十炭疽防治技術(shù)規(guī)范

1、十三、炭疽防治技術(shù)規(guī)范炭疽 ( Anthrax ) 是由炭疽芽胞桿菌引起的一種人畜共患傳染病。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為必須報告的動物疫病，我國將其列為二類動物疫病。為預防和控制炭疽，依據(jù)中華人民共和國動物防疫法和其它相關(guān)法律法規(guī)，制定本規(guī)范。1 適用范圍本規(guī)范規(guī)定了炭疽的診斷、疫情報告、疫情處理、防治措施和控制標準。本規(guī)范適用于中華人民共和國境內(nèi)一切從事動物飼養(yǎng)、 經(jīng)營及其產(chǎn)品的生產(chǎn)、 經(jīng)營的單位和個人， 以及從事動物防疫活動的單位和個人。2 診斷依據(jù)本病流行病學調(diào)查、 臨床癥狀， 結(jié)合實驗室診斷結(jié)果做出綜合判定。2.1 流行特點本病為人畜共患傳染病， 各種家畜、 野生動物及人對本病

2、都有不同程度的易感性。草食動物最易感，其次是雜食動物，再次是肉食動物，家禽一般不感染。人也易感?；疾游锖鸵蛱烤叶劳龅膭游锸w以及污染的土壤、 草地、 水、飼料都是本病的主要傳染源， 炭疽芽胞對環(huán)境具有很強的抵抗力， 其污染的土壤、水源及場地可形成持久的疫源地。本病主要經(jīng)消化道、呼吸道和皮膚感染。本病呈地方性流行。有一定的季節(jié)性，多發(fā)生在吸血昆蟲多、雨水多、洪水泛濫的季節(jié)。2.2 臨床癥狀2.2.1 本規(guī)范規(guī)定本病的潛伏期為20 天。2.2.2 典型癥狀本病主要呈急性經(jīng)過，多以突然死亡、天然孔出血、尸僵不全為特征。牛：體溫升高常達41 以上，可視黏膜呈暗紫色，心動過速、呼吸困難。呈慢性經(jīng)過的

3、病牛，在頸、胸前、肩胛、腹下或外陰部常見水腫；皮膚病灶溫度增高，堅硬，有壓痛，也可發(fā)生壞死，有時形成潰瘍； 頸部水腫常與咽炎和喉頭水腫相伴發(fā)生， 致使呼吸困難加重。急性病例一般經(jīng)2436小時后死亡，亞急性病例一般經(jīng) 25天后死亡。馬：體溫升高，腹下、乳房、肩及咽喉部常見水腫。舌炭疽多見呼吸困難、發(fā)絹；腸炭疽腹痛明顯。急性病例一般經(jīng) 2436小時后死亡，有炭疽癰時，病程可達 38天。羊：多表現(xiàn)為最急性（猝死）病癥，搖擺、磨牙、抽搐，掙扎、突然倒斃， 有的可見從天然孔流出帶氣泡的黑紅色血液。 病程稍長者也只持續(xù)數(shù)小時后死亡。豬：多為局限性變化，呈慢性經(jīng)過，臨床癥狀不明顯，常在宰后見病變。犬和其它肉

4、食動物臨床癥狀不明顯。2.3 病理變化死亡患病動物可視黏膜發(fā)紺、 出血。 血液呈暗紫紅色， 凝固不良，粘稠似煤焦油狀。皮下、肌間、咽喉等部位有漿液性滲出及出血。淋巴結(jié)腫大、充血，切面潮紅。脾臟高度腫脹，達正常數(shù)倍，脾髓呈黑紫色。嚴禁在非生物安全條件下進行疑似患病動物、 患病動物的尸體剖檢。2.4 實驗室診斷實驗室病原學診斷必須在相應級別的生物安全實驗室進行。2.4.1 病原鑒定2.4.1.1 樣品采集、包裝與運輸按照 NYT561 2.1.2 、 4.1 、 5.1 執(zhí)行。2.4.1.2 病原學診斷炭疽的病原分離及鑒定（見 NY/T561 ） 。2.4.2 血清學診斷炭疽沉淀反應（見 NY/T

