RNA到DNA的逆轉(zhuǎn)錄過程。C1970年，Temin和David Baltimore 各自從RNA腫瘤病毒中純化到催化以RNA為模板合成DNA的逆轉(zhuǎn)錄酶，為逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象的存在提供了最直接的證據(jù)。Termin和Baltimore的發(fā)現(xiàn)使“中心法則”不得不進(jìn)行修改，加上了逆轉(zhuǎn)錄內(nèi)容。 逆轉(zhuǎn)錄病毒與癌基因逆轉(zhuǎn)錄病毒與癌基因所有的RNA腫瘤病毒都是逆轉(zhuǎn)錄病毒RN

3、A病毒中的癌基因是宿主細(xì)胞正常癌基因的變化形式 逆轉(zhuǎn)錄病毒的例子： 勞氏肉瘤病毒（RSV） 貓白血病病毒 小鼠乳房癌病毒 艾滋病毒（HIV）逆轉(zhuǎn)錄病毒的逆轉(zhuǎn)錄病毒的RNA復(fù)制復(fù)制 逆轉(zhuǎn)錄病毒的結(jié)構(gòu) 逆轉(zhuǎn)錄病毒的生活史1. 附著與融合2. 核心顆粒釋放和逆轉(zhuǎn)錄3. 原病毒DNA進(jìn)入細(xì)胞核4. 整合5. 轉(zhuǎn)錄及后加工6. 轉(zhuǎn)錄物輸出到細(xì)胞質(zhì)7. 翻譯及翻譯后加工8. 新病毒裝配和出芽釋放 逆轉(zhuǎn)錄病毒的結(jié)構(gòu)逆轉(zhuǎn)錄病毒的結(jié)構(gòu)逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組RNA的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu) 逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組RNA等同于一個(gè)全長(zhǎng)的病毒mRNA，其非編碼序列包括5端的帽子結(jié)構(gòu)、5端的末端直接重復(fù)序列（R）、5端特有

4、的序列（U5）、引物結(jié)合位點(diǎn)（PBS）、剪接信號(hào)、引發(fā)第二條鏈合成的多聚嘌呤區(qū)域（PPT）、3 端的多聚腺苷酸尾巴、3 端特有的序列（U3）和3端的末端直接重復(fù)序列。編碼序列通常含有3個(gè)結(jié)構(gòu)基因，它們是編碼MA、CA和NC的gag基因，編碼逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶和蛋白酶的pol基因以及編碼SU和TM的env基因。如果是腫瘤病毒，還含有編碼癌蛋白的癌基因onc。逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的結(jié)構(gòu)逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的結(jié)構(gòu)HIV-1 基因組基因組雙倍體：每一個(gè)拷貝的RNA大小= 9 749 nttRNALys引物與每一個(gè)RNA結(jié)合5-帽子+3-Poly A尾巴；編碼9種蛋白質(zhì)帽子-R-U5-PPT-(10個(gè)ORF)-U

5、3-R-Poly A原病毒 (2XDNA) 的LTR: U3-R-U5 = 634 bp U3 = 453bpR = 98bpU5 = 83bp逆轉(zhuǎn)錄病毒的生活史逆轉(zhuǎn)錄病毒的生活史HIV的附著與融合的附著與融合 E這是由受體和輔助受體介導(dǎo)的病毒顆粒外被與宿主細(xì)胞膜先特異性附著、后融合的過程。作為受體和輔助受體的分別是CD4蛋白和趨化因子受體CCR5或CXCR4，而配體是病毒表面糖蛋白gp120和gp41。E HIV的宿主細(xì)胞主要包括：CD4-T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，這些細(xì)胞都含有CD4蛋白和趨化因子受體。艾滋病毒與宿主細(xì)胞的附著艾滋病毒與宿主細(xì)胞的附著艾滋病毒外被與宿主細(xì)胞

