食品微生物檢驗(yàn)學(xué)

1、食品微生物檢驗(yàn)學(xué)二、食品微生物檢驗(yàn)學(xué)1、概念食品微生物檢驗(yàn)學(xué)是運(yùn)用微生物學(xué)的理論與技術(shù)，研究食品中微生物的種類、特性等，建立食品微生物學(xué)檢驗(yàn)方法和確定食品衛(wèi)生的微生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的一門(mén)應(yīng)用性科學(xué)。2、特點(diǎn)1)研究對(duì)象以及研究范圍廣:食品種類多，各有特色，分布不同；微生物的種類非常多，數(shù)量巨大；在食品來(lái)源、加工、運(yùn)輸?shù)榷伎赡苁艿礁鞣N微生物的污染。2)涉及學(xué)科多樣 :涉及生物學(xué)、生物化學(xué)、工藝學(xué)、發(fā)酵學(xué)等方面的知識(shí)，以及獸醫(yī)學(xué)方面的知識(shí)等。3)實(shí)用性及應(yīng)用性強(qiáng):在促進(jìn)人類健康方面起著重要的作用。檢驗(yàn)利用、控制微生物防止食品變質(zhì)和杜絕因食源性病害保證食品衛(wèi)生的安全。4)采用標(biāo)準(zhǔn)化(受法規(guī)約束):中華人民共

2、和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品衛(wèi)生檢驗(yàn)方法是法定的檢驗(yàn)依據(jù)。3、目的 為生產(chǎn)出安全、衛(wèi)生、符合標(biāo)準(zhǔn)的食品提供科學(xué)依據(jù)，保證人類獲得符合衛(wèi)生要求、適于人類消費(fèi)的食品。4、食品微生物檢驗(yàn)學(xué)的任務(wù)1)研究各類食品中微生物種類、分布及其特性2)研究食品的微生物污染及其控制，提高食品的衛(wèi)生質(zhì)量3)研究微生物與食品保藏的關(guān)系4)研究食品中的致病性、中毒性、致腐性微生物5)研究各類食品中微生物的檢驗(yàn)方法及標(biāo)準(zhǔn)5、食品微生物檢驗(yàn)的發(fā)展食品微生物檢驗(yàn)學(xué)的發(fā)展是與整個(gè)微生物學(xué)的發(fā)展是分不開(kāi)的。人類很早就開(kāi)始利用微生物的許多特性為人類的生產(chǎn)、生活服務(wù)，古代人類早已將微生物學(xué)知識(shí)用于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和疾病防治中，公元前二千多年的夏禹時(shí)代

3、，就有儀狄釀酒的記載。北魏(公元386534年)齊民要術(shù)一書(shū)中詳細(xì)記載了制醋的方法。長(zhǎng)期以來(lái)民間常用的鹽腌、糖漬、煙熏、風(fēng)干等保存食物的方法，實(shí)際上正是通過(guò)抑制微生物的生長(zhǎng)而防止食物的腐爛變質(zhì)。在預(yù)防醫(yī)學(xué)方面，我國(guó)自古就有將水煮沸后飲用的習(xí)慣。明朝李時(shí)珍在本草綱目中指出，將病人的衣服蒸過(guò)后再穿就不會(huì)傳染上疾病，說(shuō)明已有消毒的記載。1)致病菌檢測(cè)階段微生物的發(fā)現(xiàn)：首先觀察到微生物的是荷蘭人呂文虎克(Antory Van Leeuwenhoek，16321723)。他于1676年用自磨鏡片制造了世界上第一架顯微鏡(約放大300倍)，并從雨水、牙垢等標(biāo)本中第一次觀察和描述了各種形態(tài)的微生物，為微生物

4、的存在提供了有力證據(jù)，并確定了細(xì)菌的三種基本形狀：球菌、桿菌和螺旋菌，呂文虎克也被稱為顯微鏡之父。微生物與食品腐?。悍▏?guó)科學(xué)家巴斯德(Louis Pasteur,18221895)首先實(shí)驗(yàn)證明有機(jī)物質(zhì)的發(fā)酵與腐敗是由微生物作用的結(jié)果，而酒類變質(zhì)是因污染了雜菌，從而推翻了當(dāng)時(shí)盛行的自然發(fā)生說(shuō)。巴斯德病原體研究和預(yù)防方面也作出了卓越的貢獻(xiàn)，他發(fā)明了巴氏消毒法，被稱為現(xiàn)代微生物學(xué)之父。病原微生物：19世紀(jì)末至20世紀(jì)初，在巴斯德和科赫光輝業(yè)績(jī)的影響下，國(guó)際上形成了尋找病原微生物的熱潮。有關(guān)食品微生物學(xué)方面的研究也主要是檢測(cè)致病菌。我國(guó)從50年代起開(kāi)始對(duì)沙門(mén)氏菌、葡萄球菌、鏈球菌等食物中毒菌進(jìn)行調(diào)查研

5、究，并建立了各種食物中毒的細(xì)菌分離鑒定方法。2)指示菌檢測(cè)階段在我國(guó)，80的傳染病是腸道傳染病，為了預(yù)防腸道傳染病，各種食品微生物的檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的制定，是食品微生物檢驗(yàn)的重要研究?jī)?nèi)容之一。通過(guò)這些方法和標(biāo)準(zhǔn)，可以檢測(cè)并判斷水、空氣、土壤、食品、日常用品以及各類公共場(chǎng)所的安全衛(wèi)生狀況。但是，直接檢測(cè)目的病原微生物，難(why?)需尋找?guī)в兄甘拘缘奈⑸?指示菌) 根據(jù)其檢出情況，判斷樣品被污染程度，并間接指示致病微生物有無(wú)存在可能，以及對(duì)人群是否構(gòu)成潛在威脅。指示菌(Indicator Organism)：是在常規(guī)安全衛(wèi)生檢測(cè)中，用以指示檢驗(yàn)樣品衛(wèi)生狀況及安全性的指示性微生物。檢驗(yàn)指示菌的

6、目的，主要是以指示菌在檢品中存在與否以及數(shù)量多少為依據(jù)，對(duì)照國(guó)家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)檢品的飲用、食用或使用的安全性作出評(píng)價(jià)。這些微生物應(yīng)該在環(huán)境中存在數(shù)量較多，易于檢出，檢測(cè)方法較簡(jiǎn)單，而且具有一定的代表性。指示菌可分為三種類型：A 評(píng)價(jià)被檢樣品一般衛(wèi)生質(zhì)量、污染程度以及安全性的指示菌最常用的是菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)。B 糞便污染的指示菌主要指大腸菌群。其他還有腸球菌、亞硫酸鹽還原梭菌等。其檢出標(biāo)志著檢品受過(guò)人、畜糞便的污染，而且有腸道病原微生物存在的可能性。C 其他指示菌包括某些特定環(huán)境不能檢出的菌類，如特定菌、某些致病菌或其他指示性微生物。3)微生態(tài)制劑檢測(cè)階段19世紀(jì)人們就發(fā)現(xiàn)并開(kāi)始認(rèn)識(shí)厭氧菌

7、(巴斯德，1863)，但直到20世紀(jì)70年代了解到厭氧菌主要是無(wú)芽孢專性厭氧菌后，才開(kāi)始重新重視其研究。厭氧菌廣泛分布在自然界，尤其是廣泛存在于人和動(dòng)物皮膚和腸道。生態(tài)平衡時(shí)，與人和動(dòng)物體“和平共處”。生態(tài)失調(diào)時(shí)，成為條件致病菌(opportunistic organism)，形成厭氧菌感染癥。由此，市場(chǎng)上出現(xiàn)了以乳酸菌、雙歧桿菌為主的各種微生態(tài)制劑后(1980s以來(lái))，檢驗(yàn)其菌株特性和數(shù)量就成了目前食品微生物檢測(cè)的一項(xiàng)重要內(nèi)容。4)現(xiàn)代基因工程菌和尚未能培養(yǎng)菌的檢測(cè)§轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、植物和基因工程菌被批準(zhǔn)使用以及進(jìn)入商品化生產(chǎn)，加大了食品微生物檢測(cè)的任務(wù)。§目前也發(fā)現(xiàn)了一些尚