5、561 ） 。2.4.3 分子生物學診斷聚合酶鏈式反應（PCR） （見附件1 ） 。3 疫情報告3.1 任何單位和個人發(fā)現(xiàn)患有本病或者疑似本病的動物，都應立即向當?shù)貏游锓酪弑O(jiān)督機構(gòu)報告。3.2 當?shù)貏游锓酪弑O(jiān)督機構(gòu)接到疫情報告后，按國家動物疫情報告管理的有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。4 疫情處理依據(jù)本病流行病學調(diào)查、 臨床癥狀， 結(jié)合實驗室診斷做出的綜合判定結(jié)果可做為疫情處理依據(jù)。4.1 當?shù)貏游锓酪弑O(jiān)督機構(gòu)接到疑似炭疽疫情報告后，應及時派員到現(xiàn)場進行流行病學調(diào)查和臨床檢查， 采集病料送符合規(guī)定的實驗室診斷，并立即隔離疑似患病動物及同群動物，限制移動。對病死動物尸體， 嚴禁進行開放式解剖檢查， 采樣時必須按規(guī)

6、定進行，防止病原污染環(huán)境，形成永久性疫源地。4.2 確診為炭疽后，必須按下列要求處理。4.2.1 由所在地縣級以上獸醫(yī)主管部門劃定疫點、疫區(qū)、受威脅區(qū)。疫 點：指患病動物所在地點。一般是指患病動物及同群動物所在畜場（戶組）或其它有關(guān)屠宰、經(jīng)營單位。疫 區(qū)：指由疫點邊緣外延3 公里范圍內(nèi)的區(qū)域。在實際劃分疫區(qū)時，應考慮當?shù)仫曫B(yǎng)環(huán)境和自然屏障（如河流、山脈等）以及氣象因素，科學確定疫區(qū)范圍。受威脅區(qū)：指疫區(qū)外延 5 公里范圍內(nèi)的區(qū)域。4.2.2 本病呈零星散發(fā)時，應對患病動物作無血撲殺處理，對同群動物立即進行強制免疫接種，并隔離觀察20 天。對病死動物及排泄物、 可能被污染飼料、 污水等按附件2

7、的要求進行無害化處理； 對可能被污染的物品、交通工具、用具、動物舍進行嚴格徹底消毒（見附件 2 ） 。疫區(qū)、受威脅區(qū)所有易感動物進行緊急免疫接種。對病死動物尸體嚴禁進行開放式解剖檢查， 采樣必須按規(guī)定進行， 防止病原污染環(huán)境，形成永久性疫源地。4.2.3 本病呈暴發(fā)流行時（ 1 個縣 10 天內(nèi)發(fā)現(xiàn) 5 頭以上的患病動物） ，要報請同級人民政府對疫區(qū)實行封鎖；人民政府在接到封鎖報告后，應立即發(fā)布封鎖令，并對疫區(qū)實施封鎖。疫點、疫區(qū)和受威脅區(qū)采取的處理措施如下：4.2.3.1 疫點出入口必須設立消毒設施。限制人、易感動物、車輛進出和動物產(chǎn)品及可能受污染的物品運出。 對疫點內(nèi)動物舍、 場地以及所有

8、運載工具、飲水用具等必須進行嚴格徹底地消毒?；疾游锖屯簞游锶窟M行無血撲殺處理。 其它易感動物緊急免疫接種。對所有病死動物、 被撲殺動物， 以及排泄物和可能被污染的墊料、飼料等物品產(chǎn)品按附件2 要求進行無害化處理。動物尸體需要運送時，應使用防漏容器，須有明顯標志，并在動物防疫監(jiān)督機構(gòu)的監(jiān)督下實施。4.2.3.2 疫區(qū)： 交通要道建立動物防疫監(jiān)督檢查站， 派專人監(jiān)管動物及其產(chǎn)品的流動，對進出人員、車輛須進行消毒。停止疫區(qū)內(nèi)動物及其產(chǎn)品的交易、移動。 所有易感動物必須圈養(yǎng)，或在指定地點放養(yǎng)；對動物舍、道路等可能污染的場所進行消毒。對疫區(qū)內(nèi)的所有易感動物進行緊急免疫接種。4.2.3.3 受威脅區(qū)

