磁珠分離技術(shù)

1、磁珠分離技術(shù)摘要：主要介紹了磁珠分離技術(shù)的基本概念，基本原理還有它的特點(diǎn)。磁珠分離技術(shù)中應(yīng)用最廣泛的是免疫磁珠分離技術(shù)，這里詳細(xì)說明了免疫磁珠分離技術(shù)的結(jié)構(gòu)以及有由它的結(jié)構(gòu)決定的它的一些重要特性，以及免疫磁珠分離技術(shù)的制備原理和方法。并且詳細(xì)說明了免疫磁珠分離技術(shù)的重要應(yīng)用，為幫助同學(xué)了解記憶，例舉了一些該技術(shù)的應(yīng)用實(shí)例。基本概念 ： 磁珠是一種包被有生物活性基團(tuán)的功能化載體 , 可分散于基液中形成磁性液體材料, 它兼有液體的流動(dòng)性和固體磁性顆粒材料的雙重特點(diǎn) , 從而使固一液相的分離變得十分方便快捷。磁珠法的出現(xiàn)和應(yīng)用 ,給生命科學(xué)的研究提供了一種新式的手段和武器, 也給大、中學(xué)生對(duì)的直觀認(rèn)

2、識(shí)提供了一個(gè)簡捷、客觀的實(shí)驗(yàn)途徑。其中最常用的事免疫磁珠技術(shù)。原理 ：利用人工合成的內(nèi)含鐵成分，可被磁鐵磁力所吸引，外有功能基團(tuán)，可結(jié)合活性蛋白質(zhì)（抗體）的磁珠，作為抗體的載體。當(dāng)磁珠上的抗體與相應(yīng)的微生物或特異性抗原物質(zhì)結(jié)合后，則形成抗原-抗體-磁珠免疫復(fù)合物，這種復(fù)合物具有較高的磁響應(yīng)性， 在磁鐵磁力的作用下定向移動(dòng)， 使復(fù)合物與其他物質(zhì)分離， 而達(dá)到分離、濃縮、純化微生物或特異性抗原物質(zhì)的目的。特點(diǎn):應(yīng)用于磁分離技術(shù)的磁性載體微球應(yīng)具備以下特點(diǎn): 粒徑比較小 , 比表面積較大 , 具有較大的吸附容量; 物理和化學(xué)性能穩(wěn)定, 具有較高的機(jī)械強(qiáng)度, 使用壽命長 ; 具有可活化的反應(yīng)基團(tuán) ,

3、以用于親和配基的固定化 ; 粒徑均一 , 能形成單分散體系 ; 懸浮性好 , 便于反應(yīng)的有效進(jìn)行。載體微球有納米級(jí)、微粒級(jí)的 ,納米級(jí)的載體微球與微粒級(jí)的載體微球相比具有以下優(yōu)點(diǎn) : 尺寸小 , 擴(kuò)散速度快,懸浮穩(wěn)定性好; 比表面積大, 偶聯(lián)容量大; 超順磁性 , 能快速實(shí)現(xiàn)磁性粒子的分散與回收。免疫磁珠 （Immonumagnetic beads， IMB 簡稱磁珠 ） ，由載體微球和免疫配基結(jié)合而成。載體微球的核心部分為金屬小顆粒（Fe304, Fe203）,是一種磁性高且較穩(wěn)定的磁性材料，核心外包裹一層高分子材料（如聚氯乙烯，聚苯乙烯，聚乙烯亞胺）， 最外層是功能基層， 如羥基 （ OH

4、）， 氨基 （ NH2）， 醛基 （-CHO）， 羧基 （一 COOH。）由于載體微球表現(xiàn)物理性質(zhì)不同，可共價(jià)結(jié)合不同的免疫配基(如酶、細(xì)胞、抗體、抗原、DNA、RNA等生物活性物質(zhì)。理想的免疫磁珠為一般粒徑較小，均勻的球形，具有保護(hù)性殼及超順磁性的粒子，其結(jié)構(gòu)為：核心為磁性材料，核心外層包裹高分子材料， 最外層為免疫配基。 形成免疫磁珠的關(guān)鍵是磁性載體， 按照其結(jié)構(gòu)的不同可分為三種：(1)殼一核結(jié)構(gòu)，即將高分子材料作為核，外面包裹磁性材料。(2)殼核殼結(jié)構(gòu)，中間為磁性材料，內(nèi)層和外層為高分子材料。(3)核殼結(jié)構(gòu)，磁性材料為核外面包裹高分子材料。作為免疫磁珠載體的磁性微球主要是核殼式結(jié)構(gòu)為最多