8、未能培養(yǎng)的微生物，這也促進(jìn)了食品微生物檢驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展。§在微生物應(yīng)用技術(shù)、實(shí)驗(yàn)方法方面也有極其迅速的發(fā)展。如電鏡技術(shù)的進(jìn)步，并結(jié)合生物化學(xué)、電泳法、免疫化學(xué)等的技術(shù)，推動(dòng)了對(duì)微生物的分類和鑒定。熒光抗體技術(shù)、單抗技術(shù)、PCR技術(shù)等，也進(jìn)一步促進(jìn)了微生物檢驗(yàn)的發(fā)展。6、我國(guó)食品微生物檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)1)進(jìn)出口檢驗(yàn) 國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局2)國(guó)內(nèi)檢驗(yàn) 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心(CDC)營(yíng)養(yǎng)與食品安全所是我國(guó)食品衛(wèi)生檢驗(yàn)評(píng)價(jià)的權(quán)威機(jī)構(gòu)。 食品衛(wèi)生監(jiān)督機(jī)構(gòu)：各級(jí)衛(wèi)生局下屬 衛(wèi)生監(jiān)督所 屠宰檢驗(yàn)：獸醫(yī)衛(wèi)生監(jiān)督所+單位自檢 食品加工企業(yè)自檢食品微生物檢驗(yàn)學(xué)作為給人類提供有益于健康、能確保食用安全的食品的科

9、學(xué)保障之一，業(yè)已受到人們的重視，有著廣闊的發(fā)展前景。第一章 微生物檢驗(yàn)鑒定技術(shù)第一節(jié) 微生物檢驗(yàn)基本知識(shí)包括顯微鏡檢、染色技術(shù)、培養(yǎng)基制備技術(shù)、接種、分離純化和培養(yǎng)技術(shù)等一、接種(inoculation)將微生物接到適于它生長(zhǎng)繁殖的人工培養(yǎng)基上或活的生物體內(nèi)的過(guò)程叫做接種。1. 接種工具 接種針 接種環(huán) 接種鉤 玻璃涂棒 接種圈 接種鋤 小解剖刀2. 常用的接種方法 有以下幾種：1)劃線接種 最常用。常用的接種工具有接種環(huán)，接種針等。在斜面接種和平板劃線中就常用此法。2)三點(diǎn)接種 在研究霉菌形態(tài)時(shí)常用此法。此法即把少量的微生物接種在平板表面上，成等邊三角形的三點(diǎn)，讓它各自獨(dú)立形成菌落后，來(lái)觀察

10、、研究它們的形態(tài)。3)穿刺接種 在保藏厭氧菌種或研究微生物的動(dòng)力時(shí)常用。用的接種工具是接種針。培養(yǎng)基一般是半固體培養(yǎng)基4)傾注接種 該法是將待接種微生物先放入培養(yǎng)皿中，然后再倒入冷卻至45°C左右的固體培養(yǎng)基，迅速輕輕搖勻，以達(dá)到稀釋菌液的目的。待平板凝固之后，置合適溫度下培養(yǎng)，就可長(zhǎng)出單個(gè)的微生物菌落。5)涂布接種 先倒好平板，讓其凝固，然后再將菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作來(lái)回左右的涂布，使菌液均勻分布，即可長(zhǎng)出單個(gè)菌落。6)液體接種 從固體培養(yǎng)基中將菌洗下，倒入液體培養(yǎng)基中；或者從液體培養(yǎng)物中，用移液管將菌液接至液體培養(yǎng)基中，都屬于液體接種。7)注射接種 用注射的方法將

11、微生物轉(zhuǎn)接至活的生物體內(nèi)，常見(jiàn)的疫苗預(yù)防接種，就是用注射接種。8)活體接種 是專用于培養(yǎng)病毒或其它病原微生物的一種方法。所用的活體可以是整個(gè)動(dòng)物；也可以是某個(gè)離體活組織，例如猴腎等；也可以是發(fā)育的雞胚。接種的方式有注射、灌喂、拌料喂養(yǎng)等。3. 無(wú)菌操作(Aseptic technique)培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后，用經(jīng)過(guò)滅菌的工具(如接種針和吸管等)在無(wú)菌條件下接種含菌材料(如樣品、菌苔或菌懸液等)于培養(yǎng)基上，這個(gè)過(guò)程叫做無(wú)菌接種操作。 在實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)中的各種接種必須是無(wú)菌操作。二、分離純化(Isolation)含有一種以上的微生物培養(yǎng)物稱為混和培養(yǎng)物(Mixed culture)。如果在一個(gè)菌落中所

12、有細(xì)胞均來(lái)自于一個(gè)親代細(xì)胞，那么這個(gè)菌落稱為純培養(yǎng)(Pure culture)。在進(jìn)行菌種鑒定時(shí)，所用的微生物一般均要求為純的培養(yǎng)物。得到純培養(yǎng)的過(guò)程稱為分離純化，方法有許多種。1、傾注平板法( Pour plate ) 2、涂布平板法(Spread plate)3、平板劃線法(Streak plate)常見(jiàn)的比較容易出現(xiàn)單個(gè)菌落的劃線方法有斜線法、曲線法、方格法、放射法、四格法等。4、富集培養(yǎng)法富集培養(yǎng)法的方法和原理非常簡(jiǎn)單。我們可以創(chuàng)造一些條件只讓所需的微生物生長(zhǎng)，在這些條件下，所需要的微生物能有效地與其他微生物進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)，在生長(zhǎng)能力方面遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其它微生物。如果要分離一些專性寄生菌，就必須把

13、樣品接種到相應(yīng)敏感宿主細(xì)胞群體中，使其大量生長(zhǎng)。通過(guò)多次重復(fù)移種便可以得到純的寄生菌。5、厭氧法在實(shí)驗(yàn)室中，為了分離某些厭氧菌，可以利用裝有原培養(yǎng)基的試管作為培養(yǎng)容器，把它放在沸水浴中加熱數(shù)分鐘，以便逐出溶解氧。然后快速冷卻，并進(jìn)行接種。接種后，加入無(wú)菌石蠟于培養(yǎng)基表面，使與空氣隔絕。另一種方法是，在接種后，利用N2或CO2取代培養(yǎng)基中的氣體，然后在火焰上把試管口密封。有時(shí)為了更有效地分離某些厭氧菌，可以把所分離樣品接種于培養(yǎng)基上，然后再把培養(yǎng)皿放在完全密封的厭氧培養(yǎng)裝置中。三、培養(yǎng)1、根據(jù)培養(yǎng)時(shí)是否需要氧氣，可分為好氧培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)。好氧培養(yǎng)(Aerobic Incubation) ：也稱“

14、好氣培養(yǎng)”。 厭氧培養(yǎng)(Anaerobic Incubation)：也稱“厭氣培養(yǎng)”。2、根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)，可分為固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)兩大類：固體培養(yǎng)：solid incubation 液體培養(yǎng)：liquid incubation第二節(jié) 微生物常規(guī)鑒定技術(shù)一、形態(tài)結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)特性觀察1、微生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察微生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察主要是通過(guò)染色，在顯微鏡下對(duì)其形狀、大小、排列方式、細(xì)胞結(jié)構(gòu)(包括細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞核、鞭毛、芽孢等)及染色特性進(jìn)行觀察，直觀地了解細(xì)菌在形態(tài)結(jié)構(gòu)上特性，根據(jù)不同微生物在形態(tài)結(jié)構(gòu)上的不同達(dá)到區(qū)別、鑒定微生物的目的。2、微生物培養(yǎng)特性觀察革蘭染色法，丹麥病理學(xué)家C.Gra