9、：對受威脅區(qū)內(nèi)的所有易感動物進行緊急免疫接種。4.2.3.4 進行疫源分析與流行病學調(diào)查4.2.3.5 封鎖令的解除最后 1 頭患病動物死亡或患病動物和同群動物撲殺處理后 20 天內(nèi)不再出現(xiàn)新的病例， 進行終末消毒后， 經(jīng)動物防疫監(jiān)督機構(gòu)審驗合格后， 由當?shù)孬F醫(yī)主管部門向原發(fā)布封鎖令的機關(guān)申請發(fā)布解除封鎖令。4.2.4 處理記錄對處理疫情的全過程必須做好完整的詳細記錄，建立檔案。5 預防與控制5.1 環(huán)境控制飼養(yǎng)、生產(chǎn)、經(jīng)營場所和屠宰場必須符合動物防疫條件審核管理辦法 （農(nóng)業(yè)部 200215 號令）規(guī)定的動物防疫條件，建立嚴格的衛(wèi)生（消毒）管理制度。5.2 免疫接種5.2.1 各省根據(jù)當?shù)匾咔?/p>

10、流行情況，按農(nóng)業(yè)部制定的免疫方案，確定免疫接種對象、范圍。5.2.2 使用國家批準的炭疽疫苗，并按免疫程序進行適時免疫接種，建立免疫檔案。5.3 檢疫5.3.1 產(chǎn)地檢疫按 GB16549 和動物檢疫管理辦法實施檢疫。檢出炭疽陽性動物時，按本規(guī)范4.2.2 規(guī)定處理。5.3.2 屠宰檢疫按 NY467 和動物檢疫管理辦法對屠宰的動物實施檢疫。5.4 消毒對新老疫區(qū)進行經(jīng)常性消毒，雨季要重點消毒。皮張、毛等按照附件 2 實施消毒。5.5 人員防護動物防疫檢疫、 實驗室診斷及飼養(yǎng)場、 畜產(chǎn)品及皮張加工企業(yè)工作人員要注意個人防護，參與疫情處理的有關(guān)人員，應穿防護服、戴口罩和手套，做好自身防護。261

11、附件 1聚合酶鏈式反應（PCR技術(shù)1 試劑1.1 消化液1.1.1 1M 三羥甲基氨基甲烷-鹽酸 （Tris-HCl）（pH8.0）三羥甲基氨基甲烷12.11g滅菌雙蒸水80mL濃鹽酸調(diào) pH 至 8.0滅菌雙蒸水加至 100mL1.1.2 0.5M 乙二鏤四乙酸二鈉（EDTA）溶液（pH8.0）二水乙二銨四乙酸二鈉 18.61g滅菌雙蒸水80mL氫氧化鈉 調(diào) pH 至 8.0滅菌雙蒸水加至 100mL1.1.3 20% 十二烷基磺酸鈉（SDS）溶液（pH7.2）十二烷基磺酸鈉20g滅菌雙蒸水80mL濃鹽酸調(diào) pH 至 7.2#滅菌雙蒸水加至 100mL1.1.4 消化液配制1M 三羥甲基氨基

12、甲烷-鹽酸 (Tris-HCl)(pH8.0)2mL0.5mol/L 乙二銨四乙酸二鈉溶液(pH8.0)0.4mL20% 十二烷基磺酸鈉溶液(pH7.2)5mL5M 氯化鈉 4mL滅菌雙蒸水加至 200mL1.2 蛋白酶 K 溶液蛋白酶 K5g滅菌雙蒸水加至 250mL1.3 酚/ 氯仿 / 異戊醇混合液堿性酚25mL氯仿24mL異戊醇1mL1.4 2.5mmol/LdNTPdATP(100mmol/L)20LdTTP(100mmol/L)20LdGTP(100mmol/L)20LdCTP(100mmol/L)20小1.5 8pmol/ L PCR 引物上游引物ATXU (2 OD)加入701

13、出滅菌雙蒸水溶解，下游引物ATXD (2 OD )加入697人滅菌雙蒸水溶解，分別取ATXU、ATXD 溶液各300人，混勻即為8pmol/ L擴增引物。1.6 0.5 單位 Taq DNA 聚合酶5單位Taq DNA 聚合酶1人滅菌雙蒸水加至10 L現(xiàn)用現(xiàn)配。1.7 10 XPCR緩沖液1.7.1 1mol/L 三羥甲基氨基甲烷-鹽酸 (Tris-HCl)( pH9.0)三羥基甲基氨基甲烷15.8g滅菌雙蒸水80mL濃鹽酸調(diào) pH 至 9.0滅菌雙蒸水加至 100mL1.7.2 10倍PCR緩沖液1mol/L 三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸 (Tris-HCl)( pH9.0) 1mL氯化鉀 0.