5、。磁性材料多為Fe，Ni， Co 等過渡金屬特定晶型的氧化物。目前應(yīng)用最廣泛的是鐵及其氧化物(Fe，F(xiàn)e304， Fe203 等 )。磁性微球是內(nèi)部含有納米磁性顆粒、外部為高分子殼層作為載體的復(fù)合材料， 其廣泛應(yīng)用于生物分子固定化和有機(jī)固相合成， 在生物工程和生物醫(yī)學(xué)的研究和實(shí)踐中， 固定化的生物分子通常用做親和分析的配基， 也可作為生物反應(yīng)的催化劑或藥物磁性微球主要有以下特性：(1)粒徑小，均一程度高，磁性微粒粒徑(直徑)范圍在 30 100rim 之間，且粒徑分布單分散， 使微球具有很強(qiáng)的磁響應(yīng)性， 又不會(huì)因粒徑太大而發(fā)生沉降， 具有較大的比表面積，偶聯(lián)容量大。(2)懸浮穩(wěn)定性好，以便高效

6、地與目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行偶聯(lián)，具有豐富的表面活性基團(tuán)，以便磁性微球與具有生物活性的物質(zhì)， 如生物酶， 蛋白質(zhì)等， 同時(shí)也可在其表面結(jié)合特異性靶向分子， 如各種特異性抗體等， 表面標(biāo)記生物分子進(jìn)而應(yīng)用于酶的固定化，免疫檢測(cè)，細(xì)胞分選，腫瘤的靶向治療，藥物載體及核酸的純化與分離等生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。(3)具有超順磁性：在外加磁場的存在下，磁性微粒有較好的響應(yīng)性，能迅速聚集， 當(dāng)撤去外加磁場時(shí)， 磁性微粒無磁性記憶， 能夠均勻分散， 不出現(xiàn)聚集現(xiàn)象。(4)操作簡便，在外磁場的作用下便可進(jìn)行磁粒的反復(fù)分離，分離過程十分簡單，可省去離心， 過濾等繁瑣操作， 節(jié)約時(shí)間， 與目前已有的醫(yī)學(xué)與生物相關(guān)方法相比，具有較好的

7、優(yōu)勢(shì)。(5)磁性微球應(yīng)用在生物工程，尤其是在生物醫(yī)學(xué)工程時(shí)，必須具有良好的生物相容性。這些生物高分子如脂類、多聚糖、蛋白質(zhì)具有良好的生物相容性，它們?cè)跈C(jī)體內(nèi)安全無毒，可降解，不與人體組織器官產(chǎn)生免疫抗原性。同時(shí)，磁性微?？煞奖阊杆俚赝ㄟ^機(jī)體自然排出， 而不會(huì)影響機(jī)體的健康， 這種性質(zhì)在靶向藥物中尤其重要。不影響被分離細(xì)胞或其它生物材料的生物學(xué)性狀和功能。(6)磁性微粒具有一定的機(jī)械強(qiáng)度和化學(xué)穩(wěn)定性，能耐受一定濃度的酸堿溶液和微生物的降解， 其結(jié)構(gòu)內(nèi)的磁性物質(zhì)不易被氧化， 磁性微粒的這種物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定特點(diǎn)，使其磁性能不易下降。磁性微粒的制備原理與方法： 按研究磁性微粒的學(xué)科分類， 可將其分為物