15、m 1884年創(chuàng)立(1)涂片 (2)晾干 (3)固定 (4)結(jié)晶紫色染色：1min。水洗 (5)媒染：滴加盧哥氏碘液，媒染1min。水洗(6) 脫色：將玻片傾斜，連續(xù)滴加95%乙醇脫色2025s至流出液無(wú)色，立即水洗。(7) 復(fù)染：滴加蕃紅復(fù)染5min。水洗(8) 晾干：晾干或者用吸水紙吸干。(9) 鏡檢：先用低倍，再用高倍，最后用油鏡。(10)實(shí)驗(yàn)完畢后的處理：浸過(guò)油的鏡頭：a.先用擦鏡紙將油鏡頭上的油擦去。b.用擦鏡紙沾少許二甲苯將鏡頭擦23次。c.再用干凈的擦鏡紙將鏡頭擦23次。注意擦鏡頭時(shí)向一個(gè)方向擦拭。細(xì)菌染色玻片用廢擦鏡紙將香柏油擦干。微生物培養(yǎng)特性的觀察是微生物檢驗(yàn)鑒別中的一項(xiàng)重

16、要內(nèi)容。1)細(xì)菌的培養(yǎng)特征 包括以下內(nèi)容：在固體培養(yǎng)基上，觀察菌落大小、形態(tài)、顏色(色素是水溶性還是脂溶性)、光澤度、透明度、質(zhì)地、隆起形狀、邊緣特征及遷移性等。在液體培養(yǎng)中的表面生長(zhǎng)情況(菌膜、環(huán))混濁度及沉淀等。半固體培養(yǎng)基穿刺接種觀察運(yùn)動(dòng)、擴(kuò)散情況。2)霉菌酵母菌的培養(yǎng)特征：大多數(shù)酵母菌沒(méi)有絲狀體，在固體培養(yǎng)基上形成的菌落和細(xì)菌的很相似，只是比細(xì)菌菌落大且厚。液體培養(yǎng)也和細(xì)菌相似，有均勻生長(zhǎng)、沉淀或在液面形成菌膜。霉菌有分支的絲狀體，菌絲粗長(zhǎng)，在條件適宜的培養(yǎng)基里，菌絲無(wú)限伸長(zhǎng)沿培養(yǎng)基表面蔓延。霉菌的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲和孢子絲都常帶有不同顏色，因而菌落邊緣和中心，正面和背面顏色常常不同，

17、如青霉菌：孢子青綠色，氣生菌絲無(wú)色，基內(nèi)菌絲褐色。霉菌在固體培養(yǎng)表面形成絮狀、絨毛狀和蜘蛛網(wǎng)狀菌落。二、生理生化試驗(yàn)微生物生化反應(yīng)：指用化學(xué)反應(yīng)來(lái)測(cè)定微生物的代謝產(chǎn)物，生化反應(yīng)常用來(lái)鑒別一些在形態(tài)和其它方面不易區(qū)別的微生物。因此微生物生化反應(yīng)是微生物分類鑒定中的重要依據(jù)之一。微生物檢驗(yàn)中常用的生化反應(yīng)有：糖或醇類發(fā)酵試驗(yàn) 淀粉水解試驗(yàn) V-P試驗(yàn) 甲基紅(MR)試驗(yàn) 靛基質(zhì)(Indole)試驗(yàn) 過(guò)氧化氫酶試驗(yàn) 硝酸鹽還原試驗(yàn) 明膠液化試驗(yàn) 尿素酶(Urease)試驗(yàn) 氧化酶試驗(yàn) 硫化氫(H2S)試驗(yàn) 三糖鐵(TSI)瓊脂試驗(yàn) 氨基酸脫羧酶的測(cè)定 耐鹽性試驗(yàn) 卵磷脂酶的測(cè)定石蕊牛奶反應(yīng) 酪蛋白水

18、解 苯丙氨酸脫氨試驗(yàn) 氰化鉀試驗(yàn) 對(duì)疊氮化鈉的抗性硫化氫-靛基質(zhì)-動(dòng)力(SIM)瓊脂試驗(yàn) 含碳化合物的利用(檸檬酸鹽或丙酸鹽利用)三、血清學(xué)試驗(yàn)血清學(xué)反應(yīng)是指：相應(yīng)的抗原與抗體在體外一定條件下作用，可出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的沉淀、凝集現(xiàn)象。在食品微生物檢驗(yàn)中，常用血清學(xué)反應(yīng)來(lái)鑒定分離到的細(xì)菌，以最終確認(rèn)檢測(cè)結(jié)果。在細(xì)菌的檢測(cè)中，應(yīng)用最多的是凝集試驗(yàn)、沉淀反應(yīng)和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)。血清學(xué)試驗(yàn)的一般特點(diǎn)：1)抗原體的結(jié)合具有特異性，當(dāng)有共同抗原體存在時(shí)，會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng)。2)抗原體的結(jié)合是分子表面的結(jié)合，這種結(jié)合雖相當(dāng)穩(wěn)定，但是可逆的。3)抗原體的結(jié)合是按一定比例進(jìn)行的，只有比例適當(dāng)時(shí)，才能出現(xiàn)可見(jiàn)反應(yīng)。4)血清學(xué)

19、反應(yīng)大體分為兩個(gè)階段進(jìn)行，但其間無(wú)嚴(yán)格界限。第一階段為抗原體特異性結(jié)合階段，反應(yīng)速度很快，只需幾秒至幾分鐘反應(yīng)即可完畢，但不出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)現(xiàn)象。第二階段為抗原體反應(yīng)的可見(jiàn)階段，表現(xiàn)為凝集、沉淀、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)等。反應(yīng)速度慢，需幾分、幾十分以至更長(zhǎng)時(shí)間。而且，在第二階段反應(yīng)中，電解質(zhì)、PH、溫度等環(huán)境因素的變化，都直接影響血清學(xué)反應(yīng)的結(jié)果。1、凝集反應(yīng)(Agglutination reaction)顆粒性抗原(細(xì)菌、紅細(xì)胞等)與相應(yīng)抗體結(jié)合，在電解質(zhì)參與下所形成的肉眼可見(jiàn)的凝集現(xiàn)象，稱為凝集反應(yīng)。其中的抗原稱為凝集原，抗體稱為凝集素。在該反應(yīng)中，因?yàn)閱挝惑w積抗體量大，做定量實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)稀釋抗體。1)直

20、接凝集反應(yīng)：a. 玻片凝集法； b. 試管凝集法 2)間接凝集反應(yīng)2、沉淀反應(yīng)(Precipitation test)可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合，在有適量電解質(zhì)存在下，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間，形成肉眼可見(jiàn)的沉淀物，稱為沉淀反應(yīng)。反應(yīng)中的抗原稱為沉淀原，抗體為沉淀素。由于在單位體積內(nèi)抗原量大，為了不使抗原過(guò)剩，故應(yīng)稀釋抗原，并以抗原的稀釋度作為沉淀反應(yīng)的效價(jià)。1)環(huán)狀沉淀反應(yīng) 2)絮狀沉淀反應(yīng)3)瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)3、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)(Complement fixation reaction)補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)是在補(bǔ)體參與下，以綿羊紅細(xì)胞和溶血素作為指示系統(tǒng)的抗原抗體反應(yīng)。補(bǔ)體無(wú)特異性，能與任何一組抗原抗體復(fù)合物結(jié)合而引起