14、373g曲拉通 X-1000.1mL2651.8 澳化乙錠（EB）溶液溴化乙錠0.2g滅菌雙蒸水加至 20mL1.9 電泳緩沖液（50 倍）1.9.1 0.5mol/L 乙二鏤四乙酸二鈉（EDTA）溶液（pH8.0）二水乙二銨四乙酸二鈉18.61g滅菌雙蒸水80mL氫氧化鈉調(diào) pH 至 8.0滅菌雙蒸水加至 100mL1.9.2 TAE 電泳緩沖液（50 倍）三羥基甲基氨基甲烷（Tris）242g冰乙酸57.1mlL0.5mol/L 乙二銨四乙酸二鈉溶液（pH8.0）100mL滅菌雙蒸水加至 1 000mL用時用滅菌雙蒸水稀釋使用1.10 1.5 瓊脂糖凝膠瓊脂糖3gTAE 電泳緩沖液（50

15、倍）4mL滅菌雙蒸水196mL微波爐中完全融化，加澳化乙錠（EB）溶液20 L-o1.11 上樣緩沖液溴酚藍 0.2g ，加雙蒸水10m- 過夜溶解。 50g 蔗糖加入 50ml水溶解后，移入已溶解的溴酚藍溶液中，搖勻定容至 100m- 。1.12 其它試劑異丙醇 （分析純 ）70% 乙醇15mmo-/- 氯化鎂滅菌雙蒸水2 器材2.1 儀器分析天平、高速離心機、真空干燥器、 PCR 擴增儀、電泳儀、電泳槽、紫外凝膠成像儀（或紫外分析儀） 、液氮或 -70 冰箱、微波爐、組織研磨器、-20 C冰箱、可調(diào)移液器（2人、20山、200人、 1000 人）。2.2 耗材眼科剪、眼科鑷、稱量紙、 20

16、 m- 一次性注射器、 1.5 m- 滅菌離心管、0.2 mL薄壁PCR管、瓊脂糖、500 mL量筒、500 mL錐 形瓶、吸頭（10人、200人、1000人）、滅菌雙蒸水。2.3 引物設計根據(jù) GenBank 上已發(fā)表的炭疽桿菌 POX1 質(zhì)粒序列， 設計并合成了以下兩條引物：ATXU ：5 -AGAATGTATCACCAGAGGC-3 ATXD ：5 -GTTGTAGATTGGAGCCGTC-3 ，此對引物擴增片段為 394bp 。2.4 樣品的采集與處理2.4.1 樣品的采集病死或撲殺的動物取肝臟或脾；待檢的活動物，用注射器取血510mL, 28c保存，送實驗室檢測。2.4.2 樣品的處

17、理每份樣品分別處理。2.4.2.1 組織樣品處理稱取待檢病料0.2g ，置研磨器中剪碎并研磨，加入 2mL 消化液繼續(xù)研磨。取已研磨好的待檢病料上清100人加入1.5 mL滅菌離心 管中，再加入500人消化液和10人蛋白酶K溶液，混勻后，置55 c 水浴中416h 。2.4.2.2 待檢菌的處理取培養(yǎng)獲得的菌落，重懸于生理鹽水中。取其懸液100人加入 1.5mL滅菌離心管中，再加入500 L消化液和10 L蛋白酶K溶液,混勻后，置55 水浴中過夜。2.4.2.3 全血樣品處理待血凝后取上清放于離心管中，4 8000 g 離心 5 分鐘，取上清100人，加入500人消化液和10人蛋白酶K溶液，混

18、勻后，置55 水浴中過夜。2.4.2.4 陽性對照處理取培養(yǎng)的炭疽桿菌，重懸于生理鹽水中。取其懸液100 gL，置1.5 mL滅菌離心管中，加入500人消化液和10人蛋白酶K溶液，混勻后，置55 水浴中過夜。2.4.2.5 陰性對照處理取滅菌雙蒸水100人，置1.5 mL滅菌離心管中，加入500 L消 化液10 d蛋白酶K溶液，混勻后，置55 c水浴中過夜。2.5 DNA 模板的提取2.5.1 取出已處理的樣品及陰、陽對照，加入 600 L酚/氯仿/異戊醇混合液，用力顛倒 10 次混勻，12000g 離心 10 分鐘。2.5.2 取上清置 1.5mL 滅菌離心管中，加入等體積異丙醇，混勻，置液