8、理、 化學(xué)以及其他一些特殊的制備方法。磁性微粒的化學(xué)制備方法1 .化學(xué)共沉淀法用化學(xué)共沉淀法合成超順磁流體， 該法指二價(jià)與三價(jià)鐵離子在堿性條件下生成沉淀，或利用氧化.還原反應(yīng)生成Fe304。共沉淀反應(yīng)原理方程式如下：Fe2+2Fe3+80H =Fe304+4H20， 在合成過程中， 條件的選擇至關(guān)重要， 物料比，堿用量，溫度，晶化溫度，攪拌速度，反應(yīng)時(shí)間，時(shí)間等因素均會(huì)影響最終產(chǎn)物納 米 級(jí) Fe304 的 生 成 和 性 質(zhì) 。 共 沉 淀 法 得 到 的 磁 性 微 粒 通 常 粒 徑 較 小(10nm"-'100rim) ， 因而具有較大比表面積和固載量。 但由于磁響應(yīng)

9、性較弱， 含磁量低，操作時(shí)需要較強(qiáng)的外加磁場作用。2 .沉淀氧化法一定濃度的鐵鹽在堿性條件下生成氫氧化亞鐵沉淀， 在恒溫?cái)嚢枨闆r下， 向氫氧化亞鐵沉淀中加入雙氧水使其氧化成Fe304 微粒。其反應(yīng)式如下：Fe2+20H。=Fe(OH)23Fe(OH)2+O=Fe304+3H2農(nóng)用沉淀氧化法合成 Fe304磁性微粒，原材料的純度，反應(yīng)的堿比，溫度，通氣量，氧化時(shí)間等各個(gè)因素都對(duì)磁粒的性能有影響。由于存在著粒度分布不均勻的問題，還有待于進(jìn)一步研究解決3 .改進(jìn)共沉淀法改進(jìn)共沉淀法是在共沉淀法制備Fe304 納米微粒的基礎(chǔ)上，對(duì)其進(jìn)行改進(jìn)， 沉淀物在洗滌、過濾、干燥時(shí)易產(chǎn)生團(tuán)聚現(xiàn)象，一種通過加入表面

10、活性劑，對(duì)制得的納米Fe304 微粒進(jìn)行表面改性，使其具有親水性或親油性， 最后通過膠溶等方式來獲得磁性液體，另外一種是制得納米Fe304復(fù)合粒子，這種納米Fe304復(fù)合粒子能在更大pH 范圍內(nèi)穩(wěn)定分散。蔣新宇等(2003)先通過化學(xué)反應(yīng)生成Fe304 微粒， 充分洗滌后對(duì)其表面包覆雙層表面活性劑， 得到具有磁響應(yīng)性和穩(wěn)定性強(qiáng)的納米級(jí)Fe304磁性粒子。在改性過程中，P H值、表面活性劑的成分配比和表面活性劑的用量對(duì)顆粒改性效果影響很大，王偉等(2001)通過大量的研究，強(qiáng)堿性和酸性環(huán)境不利于改性， P H 值在8"-'-12 時(shí)效果最好，通過理論計(jì)算可以得出表面活性劑用量。

11、程海斌等(2003)采用改進(jìn)共沉淀法制得的納米級(jí)Fe304 復(fù)合微粒，在更寬的 P H 范圍內(nèi)能穩(wěn)定分散。研究表明， P H 值、表面活性劑、芎電位對(duì)Fe304復(fù)合微粒分散性產(chǎn)生很大的影響。另外，磁性微粒的化學(xué)制備方法還有化學(xué)還原法、電沉積法、水熱合成法等。磁性微粒的物理制備方法：1 .高能球磨法高能球磨法是一個(gè)無外部熱能供給和由大晶粒變?yōu)樾【Я５母吣芮蚰ミ^程， 其原理是在高能球磨機(jī)中將金屬粉末長時(shí)間運(yùn)轉(zhuǎn)，金屬粉末在接受回轉(zhuǎn)機(jī)械能傳遞后， 在冷態(tài)下反復(fù)擠壓和破碎作用下， 成為彌散分布的超細(xì)微粒粒。 氣流磨作為常用的納米粉碎技術(shù)， 其通過熱蒸汽能量或者高速氣流產(chǎn)生的粒度微細(xì)， 粒度分布窄、粒子表