21、反應(yīng)。如果補(bǔ)體與綿羊紅細(xì)胞、溶血素的復(fù)合物結(jié)合，就會(huì)出現(xiàn)溶血現(xiàn)象; 如果與細(xì)菌及相應(yīng)抗體復(fù)合物結(jié)合，就會(huì)出現(xiàn)溶菌現(xiàn)象。因此，如果出現(xiàn)溶菌，說(shuō)明抗原抗體是相對(duì)應(yīng)的(試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性)；如果出現(xiàn)溶血，說(shuō)明抗原抗體不相對(duì)應(yīng)(陰性)。此反應(yīng)操作復(fù)雜，敏感性高，特異性強(qiáng)，能測(cè)出少量抗原和抗體，所以應(yīng)用范圍較廣。其它方法：熒光抗體技術(shù), ELISA, 免疫組化第二章 食品微生物檢驗(yàn)的一般程序第一節(jié) 食品檢驗(yàn)樣品的采集采樣(Sampling)從產(chǎn)品中抽取少量的、有一定代表性的樣品，供檢驗(yàn)分析用，這一過(guò)程稱為采樣 。一、食品檢驗(yàn)樣品采集的原則1. 采樣前的一些準(zhǔn)備工作 干冰：制冷劑。也可以用濕冰。 盒子或制冷皿：

22、貯藏、運(yùn)輸樣品。 滅菌容器：從塑料袋到滅菌的加侖漆桶等。 取樣工具：茶匙、角匙、尖嘴鉗、鑷子、 量筒和燒杯等。 滅菌手套： 無(wú)菌棉拭子：一般用于拭取儀器設(shè)施和工廠環(huán)境區(qū)域。 滅菌全包裝袋：裝樣品用。 當(dāng)樣品收集時(shí)，樣品采集時(shí)的條件例如產(chǎn)品的溫度、地點(diǎn)等，連同扦樣樣品號(hào)嘜頭，一并記錄入檢驗(yàn)員的注釋說(shuō)明中。 當(dāng)采集無(wú)菌樣品時(shí)，一條最重要的規(guī)則是：千萬(wàn)別污染樣品。這需要樣品采集人非常小心地采集所有附加樣品，確保不違反這條規(guī)則。2. 食品檢樣采集的原則1)所采樣品應(yīng)具有代表性。2)采樣必須符合無(wú)菌操作的要求，防止一切外來(lái)污染 一件用具只能用于一個(gè)樣品，防止交叉污染。3)在保存和運(yùn)送過(guò)程中應(yīng)保證樣品中微

23、生物的狀態(tài)不發(fā)生變化 采集的非冷凍食品一般在05冷藏，不能冷藏的食品立即檢驗(yàn)。一般在36h內(nèi)進(jìn)行檢驗(yàn)。4)采樣標(biāo)簽應(yīng)完整、清楚 每件樣品的標(biāo)簽須標(biāo)記清楚，盡可能提供詳盡的資料。二、食品檢驗(yàn)樣品的采集方法一)取樣方案一般說(shuō)來(lái)，進(jìn)出口貿(mào)易合同對(duì)食品抽樣量有明確規(guī)定的，按合同規(guī)定抽樣；無(wú)具體抽樣規(guī)定的，可根據(jù)檢驗(yàn)?zāi)康?、產(chǎn)品及被抽樣品的性質(zhì)和分析方法確定抽樣方案。目前最為流行的抽樣方案為(國(guó)際食品微生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì))ICMSF推薦的抽樣方案和隨機(jī)抽樣方案。無(wú)論采取何種方法抽樣，每批貨物的抽樣數(shù)量不得少于5件。對(duì)于需要檢驗(yàn)沙門(mén)氏菌的食品，抽樣數(shù)量應(yīng)適當(dāng)增加，最低不少于8件。二)樣本選擇三)抽樣(采樣)方

24、法國(guó)際食品微生物標(biāo)準(zhǔn)委員International Commission on Microbiological Specifications for Foods， ICMSFICMSF方法是從統(tǒng)計(jì)學(xué)角度來(lái)考慮，對(duì)一批產(chǎn)品檢查多少個(gè)檢樣才能夠有代表性，才能客觀地反映該批產(chǎn)品質(zhì)量的設(shè)想采樣的ICMSF提出的采樣基本原則，是根據(jù)以下考慮來(lái)規(guī)定不同的采樣數(shù):(1) 各種微生物本身對(duì)人的危害程度各有不同；(2) 食品經(jīng)不同條件處理后，其危害程度可分為3種情況：危害度降低；危害度未變；危害度增加。ICMSF是將微生物的危害度、食品的特性及處理?xiàng)l件三者綜合在一起進(jìn)行食品中微生物危害度分類的 。這個(gè)設(shè)想是很科

25、學(xué)的，符合實(shí)際情況的，對(duì)生產(chǎn)廠及消費(fèi)者來(lái)說(shuō)都是比較合理的。ICMSF的采樣方案:ICMSF方法中包括二級(jí)法及三級(jí)法2種。二級(jí)法只設(shè)有n、c及m值，三級(jí)法則有n、c、m及M值。 n：系指一批產(chǎn)品的采樣個(gè)數(shù)。 c：系指該批產(chǎn)品中檢樣菌數(shù)超過(guò)限量的檢樣數(shù)。 m：系指合格菌數(shù)限量。 M：系指附加條件后判定為合格的菌數(shù)限量 。在中等或嚴(yán)重危害的情況下使用二級(jí)抽樣方案，對(duì)健康危害低的則建議使用三級(jí)抽樣方案。1)二級(jí)法：只設(shè)定合格判定標(biāo)準(zhǔn)m值，超過(guò)m值的，則為不合格品。通過(guò)檢查在檢樣中是否有超過(guò)m值的，來(lái)判定該批是否合格。如生食魚(yú)片中細(xì)菌總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)為n=5，c=0，m=100cfu / g。其中m=100cf

26、u / g即為限量標(biāo)準(zhǔn)，n=5即取樣5個(gè)，c=0即表示在該批5個(gè)檢樣中，若未見(jiàn)有超過(guò)m值為100cfu / g的檢樣，則該批產(chǎn)品為合格品。cfu：colony forming unit, 菌落形成單位2)三級(jí)法：設(shè)有微生物標(biāo)準(zhǔn)值m及M值，如同二級(jí)法，超過(guò)m值的檢樣為該檢樣不合格。所有檢樣均小于m值，該批產(chǎn)品為合格；在m值到M值范圍內(nèi)的檢樣數(shù)在c值范圍內(nèi)，即為附加條件合格，否則為不合格；凡有檢樣超過(guò)M值者，則該批產(chǎn)品為不合格。如澳大利亞冷凍糖制食品的大腸菌群標(biāo)準(zhǔn)為n=5，c=2，m=100，M=1000，其含義是從一批產(chǎn)品中，取5個(gè)檢樣，若所有檢樣大腸菌群結(jié)果均小于m=100，則判定為該批產(chǎn)品合

27、格；若2個(gè)檢樣的結(jié)果位于m與M值之間(即1001000之間)，則判定為附加條件合格；若有3個(gè)及以上檢樣的結(jié)果位于m與M值之間，判定為該批產(chǎn)品不合格；若有任一檢樣大腸菌群數(shù)超過(guò)M值(即1000)者，則判定該批產(chǎn)品不合格。表3-1 ICMSF按微生物的危害度及食品處理進(jìn)行情況分類二)樣本選擇樣本選擇可以分為有針對(duì)性選擇和隨機(jī)選擇兩種。1、在現(xiàn)場(chǎng)抽樣時(shí)，可利用隨機(jī)抽樣表進(jìn)行隨機(jī)抽樣。2、有針對(duì)性選擇是根據(jù)已掌握的情況，如懷疑某種食物可能是食物中毒的原因食品，或者感觀上已初步判定出該食品存在衛(wèi)生質(zhì)量問(wèn)題，而有針對(duì)性地選擇采集樣本。三)抽樣(采樣)方法隨機(jī)采樣，即用一種能使總體的每一部分有同等機(jī)會(huì)出現(xiàn)在