19、氮中 3 分鐘。取出樣品管，室溫融化， 15000rpm 離心 15分鐘。2.5.3 棄上清，沿管壁緩緩滴入 1ml 70% 乙醇，輕輕旋轉(zhuǎn)洗一次后倒掉， 將離心管倒扣于吸水紙上 1 分鐘， 真空抽干 15 分鐘 （ 以無 乙醇味為準）。2.5.4 取出樣品管，用50人滅菌雙蒸水溶解沉淀，作為模板備 用。2.6 PCR 擴增總體積20此取滅菌雙蒸水8N,2.5mmol/L dNTP 、8pmol/ L 擴增引物、15mmol/L 氯化鎂、10XPCR緩沖液、0.5單位TaqDNA 聚合酶各2人，2人模板DNA。混勻，作好標記，加入礦物油20人 覆蓋 （有熱蓋的自動DNA 熱循環(huán)儀不用加礦物油）

20、。 擴增條件為 94 3 分鐘后， 94 30s ， 58 30s ， 72 30s 循環(huán) 35 次， 72 延伸 5 分鐘。2.7 電泳將PCR擴增產(chǎn)物15 gL混合3人上樣緩沖液，點樣于1.5%瓊脂 糖凝膠孔中，以5V/cm電壓于1 XTAE緩沖液中電泳，紫外凝膠成 像儀下觀察結(jié)果。2.8 結(jié)果判定在陽性對照出現(xiàn)394bp 擴增帶、 陰性對照無帶出現(xiàn)（ 引物帶除外）時，試驗結(jié)果成立。被檢樣品出現(xiàn)394bp 擴增帶為炭疽桿菌陽性， 否則為陰性。273附件 2無害化處理1 炭疽動物尸體處理應結(jié)合遠離人們生活、水源等因素考慮，因地制宜，就地焚燒。如需移動尸體，先用 5 福爾馬林消毒尸體表面，然后

21、搬運，并將原放置尸地及尸體天然孔出血及滲出物用 5%福爾馬林浸漬消毒數(shù)次，在搬運過程中避免污染沿途路段。 焚燒時將尸體墊起， 用油或木柴焚燒，要求燃燒徹底。無條件進行焚燒處理時，也可按規(guī)定進行深埋處理。2 糞肥、墊料、飼料的處理被污染的糞肥、墊料、飼料等，應混以適量干碎草，在遠離建筑物和易燃品處堆積徹底焚燒，然后取樣檢驗，確認無害后，方可用作肥料。3 房屋、廄舍處理開放式房屋、廄舍可用 5%福爾馬林噴灑消毒三遍，每次浸漬2小時。 也可用20漂白粉液噴霧，200mL/m 2作用 2 小時。 對磚墻、土墻、地面污染嚴重處，在離開易燃品條件下，亦可先用酒精或汽油噴燈地毯式噴燒一遍，然后再用 5 福爾

22、馬林噴灑消毒三遍。對可密閉房屋及室內(nèi)櫥柜、用具消毒，可用福爾馬林熏蒸。在室溫18 c條件下，對每2530m 3空間，用10 %濃甲醛液（內(nèi)含37%甲醛氣體）約 4000mL ，用電煮鍋蒸4 小時。蒸前先將門窗關(guān)閉，通風孔隙用高粘膠紙封嚴，工作人員或?qū)Ｓ梅蓝久婢卟僮?。密?12 小時后，打開門窗換氣，然后使用。熏蒸消毒效果測定， 可用浸有炭疽弱毒菌芽孢的紙片， 放在含組氨酸的瓊脂平皿上， 待熏后取出置37 培養(yǎng) 24 小時， 如無細菌生長即認為消毒有效。也可選擇其它消毒液進行噴灑消毒，如4 %戊二醛（pH8.08.5）2 小時浸洗、 5甲醛（約 15福爾馬林） 2 小時、 3 H2O22 小時或過氧乙酸2 小時。其中，H2O2 和過氧乙酸不宜用于有血液存在的環(huán)境消毒