12、面光滑、分散性好、活性大、形狀規(guī)則、純度高等優(yōu)點(diǎn)。2 .物理氣相沉積法物理氣相沉積法是利用真空蒸發(fā)、 激光加熱蒸發(fā)、 濺射、 電子束照射等方法使原料氣化或形成等離子體，接著在介質(zhì)中急劇冷凝。雖然制得的納米微粒純度高，結(jié)晶組織好，易于粒度的控制，但是技術(shù)設(shè)備相對(duì)要求高。根據(jù)加熱源的不同，目前用于制備納米鐵微粒的方法可以分為： 1、熱等離子體法，該法是將金屬粉末用等離子體熔融、 蒸發(fā)和冷凝以制得納米微粒。 所制得的微粒粒度均勻、 純度高。郝春成等(2000)采用心+H2 電弧等離子體方法制備出平均粒徑為 40rim 的球形超鐵超微粒子。 2、濺射法，濺射法是替代蒸發(fā)利用濺射現(xiàn)象制得的納米級(jí)微粒。該

13、法不僅可以制備納米級(jí)金屬微粒，而且可用于制備納米金屬薄膜。3、惰性氣體冷凝法，是將純度高的惰性氣體和蒸發(fā)物質(zhì)引入到真空加熱蒸發(fā)裝置內(nèi)，經(jīng)過一系列能量反應(yīng)， 最后通過凝聚作用形成納米級(jí)簇團(tuán)。 刮下聚集在液氮冷卻棒上的粉狀微粒，在真空高壓裝置中制備成厚度為10微米1毫米、直徑為幾毫米的圓片。3 .真空冷凍干燥法 先將濕物料在冷凍劑作用下降溫凍結(jié)成凝膠或固體， 然后將凝膠或固體在低溫低壓下真空干燥， 使凝膠或固體中的溶劑成分升華除去， 從而得到干燥的納米粒子。這種方法結(jié)合了真空技術(shù)和低溫技術(shù)。 采用真空冷凍干燥法制備納米粒子， 具有微粒形狀規(guī)則、粒徑小且均勻、粒子間無硬團(tuán)聚、化學(xué)純度高、分散性好、比

14、表面積高等優(yōu)點(diǎn)。 該技術(shù)方法在大規(guī)模生產(chǎn)微細(xì)粉末時(shí)， 不僅成本較低， 而且操作簡便、 可靠， 具有廣泛的實(shí)用價(jià)值。 另外， 磁性微粒的物理制備方法還有聚合法、鹽析法、深度塑性變形法、分子自組裝法 (SA) LB膜法等。應(yīng)用范圍： 磁珠分離技術(shù)在生物學(xué)方面的應(yīng)用始于20 世紀(jì) 70 年代后期 , 目前已經(jīng)在分子生物學(xué)、細(xì)胞學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、生物化學(xué)等領(lǐng)域取得一些令人矚目的研究成果。免疫磁性珠( Immonumagnet ic beads, IMB )是免疫微球的一種。免疫微球是于 70 年代中期發(fā)展起來的一項(xiàng)免疫學(xué)技術(shù), 它具備了固相化試劑特有的優(yōu)點(diǎn)以及免疫學(xué)反應(yīng)的高度專一性, 所以它在免疫

15、檢測(cè)、免疫吸附、細(xì)胞分離和培養(yǎng)等領(lǐng)域中得到越來越廣泛的應(yīng)用1、用于細(xì)胞分離和提純使用 IMB 進(jìn)行分離細(xì)胞有兩種方式；直接從細(xì)胞混合液中分離出靶細(xì)胞的方法， 稱為陽性分離； 用免疫磁珠去除無關(guān)細(xì)胞， 使靶細(xì)胞得以純化的方法稱為陰性分離。免疫磁珠技術(shù)可用來分離人類各種細(xì)胞如紅細(xì)胞、外周血嗜酸/ 堿性粒細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞、造血細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、T占T淋巴細(xì)胞，人類關(guān)節(jié)滑膜 細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞、及多種腫瘤細(xì)胞等。2、體外細(xì)胞擴(kuò)增樹突狀細(xì)胞(Dendriticcells, DC造血干、祖細(xì)胞等細(xì)胞在科研及臨床上都具有巨大的應(yīng)用價(jià)值， 但是在體內(nèi)含量較少而且分布廣泛， 難以獲得大量高純度的細(xì)胞，限