28、樣品中的方法，從大批樣品中抽出若干部分。代表性采樣(針對(duì)性采樣)，即使用系統(tǒng)抽樣法采樣，以使所取的每一部分代表食品的相應(yīng)部分。隨機(jī)抽樣表系用計(jì)算機(jī)隨機(jī)編制而成，包括1千、1萬(wàn)或10萬(wàn)個(gè)數(shù)字。其使用方法如下：a.先將一批產(chǎn)品的各單位產(chǎn)品(如箱、包、盒等)按順序編號(hào)。如將一批600包的產(chǎn)品編為1、2600。b.隨意在表上點(diǎn)出一個(gè)數(shù)。查看該數(shù)字所在的行和列。如點(diǎn)在第18行、第10列的數(shù)字上。c.根據(jù)單位產(chǎn)品編號(hào)的最大位數(shù)(比如，最大為三位數(shù))，查出所在行的連續(xù)列數(shù)字，則編號(hào)與該數(shù)相同的那一份單位產(chǎn)品，即為一件應(yīng)抽取的樣品。d.繼續(xù)查下一行的相同連續(xù)列數(shù)字。該數(shù)字所代表的單位產(chǎn)品為另一件應(yīng)抽取的樣品。

29、e.依次按上述方法查下去。當(dāng)遇到所查數(shù)超過(guò)最大編號(hào)數(shù)量，則舍去此數(shù)，繼續(xù)查下一行相同列數(shù)，直到完成應(yīng)抽樣品件數(shù)為止。三)抽樣(采樣)方法1)、重量法 采取一定重量的食品作為一個(gè)樣品。采取屠宰后兩腿內(nèi)側(cè)肌或背最長(zhǎng)肌100g/只；蛋、蛋制品樣品，每份不少于200g。2)、拭子法 拭子法采樣不損害肉的完整性，操作簡(jiǎn)便。但是檢出的活菌總數(shù)不高。3)、灌洗法 對(duì)于全凈膛光禽最好在洗滌后立即采樣。本法比拭子法檢出率高。抽樣方法對(duì)抽樣方案的有效執(zhí)行和保證樣品的有效性代表性至關(guān)重要。抽樣必須遵循無(wú)菌操作程序，抽樣工具如整套不銹鋼勺子、鑷子、剪刀等應(yīng)當(dāng)高壓滅菌，防止一切可能的外來(lái)污染。容器必需清潔、干燥、防漏、

30、廣口、滅菌，大小適合盛放檢樣。抽樣全過(guò)程中，應(yīng)采取必要的措施防止食品中固有微生物的數(shù)量和生長(zhǎng)能力發(fā)生變化。 應(yīng)注意產(chǎn)品的均質(zhì)性和來(lái)源，確保檢樣的代表性。微生物檢驗(yàn)時(shí)樣品的制備 均勻食品：用四分法縮分；肉類、水產(chǎn)類食品：滅菌剪刀剪碎，四分法縮分。第二節(jié) 食品檢驗(yàn)樣品的運(yùn)送及處理一、樣品的標(biāo)記抽樣過(guò)程中應(yīng)對(duì)所抽樣品進(jìn)行及時(shí)、準(zhǔn)確的標(biāo)記；抽樣結(jié)束后，應(yīng)有抽樣人寫(xiě)出完整的抽樣報(bào)告，使樣品盡可能保持在原有條件下迅速發(fā)送到實(shí)驗(yàn)室。1 所有盛樣容器必須有和樣品一致的標(biāo)記。在標(biāo)記上應(yīng)記明產(chǎn)品標(biāo)志與號(hào)碼和樣品順序號(hào)以及其他需要說(shuō)明的情況。標(biāo)記應(yīng)牢固，具防水性，字跡不會(huì)被擦掉或脫色。2 當(dāng)樣品需要托運(yùn)或由非專職抽

31、樣人員運(yùn)送時(shí)，必須封識(shí)樣品容器。二、樣品的保存和運(yùn)送一)樣品保存的目的:都是必須盡大可能地保持其原有的狀態(tài)和特性，盡量減少其離開(kāi)總體以后的變化 。二)樣品保存的原則:1. 防止污染；2. 防止腐敗變質(zhì)；3. 防止病毒死亡；4. 穩(wěn)定水分；5. 固定待測(cè)成分。三)樣品保存的方法凈：指采集樣品的一切工具、容器必須清潔干凈或無(wú)菌，并特指不含有待測(cè)定目的物質(zhì)；凈也是防止污染和腐敗變質(zhì)的措施。密：指樣品應(yīng)密閉保存，它是穩(wěn)定水分，防止揮發(fā)性成分損失以及避免污染的措施。冷：指樣品應(yīng)冷藏運(yùn)送和保存(如果樣品為測(cè)定病毒用時(shí)，則應(yīng)冷凍或加50%的甘油生理鹽水保存運(yùn)送)，目的是降低樣品內(nèi)部的化學(xué)反應(yīng)速度、抑制酶的活

32、性和細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖，同時(shí)也可減少高溫和氧化損失。快：指快采、快運(yùn)、快藏、盡快分析，盡量縮短樣品在各個(gè)環(huán)節(jié)的停留時(shí)間。三、微生物檢驗(yàn)時(shí)樣品的預(yù)處理微生物檢驗(yàn)主要是檢查細(xì)菌和病毒等在食品中的數(shù)量或它們對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的致毒、致病能力，微生物必須“活著”或者必須有“活力”。樣品預(yù)處理方法以不破壞微生物的活力和毒素，使微生物和毒素從食品中充分溶出為準(zhǔn)則。一） 細(xì)菌檢樣的預(yù)處理 方法：振搖、振蕩、攪拌和均質(zhì)均質(zhì)法的優(yōu)點(diǎn)：1)可以使細(xì)菌從食品顆粒上脫落下來(lái)；2)可以使細(xì)菌在液體中分布均勻；3)使食品中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)更多地釋放到液體中，有利于細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖 。均質(zhì)法：1)破碎式 2)沖擊式 3)蠕動(dòng)式檢樣的稀釋 檢樣

33、可用滅菌生理鹽水、緩沖液或相應(yīng)的培養(yǎng)基來(lái)稀釋。二)病毒檢樣的預(yù)處理 病毒檢樣多采用的是冷凍保存或加50%的甘油生理鹽水保存。 有些檢樣可能受細(xì)菌的污染較重，因此在檢樣接種前，應(yīng)做除菌處理 動(dòng)物性食品檢驗(yàn)的目的就是根據(jù)所的出的檢驗(yàn)結(jié)果對(duì)被檢食品的品質(zhì)和質(zhì)量做出正確的客觀的判斷和評(píng)價(jià)。由于不同的檢驗(yàn)方法存在著靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度和適應(yīng)不同條件的測(cè)定等方面的差異，所以不同的檢驗(yàn)方法和操作過(guò)程就可能得出不同的檢驗(yàn)結(jié)果。因此，必須有一種固定的統(tǒng)一的檢驗(yàn)方法和操作規(guī)程，以便得出較為統(tǒng)一的結(jié)果 。 國(guó)家規(guī)程、進(jìn)出口檢驗(yàn)規(guī)程第四節(jié) 分析數(shù)據(jù)處理 與檢驗(yàn)方法一樣，也是在制訂衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的同時(shí)就規(guī)定的：1、有效數(shù)字