6、膜的融合艾滋病毒外被與宿主細(xì)胞膜的融合HIV-1病毒的附著與融合病毒的附著與融合CD4趨化因子受體趨化因子受體宿主細(xì)胞膜宿主細(xì)胞膜gp120gp41病毒外膜病毒外膜融合肽融合肽NCNC核心顆粒釋放和逆轉(zhuǎn)錄核心顆粒釋放和逆轉(zhuǎn)錄 當(dāng)HIV-1外被與宿主細(xì)胞膜融合以后，由衣殼包被的基因組RNA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，隨后在與基因組RNA結(jié)合的逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下開始逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒兩種形式的差異兩種形式的差異RNA R U5 GAG POL ENV U3 RLTR重復(fù)重復(fù)序列序列重復(fù)重復(fù)序列序列DNAU3 R U5 GAG POL ENV U3 R U5LTR逆轉(zhuǎn)錄酶的結(jié)構(gòu)與功能逆轉(zhuǎn)錄酶的結(jié)構(gòu)與功能具有

7、三個(gè)酶活性：（1）53 的依賴于RNA的DNA聚合酶活性，該活性用來(lái)催化負(fù)鏈DNA的合成；（2）核糖核酸酶H活性，該活性用來(lái)水解tRNA引物和基因組RNA；（3）5 3 的依賴于DNA的DNA聚合酶活性，該活性用來(lái)合成正鏈DNA。逆轉(zhuǎn)錄酶的聚合酶活性與其它聚合酶一樣位于由三個(gè)結(jié)構(gòu)域折疊成的“手掌-手指-拇指” 模體之中，但核糖核酸酶H活性位于另外一個(gè)結(jié)構(gòu)域之中。使用使用RNA聚合酶聚合酶II拷貝逆轉(zhuǎn)錄基因組的問題拷貝逆轉(zhuǎn)錄基因組的問題后果后果: 新拷貝的病毒新拷貝的病毒RNA變短變短-缺乏控制元件缺乏控制元件 啟動(dòng)子啟動(dòng)子病毒病毒 RNA逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶 R U5U3 RU3 R U5U3 R

8、 U5形成長(zhǎng)末端重復(fù)序列形成長(zhǎng)末端重復(fù)序列RNARNA起始位點(diǎn)起始位點(diǎn)RNARNA終止位點(diǎn)終止位點(diǎn)POLIIPOLII逆轉(zhuǎn)錄病毒只有一個(gè)啟動(dòng)子（包含在逆轉(zhuǎn)錄病毒只有一個(gè)啟動(dòng)子（包含在U3）逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組逆轉(zhuǎn)錄的詳細(xì)過程逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組逆轉(zhuǎn)錄的詳細(xì)過程原病毒原病毒DNA進(jìn)入細(xì)胞核進(jìn)入細(xì)胞核逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的原病毒DNA單獨(dú)并不能進(jìn)入細(xì)胞核，它先需要與病毒蛋白VPR、MA和IN一起組成核蛋白的形式，然后在位于IN上的細(xì)胞核定位信號(hào)（NLS）的指導(dǎo)下通過核孔進(jìn)入細(xì)胞核，此外，在逆轉(zhuǎn)錄過程中形成的一小段三鏈病毒cDNA上的中央翼式結(jié)構(gòu)在其中可能也起一定的作用。 原病毒原病毒DNA進(jìn)入細(xì)胞核的機(jī)理進(jìn)入細(xì)胞核