16、制了該領(lǐng)域的發(fā)展。體外擴(kuò)增輔以免疫磁珠技術(shù)有望解決這一難題。在這一過程中， 用免疫磁性微球分離純化出待擴(kuò)增的細(xì)胞， 用特定的因子組合培養(yǎng)，許多研究者用這樣的方法尋找擴(kuò)增的最佳細(xì)胞因子組合和移植的最佳時(shí)機(jī)。3、免疫檢測(cè)免疫磁性微球可以簡單快速地從血液或者骨髓中富集、 清除癌細(xì)胞， 廣泛地應(yīng)用于疾病檢測(cè)、 癌癥治療和自身骨髓移植中， 還被用于從母體外周血中分離胎兒細(xì)胞進(jìn)行無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷。 免疫磁珠分離技術(shù)用在微生物檢測(cè)方面能準(zhǔn)確快速地檢測(cè)出樣品中的Coli O 157,這對(duì)于食品衛(wèi)生和預(yù)防疾病的傳播具有重要的意 義。PC叱術(shù)與免疫磁珠技術(shù)結(jié)合在分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)診斷學(xué)等方面有非常重要 的作用，這方面

17、的研究在醫(yī)學(xué)檢測(cè)方面的應(yīng)用， 可以簡便快速地診斷膀胱癌、 乳 腺癌、前列腺癌、腹膜胃癌、上皮月中瘤細(xì)胞等，使免疫磁性分離技術(shù)的應(yīng)用更加 廣泛。4、在核酸與基因工程上的應(yīng)用免疫磁球可以看作是親合層析技術(shù)中的微型配基裁體，借助親合素-生物素(Biotin-Avidin)系統(tǒng)免疫磁球可與非蛋白質(zhì)結(jié)合，生物素和親合素間有著高度 的親和力，兩者的結(jié)合迅速、專一、穩(wěn)定，在分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、免疫組織化學(xué) 等領(lǐng)域中的應(yīng)用也越來越廣泛，與生物磁珠技術(shù)結(jié)合后，更是產(chǎn)生了誘人的發(fā)展 前景，并廣泛地應(yīng)用于分離純化 RNA mRNA、核酸片段等及相關(guān)研究。河南惠 爾納米科技有限公司很早就在從事該方面的研究，并且已經(jīng)研發(fā)

18、出多款磁珠法核酸提取試劑盒，性能相當(dāng)穩(wěn)定。下面是核酸提取的一般流程：5、用于分型免疫磁珠法可被應(yīng)用于臨床器官移植供受者的快速選配。在高梯度磁場下，用免疫磁珠法分離靜脈或腹腔血中 T、B淋巴細(xì)胞，并利用分離的淋巴細(xì)胞進(jìn)行 HLA-I II類抗原分型。如采用磁珠技術(shù)和單抗試劑建立起可在完成HLA-I II類抗原一類分型的新方法，還可應(yīng)用免疫磁珠分離技術(shù)進(jìn)行腎移植供受體的HLA分型、探討血液病患者反復(fù)血小板輸注的治療效果與HLA之間的相關(guān)性。6、用作靶向釋藥系統(tǒng)的載體免疫磁性微球作為靶向釋藥系統(tǒng)的載體可使免疫磁性微球上的抗癌藥物更易與癌細(xì)胞接觸， 服用這種制劑后， 在體外適當(dāng)部位用一適宜強(qiáng)度的磁鐵，

19、 將磁性微球引導(dǎo)到體內(nèi)特定靶區(qū)， 提高了殺傷癌細(xì)胞的效果。 很多研究者使用不同的方法制成了針對(duì)不同癌細(xì)胞的免疫磁性微球， 作為靶向釋藥系統(tǒng)的載體并在實(shí)驗(yàn)中證實(shí)這種釋藥載體具有良好的功效。應(yīng)用實(shí)例1 . 成人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的分離與純化【摘要】 目的： 利用免疫磁珠分離成人骨髓神經(jīng)生長因子受體(nerve growth factorreceptor, NGFR)日性細(xì)胞，獲得同質(zhì)性骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stromalcells, BMSCs)方法采用Percoll密度梯度離心法分離成人骨髓中單個(gè)核細(xì)胞(瑚 nnonuclear cells, MNCsb XM MNCs進(jìn)行常規(guī)貼壁