34、2、運(yùn)算規(guī)則3、直線回歸方程的計(jì)算4、精密度和準(zhǔn)確度第五節(jié) 檢驗(yàn)報(bào)告動(dòng)物性食品檢驗(yàn)的最后一項(xiàng)工作是檢驗(yàn)報(bào)告，也是一項(xiàng)重要的工作。它不但關(guān)系到這批食品的命運(yùn)，關(guān)系到人民的健康，同時(shí)也關(guān)系到食品進(jìn)出口的信譽(yù)問(wèn)題。因此，在填寫(xiě)檢驗(yàn)報(bào)告時(shí)，一定要實(shí)事求是真實(shí)無(wú)誤；同時(shí)要熟悉我們國(guó)家和國(guó)際食品衛(wèi)生指標(biāo)，按食品衛(wèi)生指標(biāo)進(jìn)行仲裁。第三章 食品微生物檢驗(yàn)的指標(biāo)重點(diǎn)和難點(diǎn)： 菌落總數(shù) 衛(wèi)生學(xué)意義及常規(guī)檢驗(yàn)方法 大腸菌群MPN 衛(wèi)生學(xué)意義及常規(guī)檢驗(yàn)方法 致病性微生物 衛(wèi)生學(xué)意義及常規(guī)檢驗(yàn)方法制訂食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)目的：促進(jìn)工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、保障人體健康及維護(hù)國(guó)家的尊嚴(yán)和利益。意義 由于食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)具有一定的社會(huì)政治性。食品衛(wèi)

35、生標(biāo)準(zhǔn)往往被用作食品貿(mào)易中類似于關(guān)稅壁壘的控制手段，籍此可以“名正言順”地限制各國(guó)所謂的不合格食品的輸入，或籍此迫使出口國(guó)降價(jià)出售。 技術(shù)貿(mào)易壁壘(TBT)第一節(jié) 菌落總數(shù)一、菌落總數(shù)的概念及衛(wèi)生意義1. 概念 菌落(colony)是指一個(gè)或幾個(gè)相同的細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上增殖而形成的肉眼可見(jiàn)的細(xì)菌集團(tuán)。它是由數(shù)以萬(wàn)計(jì)的相同細(xì)菌聚集而成的，故又有細(xì)菌集落之稱。 菌落總數(shù)(colony count)是指食品檢樣經(jīng)過(guò)處理，在一定的條件下(樣品處理、培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度和時(shí)間、pH、需氧條件)培養(yǎng)后，所得到的每單位食品(1g，1mL，1cm2)中所含細(xì)菌菌落的總數(shù)。由于菌落總數(shù)測(cè)定是在需氧條件下進(jìn)行的，

36、而且不能區(qū)別細(xì)菌種類，因此，菌落總數(shù)又稱為需氧菌數(shù)(aerobic bacterial count)或雜菌數(shù)。辨析：菌落總數(shù)與細(xì)菌總數(shù)細(xì)菌總數(shù)：指一定數(shù)量或面積的食品樣品經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)奶幚砗螅陲@微鏡下對(duì)細(xì)菌進(jìn)行直接計(jì)數(shù)。其中包括各種活菌數(shù)和尚未消失的死菌數(shù)。細(xì)菌總數(shù)也稱細(xì)菌直接顯微鏡數(shù)。通常以1g或1mL或lcm2 樣品中的細(xì)菌總數(shù)來(lái)表示。菌落總數(shù)測(cè)定的是活菌數(shù)，現(xiàn)在通常用 cfu/(g，mL，cm2)表示。菌落總數(shù)更具有食品衛(wèi)生學(xué)意義。Why？2. 測(cè)定意義 菌落總數(shù)主要是作為判定食品被細(xì)菌污染程度的標(biāo)志，也可以應(yīng)用這一方法觀察食品中細(xì)菌的性質(zhì)以及細(xì)菌在食品中的繁殖動(dòng)態(tài)，以便對(duì)被檢樣品進(jìn)行衛(wèi)生

37、學(xué)評(píng)價(jià)時(shí)提供科學(xué)依據(jù)。 另外，測(cè)定食品中的菌落總數(shù)也可對(duì)這種食品的質(zhì)量作出預(yù)測(cè)。如菌數(shù)在105CFU/cm2的牛肉在0時(shí)可保存7d，而菌數(shù)為103 CFU / cm2時(shí)，在上述條件下卻可保存18d；有的食品當(dāng)細(xì)菌數(shù)達(dá)到106107 CFU /g時(shí)，即能從感官上發(fā)現(xiàn)變質(zhì)。有人認(rèn)為，菌數(shù)達(dá)106107 CFU /g的食品即可能引起食物中毒。品種 表 3-1-1 我國(guó)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)(部分) 菌落總數(shù) 大腸菌群MPN 出廠 銷售 出廠 銷售肉灌腸 2×104/g 5×104/g 30/100g 30/100g燒烤肉 5×103/g 5×104/g 40/100g

38、100/100g輻照扒雞 500/g 30/100g熟肉制品 500/g 30/100g肉松 3×104/g 40/100g含乳蛋10%以上 2.5×104/mL 450/100mL的冷凍食品含乳蛋10%以下 104/mL 250/100mL的冷凍食品肉干、肉脯 104/g 30/100g 烤魚(yú)片 3×104/g 30/100g 二、菌落總數(shù)的常規(guī)檢驗(yàn)方法中華人民共和國(guó)標(biāo)準(zhǔn)食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定(GB/T 4789.2-2003)基本操作一般包括：樣品的稀釋傾注平皿培養(yǎng)48(24)h計(jì)數(shù)報(bào)告。1. 檢樣稀釋及培養(yǎng)(1)以無(wú)菌操作，將檢樣 25 g(或

39、25 mL)剪碎放于含有225 mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶?jī)?nèi)(瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠)或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨做成1:10的均勻稀釋液。固體樣品在加入稀釋液后，最好置均質(zhì)器中以8 000 r/min10 000 r/min的速度處理1min，做成1:10的均勻稀釋液。(2)用1 mL滅菌吸管，吸取1:10稀釋液1mL，沿管壁徐徐注入含有9 mL滅菌生理鹽水或其它稀釋液的試管內(nèi)(注意吸管尖端不要觸及管內(nèi)稀釋液)，振搖試管，混合均勻，做成1:100倍的稀釋液。(3)另取l mL滅菌吸管，按上條操作方法，做10倍遞增稀釋，如此每遞增稀釋一次，即換用1支1 mL滅菌吸管。(4)根

40、據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)悠肺廴厩闆r的估計(jì)，選擇2個(gè)3個(gè)適宜稀釋度，分別在作10倍遞增稀釋的同時(shí)，即以吸取該稀釋度的吸管移1mL稀釋液于滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度作2個(gè)培養(yǎng)皿。(5)稀釋液移入培養(yǎng)皿后，應(yīng)立即將冷至46 左右營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(可放置于46±1水浴中保溫)注入培養(yǎng)皿約15 mL，并轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿使混合均勻。同時(shí)將營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入加有l(wèi) mL滅菌稀釋液的滅菌平皿內(nèi)作空白對(duì)照。(6)待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置36±1溫箱內(nèi)培養(yǎng)48h±2h。2. 菌落計(jì)數(shù)方法作平板菌落計(jì)數(shù)時(shí)，可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡觀察，以防遺漏。在記下各平板的菌落數(shù)后，求出同稀釋度的各平板

41、平均菌落總數(shù)。3. 菌落計(jì)數(shù)的報(bào)告(1)平板菌落數(shù)的選擇：選取菌落數(shù)在30300之間的平板作為菌落總數(shù)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。一個(gè)稀釋度使用兩個(gè)平板，應(yīng)采用兩個(gè)平板平均數(shù)，其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無(wú)片狀菌落生長(zhǎng)的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)，若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘以2以代表全皿菌落數(shù)。平板內(nèi)如有鏈狀菌落生長(zhǎng)時(shí)(菌落之間無(wú)明顯界線)，若僅有一條鏈，可視為一個(gè)菌落；如果有不同來(lái)源的幾條鏈，則應(yīng)將每條鏈作為一個(gè)菌落計(jì)。(2)稀釋度選擇選擇平均菌落數(shù)在30300之間的稀釋度，乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之(見(jiàn)表3-1-2例1)。若有兩個(gè)稀釋度，其生長(zhǎng)