9、的機(jī)理原病毒原病毒DNA的整合的整合整合是病毒cDNA與宿主染色體DNA的共價(jià)連接，整合位點(diǎn)是隨機(jī)的。整合的病毒cDNA將成為受感染細(xì)胞的永久性遺傳物質(zhì)，它隨著宿主DNA的復(fù)制而復(fù)制，從而傳給子細(xì)胞。具體的整合反應(yīng)是：整合酶首先在距離兩端LTR3-端2個(gè)核苷酸的位置切開LTR丟掉2個(gè)核苷酸，產(chǎn)生隱縮的3-端，同時(shí)在宿主細(xì)胞的DNA上交錯(cuò)切開，然后將原病毒DNA隱縮的3-端和宿主細(xì)胞DNA突出的5-端連接起來(lái)。最后由宿主細(xì)胞內(nèi)的修復(fù)系統(tǒng)將空缺填補(bǔ)，完成整合過程。原病毒原病毒DNA的整合的整合轉(zhuǎn)錄及后加工轉(zhuǎn)錄及后加工EHIV的轉(zhuǎn)錄是在宿主細(xì)胞RNA聚合酶II催化下完成的，其全長(zhǎng)初級(jí)轉(zhuǎn)錄物的長(zhǎng)度為9

10、kb。轉(zhuǎn)錄開始于U3-R 的連接點(diǎn)。然而，如果沒有Tat蛋白，RNA 聚合酶II復(fù)合物的進(jìn)行性不足，轉(zhuǎn)錄雖然仍以正常的速率進(jìn)行，但將終止于+80nt的位置，轉(zhuǎn)錄物僅僅是長(zhǎng)為70nt左右 的TAR序列，而非全長(zhǎng)的基因組大小的RNA；如果有Tat蛋白與TAR結(jié)合，則通過招募周期蛋白和依賴于周期蛋白的激酶9（CDK9）到近啟動(dòng)子位置，促進(jìn)CTD的高度磷酸化，有利于啟動(dòng)子清空，增強(qiáng)聚合酶II的進(jìn)行性，使RNA聚合酶能夠合成全長(zhǎng)的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物。艾滋病毒原病毒艾滋病毒原病毒DNA轉(zhuǎn)錄的抗終止作用轉(zhuǎn)錄的抗終止作用GAG、GAG-POL和和ENV的形成的形成RNA前體的不同命運(yùn)前體的不同命運(yùn)逆轉(zhuǎn)錄病毒的RNA轉(zhuǎn)

11、錄物像宿主細(xì)胞的mRNA前體一樣經(jīng)歷同樣的后加工反應(yīng)，包括戴帽和加尾，剪接有的發(fā)生，有的不發(fā)生。成為子病毒基因組RNA，加上tRNALys翻譯成GAG多聚蛋白質(zhì)通過翻譯后移框產(chǎn)生GAG-POL剪接成ENV的mRNA發(fā)生選擇性剪接，產(chǎn)生多種類型的mRNA，以編碼除了env基因產(chǎn)物以外的病毒特有的調(diào)節(jié)蛋白和輔助蛋白 艾滋病毒基因組艾滋病毒基因組RNA含有的可能剪接位點(diǎn)含有的可能剪接位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄物輸出到細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄物輸出到細(xì)胞質(zhì)剪接完全的轉(zhuǎn)錄物與宿主細(xì)胞的剪接好的轉(zhuǎn)錄物使用同樣的機(jī)制離開細(xì)胞核，但沒有剪接的或僅發(fā)生單一剪接反應(yīng)的依然含有多重剪接信號(hào)的mRNA需要一種含有細(xì)胞核輸出信號(hào)（NES）的Rev蛋白

12、。Rev與沒有剪接的RNA上的發(fā)夾結(jié)構(gòu)Rev反應(yīng)元件（RRE）結(jié)合，其NES被CRM1識(shí)別。剪接不完全的逆轉(zhuǎn)錄病毒剪接不完全的逆轉(zhuǎn)錄病毒mRNA離開細(xì)胞核的機(jī)制離開細(xì)胞核的機(jī)制翻譯及翻譯后加工翻譯及翻譯后加工 逆轉(zhuǎn)錄病毒使用多聚蛋白質(zhì)提高其基因組的編碼能力 所有的逆轉(zhuǎn)錄病毒都可以產(chǎn)生三種多聚蛋白質(zhì)即多聚GAG、多聚GAG-POL和多聚ENV，剪接過的或非剪接過的mRNA在從細(xì)胞核運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)后都可以作為模板進(jìn)行翻譯。其中9kb轉(zhuǎn)錄物被正常翻譯成多聚GAG或經(jīng)移框翻譯出多聚GAG-POL融合蛋白。這兩種多聚蛋白在病毒組裝過程中被多聚GAG-POL上的蛋白酶結(jié)構(gòu)域切割成各種蛋白質(zhì)單體。其中多聚GA