20、培養(yǎng)或應(yīng)用磁分離技術(shù)分離 NGFR名田胞。分另I檢測(cè)NGFR鈿胞和常規(guī)貼壁培養(yǎng)所獲BMSC咻外擴(kuò)增和集落形成能力，分析其細(xì)胞表 型和細(xì)胞周期，并進(jìn)行成骨、成脂肪誘導(dǎo)。結(jié)果免疫磁珠分離獲得NGFR鈿胞的 純度為(90. 4±4. 7)%, NGFR鈿胞較貼壁培養(yǎng)獲得 BMSCs具備更強(qiáng)增殖能力 和成骨及成脂肪分化潛能。結(jié)論：利用免疫磁珠分離骨髓 NGFR+田胞可以獲得同質(zhì)性原始 BMSCs2 .用于溶藻弧菌快速檢測(cè)的免疫磁珠技術(shù)摘 要：近年來，我國海水養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，特別是高密度養(yǎng)殖模式的推廣，造成養(yǎng)殖生物細(xì)菌性疾病發(fā)生的頻率和范圍逐漸擴(kuò)大。由于溶藻弧菌 (Vibrio alginol

21、yticus)是海洋優(yōu)勢(shì)弧菌之一，故由溶藻弧菌引起的養(yǎng)殖品種的病害也占有 很高比例。由溶藻弧菌引起的魚、蝦、貝類等養(yǎng)殖品種致病，對(duì)我國養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)造成很大損失。 目前我國對(duì)于養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)品種溶藻弧菌等的細(xì)菌性疾病的治療， 主要依靠投放大量的抗生素， 長此以往不僅使病原菌產(chǎn)生了耐藥性， 而且由于藥物的殘留同時(shí)也對(duì)人類的健康造成重大威脅。 因此建立溶藻弧菌的快速、 準(zhǔn)確、 敏感檢測(cè)方法是十分重要的。 即能夠在早期診斷出溶藻弧菌潛在的致病威脅， 還可以在早期進(jìn)行治療和預(yù)防， 這樣可以在一定程度上減少抗生素的使用， 提高養(yǎng)殖品種的存活率。 而且建立起的檢測(cè)方法還可以用于水產(chǎn)品的安全檢測(cè)， 避免食物中 的溶藻弧

22、菌對(duì)人類健康造成威脅。免疫磁珠分離技術(shù)(immunomagnetic separation, MS)是以免疫磁珠為基礎(chǔ)發(fā)展起來的免疫檢測(cè)技術(shù)，是以抗體包被的磁珠為載體，利用抗原抗體的特異性反應(yīng) , 在反應(yīng)體系中形成抗原-抗體磁珠復(fù)合物，該復(fù)合物在磁場的作用下做定向運(yùn)動(dòng)，從而達(dá)到分離抗原的作用。 免疫磁珠分離技術(shù)不僅兼具固相化試劑特有的優(yōu)點(diǎn)和免疫學(xué)反應(yīng)的高度專一性等特點(diǎn)，而且分離時(shí)間短、速度快、分離效率高，不影響被分離生物材料的生物學(xué)性狀和功能， 因此成為近年來國內(nèi)外比較熱門的一種新的免疫學(xué)技術(shù)，并在生物大分子與細(xì)胞的分離檢測(cè)方面表現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。 本研究就是以該技術(shù)為基礎(chǔ)， 建立快速、 高

23、效的溶藻弧菌免疫磁珠快速檢測(cè)技術(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： （ 1）通過石碳酸滅活法制備溶藻弧菌抗原，用以免疫新西蘭大白兔，頸動(dòng)脈取血法共集150mL 抗血清，其凝集效價(jià)為1:5120。通過蛋白A 柱親和層析法從10mL 抗血清純化出濃度為 mL 的兔抗溶藻弧菌IgG 共40mL。改良ELISA法測(cè)定IgG的效價(jià)為1:256000。（2）利用ELISA法檢測(cè)溶藻 弧菌兔抗IgG的包被效果。結(jié)果為2仙L免疫磁珠的最大結(jié)合量為Ng/mL最佳結(jié)合時(shí)間為 5min 。不同 pH 值，離子濃度對(duì)IgG 與磁珠的結(jié)合無明顯影響。（3）初步建立了溶藻弧菌免疫磁珠的檢測(cè)技術(shù)：用已包被兔抗溶藻弧菌 IgG 的免疫 磁珠檢