42、的菌落數(shù)均在30300之間，則視二者之比如何來(lái)決定。若其比值小于或等于2，應(yīng)報(bào)告其平均數(shù)；若大于2則報(bào)告其較小的數(shù)字(見(jiàn)例2及例3)。若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均較大于300，則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之(見(jiàn)例4)。若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之(見(jiàn)例5)。若所有稀釋度均無(wú)菌落的生長(zhǎng)，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告之(見(jiàn)例6)。若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30300之間，其中一部分大于300或小于30時(shí)，則以最接近30或300的平均菌落數(shù)乘以其稀釋倍數(shù)報(bào)告之(見(jiàn)例7)。(3)菌落數(shù)的報(bào)告：菌落數(shù)在100以內(nèi)時(shí)，按其實(shí)有數(shù)報(bào)告

43、，大于100時(shí)，采用兩位有效數(shù)字，在兩位有效數(shù)字后面的數(shù)值，以四舍五入方法計(jì)算。為了縮短數(shù)字后面的零數(shù)也可用10的指數(shù)來(lái)表示，詳見(jiàn)表3-1-2。表3-1-2 稀釋度選擇及菌落總數(shù)報(bào)告方式三、菌落總數(shù)的其它檢驗(yàn)方法1. 平板表面涂布法將營(yíng)養(yǎng)瓊脂制成平板，經(jīng)50 1h2h或35 18h20h干燥后，于其上滴加檢樣稀釋液0.2mL，用“L”棒涂布于整個(gè)平板的表面，放置片刻(約10min)，將平板翻轉(zhuǎn)，移至36±1溫箱內(nèi)培養(yǎng)24±2h(水產(chǎn)品用30培養(yǎng)48±2h)取出，按常規(guī)法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，然后乘以5(由0.2mL換算為1mL)，再乘以樣品稀釋液的倍數(shù)，即得1g或1mL

44、檢樣所含菌落數(shù)。此法較常規(guī)法為優(yōu)，因菌落生長(zhǎng)在表面，便于識(shí)別和檢查其形態(tài)，雖檢樣中含有食品顆粒，也不會(huì)發(fā)生混淆，同時(shí)還可以使細(xì)菌免遭融化瓊脂的熱力傷害，不致因此而使細(xì)菌細(xì)胞受損而不生長(zhǎng)，避免了由于操作過(guò)程中的不良因素使檢驗(yàn)中的細(xì)菌菌落數(shù)降低。但本法取樣量較常規(guī)法少，其代表性將受到一定的影響。2. 平板表面點(diǎn)滴法與涂布法相似，不同的只是用標(biāo)定好的微量吸管或注射器針頭按滴(每滴相當(dāng)于0.025mL)將檢樣稀釋液滴加到瓊脂平板上固定的區(qū)域(預(yù)先在平板背面用記號(hào)筆劃成四個(gè)區(qū)域)，每個(gè)區(qū)域滴1滴，每個(gè)稀釋度滴兩個(gè)區(qū)域，作為平行實(shí)驗(yàn)。滴加后，將平板放置片刻(約5min10min)，然后翻轉(zhuǎn)平板，如前移入溫

45、箱中培養(yǎng)6h8h后進(jìn)行計(jì)數(shù)，將所得菌落數(shù)乘以40(由0.025mL換算為1mL)，再乘以樣品的稀釋倍數(shù)，即得1g或1mL檢樣所含的菌落數(shù)。第二節(jié) 大腸菌群MPN一、大腸菌群MPN的概念及意義1.概念 大腸菌群(coliform group)是指一大群需氧或兼性厭氧、在37培養(yǎng)24h能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌。 大腸菌群并不是細(xì)菌學(xué)上的分類命名，而是根據(jù)衛(wèi)生學(xué)方面的要求，提出來(lái)的一組與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌，這些細(xì)菌在生化及血清學(xué)方面并非完全一致。 大腸菌群主要包括腸桿菌科的大腸埃希氏菌屬、枸櫞酸菌屬、腸桿菌屬(產(chǎn)氣桿菌屬)克雷伯氏菌屬的一部分細(xì)菌以及沙門(mén)氏菌屬第亞屬(能發(fā)酵乳糖)的細(xì)

46、菌，此外還有來(lái)自土壤和植物的個(gè)別細(xì)菌(如歐文氏菌屬)。 大腸菌群MPN(Most Probable Number)為最可能數(shù)，是應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)原理和方法，根據(jù)試驗(yàn)的陽(yáng)性管數(shù)計(jì)算出樣品中大腸菌群的含量，報(bào)告出每100mL(g)大腸菌群的最可能數(shù)。 糞大腸菌群，fecal coliform group 糞便來(lái)源的大腸菌群 (03新國(guó)標(biāo)中有檢驗(yàn)方法)2.意義：大腸菌群是作為糞便污染指示菌而提出來(lái)的，主要是以該菌群的檢出情況來(lái)表示食品是否受到了人或溫血?jiǎng)游锛S便的污染。大腸菌群數(shù)的高低，表明了糞便污染的程度，以及腸道致病菌對(duì)人體健康危害性的大小。作為糞便污染指示菌的條件：和腸道致病菌的來(lái)源相同，并且在相同的

47、來(lái)源中普遍存在和數(shù)量甚多，以易于檢出。在外界環(huán)境中的生存時(shí)間與腸道致病菌相當(dāng)或稍長(zhǎng)。檢驗(yàn)方法比較簡(jiǎn)便。 最好的糞便污染指示菌是大腸桿菌。 各國(guó)根據(jù)自己的情況，有的用大腸菌群作食品受糞便污染的指標(biāo)，有的使用糞大腸菌或大腸桿菌。二、大腸菌群MPN的常規(guī)檢驗(yàn)方法1、檢樣稀釋：以無(wú)菌操作，將檢樣 25 g(或 25 mL)剪碎放于含有225 mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶?jī)?nèi)(內(nèi)置適量玻璃珠)或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨做成1:10的均勻稀釋液。固體樣品在加入稀釋液后，最好置均質(zhì)器中以8 000 r/min10 000 r/min的速度處理1min，做成1:10的均勻稀釋液。根據(jù)國(guó)家或當(dāng)?shù)匦l(wèi)

48、生標(biāo)準(zhǔn)要求及對(duì)樣品污染程度的估計(jì)，連續(xù)做幾個(gè)10倍遞增稀釋，并選擇3個(gè)連續(xù)的稀釋度，用于接種乳糖膽鹽發(fā)酵管。2、乳糖發(fā)酵試驗(yàn)：接種量在1mL以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管；1mL及1mL以下者，用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管。選擇3個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種3管乳糖膽鹽發(fā)酵管，置于36±1 培養(yǎng)48±2h，觀察是否產(chǎn)氣。不產(chǎn)氣的管報(bào)告為大腸菌群陰性。3、分離培養(yǎng)：將產(chǎn)氣發(fā)酵管培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，36±1培養(yǎng)1824h，觀察菌落形態(tài)。典型的大腸菌群菌落呈紫黑色并帶有金屬光澤或無(wú)光澤，而紅色、粉紅色菌落檢出率較低。4、證實(shí)試驗(yàn)：挑取平板上的可疑菌落，進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。

49、同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管36±1培養(yǎng)24±2h，觀察產(chǎn)氣情況。凡乳糖發(fā)酵管產(chǎn)氣、鏡檢為革蘭氏染色陰性的無(wú)芽孢桿菌者，即可報(bào)告為大腸菌群陽(yáng)性。5、報(bào)告：根據(jù)證實(shí)為大腸菌群陽(yáng)性的管數(shù)，查MPN表(見(jiàn)表3-2-1)，報(bào)告每100ml(g)大腸菌群的MPN值。根據(jù)試驗(yàn)的陽(yáng)性管數(shù)計(jì)算出樣品中大腸菌群的含量，報(bào)告出每100mL(g)大腸菌群的最可能數(shù)。具體操作參見(jiàn)GB4789.3-2003中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群測(cè)定。大腸菌群檢驗(yàn)程序三、大腸菌群MPN的其它檢驗(yàn)方法1. 疏水網(wǎng)膜法(hydrophobic grid-membrane filter, HGMF)