13、G可產(chǎn)生MA、CA和NC等幾種病毒內(nèi)部結(jié)構(gòu)蛋白。 一種剪接過的mRNA（含有env基因）被翻譯成gp160多聚蛋白，并進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行糖基化修飾，在高爾基體被宿主細(xì)胞的蛋白酶剪接成gp120和gp41，將來(lái)分別成為SU和TM。 多聚GAG-POL除了產(chǎn)生MA、CA和NC以外，還能產(chǎn)生蛋白酶、逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶。多聚GAG-POL的量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于多聚GAG的量，因?yàn)樽鳛閷?duì)酶分子的需求顯然小于對(duì)結(jié)構(gòu)蛋白的需求。新病毒裝配和出芽釋放新病毒裝配和出芽釋放 GAG與GAG-POL的內(nèi)部核心自發(fā)裝配成“顆?！?； 兩個(gè)拷貝的9kb長(zhǎng)的基因組RNA隨著GAG之中的NC部分與病毒RNA上的包裝序列結(jié)合進(jìn)入顆粒之中。

14、GAG和GAG-POL上的Myr-MA部分指導(dǎo)復(fù)合物，到達(dá)插有g(shù)p120-gp41復(fù)合物的細(xì)胞膜上。 顆粒與內(nèi)部的gp41結(jié)構(gòu)域結(jié)合，并開始出芽。 在出芽期間或出芽以后，GAG 和GAG-POL 被病毒的蛋白酶切割，成為各種單體，其中蛋白酶、逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶與基因組RNA相連，其它結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成衣殼包裹基因組RNA。在出芽過程中，含有g(shù)p120-gp41的細(xì)胞膜包被在病毒顆粒的最外面。在顆粒釋放以后，GAG和GAG-POL繼續(xù)切割。 病毒蛋白酶雖然不是病毒裝配所必需的，但卻是病毒成熟和獲得感染性所必需的?，F(xiàn)在，HIV蛋白酶的抑制劑已成為抗艾滋病雞尾酒療法中的標(biāo)準(zhǔn)成分。艾滋病毒完整的生活史艾滋病毒

15、完整的生活史艾滋病的混合療法或雞尾酒療法艾滋病的混合療法或雞尾酒療法各種逆轉(zhuǎn)錄元件各種逆轉(zhuǎn)錄元件某些某些DNA病毒生活史中的逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象病毒生活史中的逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象E某些DNA病毒，例如花椰菜鑲嵌病毒（CaMV）、乙型肝炎病毒（HBV）和其它一些嗜肝DNA病毒，盡管遺傳物質(zhì)是DNA，但其生活史中也有從RNA到DNA的逆轉(zhuǎn)錄過程。這些DNA病毒被稱為泛反轉(zhuǎn)錄病毒乙型肝炎病毒的生活史乙型肝炎病毒的生活史細(xì)菌內(nèi)發(fā)現(xiàn)的逆轉(zhuǎn)錄事件細(xì)菌內(nèi)發(fā)現(xiàn)的逆轉(zhuǎn)錄事件逆轉(zhuǎn)錄也發(fā)現(xiàn)在粘球菌、大腸桿菌和一些革蘭氏陽(yáng)性桿菌（如根瘤菌）之中。這些細(xì)菌體內(nèi)存在一種奇怪的核酸被稱為msDNA。該核酸是通過特殊的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)形成的。msDNA由1個(gè)R