50、加拿大的Sharp AN博士等(1974)首次報(bào)道。其基本原理是：以疏水物質(zhì)在5cm2、孔徑為0.45µm的濾膜上，橫豎各刻印40條線，將濾膜分為1600個(gè)小格，以疏水線作為柵欄，防止菌落擴(kuò)散。樣品稀釋液首先通過(guò)5µm的前濾器過(guò)濾，再通過(guò)0.45µm的HGMF濾膜過(guò)濾，然后根據(jù)所需檢驗(yàn)菌的特性，將濾膜置于不同的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h48h，陽(yáng)性菌落即可通過(guò)顯色而進(jìn)行鑒定，如果是大腸菌群則呈藍(lán)色。根據(jù)陽(yáng)性菌落數(shù)查“陽(yáng)性菌落數(shù)與單位生長(zhǎng)最近似值換算表”即可得出單位樣品中大腸菌群的MPN。本法可在24h30h得出結(jié)果，大腸菌群準(zhǔn)確率為100%，無(wú)假陽(yáng)性。該法的優(yōu)點(diǎn)在于：

51、只使用單一的稀釋度，大大減少了檢驗(yàn)過(guò)程中的隨機(jī)誤差和系統(tǒng)誤差；在過(guò)濾時(shí)除掉了所含的一些固體物質(zhì)， 及一些不利于細(xì)菌生長(zhǎng)的可溶性物質(zhì)，便于細(xì)菌的生長(zhǎng)；因?yàn)闉V膜先在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上培養(yǎng)4h5h，再轉(zhuǎn)移到選擇性培養(yǎng)基，使受傷細(xì)菌得以恢復(fù)，因此縮短了檢出時(shí)間，提高了靈敏度。2. TTC顯色法 該法使用的是含有TTC(氯化三苯四氮唑)的乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基，接種方法與常規(guī)法相同。接種后于3537培養(yǎng)18h24h，觀察TTC乳糖培養(yǎng)基的顯色和產(chǎn)氣現(xiàn)象來(lái)判斷大腸菌群，然后根據(jù)陽(yáng)性管數(shù)，查大腸菌群MPN檢索表，報(bào)告大腸菌群數(shù)。3. DC半固體試管法 該法是將檢樣稀釋成3個(gè)稀釋度，分別接種于含有DC(去氧膽酸鈉)的半固體培

52、養(yǎng)基中，充分混合，待凝固后，放入37溫箱內(nèi)培養(yǎng)1824h，根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和有無(wú)氣泡的產(chǎn)生或瓊脂崩裂現(xiàn)象來(lái)判斷大腸菌群，并根據(jù)陽(yáng)性管數(shù)查MPN檢索表報(bào)告大腸菌群數(shù)。4. 紙片法 該法是將含有溴甲酚紫和TTC成分的培養(yǎng)基浸漬紙片，然后將稀釋成三個(gè)不同稀釋度檢樣分別涂布在三張紙片上，置36±1溫箱中培養(yǎng)15h，根據(jù)紙片上菌落顏色和菌落周圍紙片顏色來(lái)判斷大腸菌群，并根據(jù)紙片的陽(yáng)性片數(shù)，查大腸菌群MPN檢索表進(jìn)行報(bào)告。第三節(jié) 致病性微生物食品首先要求的是安全性，其次才是可食用性及其它。因此，食品中一旦有致病菌污染，其安全性就喪失了，食用性也就不復(fù)存在。致病菌與食品中毒和疾病發(fā)生是肯定和直接的

53、。致病菌污染的食品不但對(duì)個(gè)人健康造成危害，對(duì)家庭和社會(huì)也會(huì)造成一定的危害。 各國(guó)衛(wèi)生部門(mén)都對(duì)致病菌作了嚴(yán)格規(guī)定，把致病菌作為食品衛(wèi)生質(zhì)量的最重要的指標(biāo)。 根據(jù)我國(guó)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，在所有食品中各相關(guān)致病菌不得檢出。一、食品中存在的常見(jiàn)致病菌食品生產(chǎn)是一個(gè)時(shí)間長(zhǎng)、環(huán)節(jié)多的復(fù)雜過(guò)程?？傊c食品有直接和間接關(guān)系的致病性微生物都可能污染食品。有時(shí)引起人類食物中毒的并不是致病菌本身，而是由它們所產(chǎn)生的外毒素或內(nèi)毒素，也包括一些真菌等。1、能引起人類疾病和食物中毒的致病性微生物：沙門(mén)氏菌、葡萄球菌、鏈球菌、副溶血性弧菌，口蹄疫病毒等。2、能產(chǎn)生毒素并引起食物中毒的微生物：肉毒梭菌、葡萄球菌和產(chǎn)氣莢膜桿菌

54、，也包括一些真菌，都會(huì)產(chǎn)生毒素。二、食品中致病性微生物的檢驗(yàn)根據(jù)每種食品最可能污染的致病菌種類進(jìn)行檢驗(yàn)，如肉、蛋類食品以沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)為主，罐頭制品以肉毒梭菌及其毒素檢驗(yàn)為主，牛乳以結(jié)核桿菌和布氏桿菌為主，而水產(chǎn)品必須檢驗(yàn)副溶血弧菌等。目前列入食品衛(wèi)生國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的致病菌有13種，每種都有完整、詳細(xì)的檢驗(yàn)方法(03年新國(guó)標(biāo))。這些檢驗(yàn)方法符合我國(guó)國(guó)情，同時(shí)與一些發(fā)達(dá)國(guó)家的檢驗(yàn)方法基本上一致。第四節(jié) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)一、霉菌和酵母的食品衛(wèi)生學(xué)意義霉菌和酵母廣泛分布于自然界并可作為食品正常菌相的一部分。某些霉菌和酵母的利用。在某些情況下，霉菌和酵母在食品中生長(zhǎng)也可使食品腐敗變質(zhì)。還可破壞食品的色、香、味，

55、使食品產(chǎn)生不良?xì)馕丁㈩伾淖兊取H低、濕度低、含鹽和含糖高的食品中；低溫貯藏食品；含有抗菌素而不適于細(xì)菌生長(zhǎng)的食品。 霉菌和酵母能合成有毒的代謝產(chǎn)物(霉菌毒素)，可引起急性或慢性食源性疾?。稽S曲霉毒素等霉菌毒素具有強(qiáng)烈的致癌性；或能促進(jìn)病原菌生長(zhǎng)。因此，霉菌和酵母也可作為評(píng)價(jià)食品衛(wèi)生質(zhì)量的指標(biāo)之一，以霉菌和酵母菌數(shù)判斷食品的污染程度。目前已有一些國(guó)家對(duì)某些食品制定了霉菌和酵母數(shù)的限量標(biāo)準(zhǔn)。二、檢驗(yàn) 見(jiàn)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) GB/T 4789.152003)1. 平板計(jì)數(shù)法 主要采用傾注培養(yǎng)菌落計(jì)數(shù)，方法和要求與細(xì)菌菌落總數(shù)測(cè)定相同，區(qū)別之處主要如下。(1)傾注培養(yǎng)用的培養(yǎng)基必須適合霉菌生長(zhǎng)，而對(duì)細(xì)菌具有抑制作用。常用的選擇培養(yǎng)基為孟加拉紅(虎紅)培養(yǎng)基、高鹽察氏培養(yǎng)基或馬鈴薯-葡萄糖瓊脂。(2)培養(yǎng)溫度為2528，3d后開(kāi)始觀察，共培養(yǎng)觀察7d。(