24、測(cè)溶藻弧菌， 結(jié)果為 1mL 菌液中免疫磁珠的最佳加入量 （最佳工作濃度） 為20小匕最佳反應(yīng)時(shí)間為20min。免疫磁珠檢測(cè)敏感性為 mL 3.磁珠分離DNA 技術(shù)檢測(cè) HIV-1 逆轉(zhuǎn)錄酶基因耐藥性突變摘要 HIV 1 逆轉(zhuǎn)錄酶基因突變導(dǎo)致的耐藥性嚴(yán)重影響了藥物對(duì)病人的治療效果，耐藥性突變的檢測(cè)對(duì)于指導(dǎo)合理用藥具有重要意義。發(fā)展了一種檢測(cè)HIV 1 逆轉(zhuǎn)錄酶基因耐藥性突變的新方法，在兩步MS PCR方法的基礎(chǔ)上，引入磁珠分離DNA技術(shù)并結(jié)合酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)方法（ELIS順測(cè)逆轉(zhuǎn)錄酶基因耐藥性突變 T215F和Y181G結(jié)果顯示：MS-PCR結(jié)合磁珠分離技術(shù)和 ELISAft有較高的靈 敏度和

25、特異性，陽性陰性比值（P N 值）達(dá)到要求，突變型模板檢測(cè)限為5 左右，耗時(shí)短且能進(jìn)行高通量檢測(cè)。方法原理:本研究采用的MS. PCR吉合磁珠分離DNA技術(shù)檢測(cè)耐藥性突變。原理 如圖1所示。81:在第一輪PCR得到待檢測(cè)位點(diǎn)基因后，第二輪 PCR弓I入MS一 PCR檢測(cè)點(diǎn)突變技術(shù)的原理，設(shè)計(jì)了一對(duì)長度一致的 MSPCR弓I物。其中Pw和 P。的3'末端第一位堿基分別與野生型和突變型模板的堿基序列相對(duì)應(yīng)，P。和P。分別在3'末端24位的不同位置再引入一個(gè)突變，這樣兩個(gè)引物就有 3個(gè)位點(diǎn)不匹配。兩個(gè)引物通過競爭，分別擴(kuò)增與自身序列更相似的模板。在PM 的5'端標(biāo)記地高辛，B

26、IO. RT2的5'端標(biāo)記生物素，當(dāng)有突變型模板存在時(shí)，P。引物競爭突變型模板能力強(qiáng)于 Pw, PCR產(chǎn)物為一端生物素另一端地高辛 標(biāo)記的雙鏈DNA,利用親和素包被磁珠捕獲 DNA產(chǎn)物，通過堿性磷酸酶標(biāo)記的 地高辛抗體可以利用酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)(ELIS期法對(duì)DNA產(chǎn)物中的地高辛進(jìn)行 檢測(cè)，從而檢測(cè)點(diǎn)突變的存在?？傊?，MS-PCR吉合磁珠分離DNA技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)逆轉(zhuǎn)錄酶基因的耐藥性突變檢測(cè)，具有靈敏度高、特異性好、無污染、能實(shí)現(xiàn)高通量等一系列優(yōu)點(diǎn)， 有較好的臨床應(yīng)用前景， 下一步工作將進(jìn)行較多臨床樣品實(shí)測(cè)， 并通過與國際認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)方法的平行比較， 以完善該方法以求達(dá)到臨床應(yīng) 用要求。4 .

27、致病性大腸桿菌與免疫磁珠分離技術(shù)致病性大腸桿菌特別是O157： H7 已成為世界性的傳染性病原，是食品安全和公共衛(wèi)生的重要監(jiān)測(cè)對(duì)象之一。 免疫磁珠分離技術(shù)是一項(xiàng)新的技術(shù)， 可以特異性地、有效地分離出相應(yīng)的 0157 和其它微生物及生物活性組分，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性和工作效率。 免疫磁珠分離技術(shù)是一項(xiàng)新的技術(shù)， 可以特異性地、 有效地分離出相應(yīng)的 0157 和其它微生物及生物活性組分，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性和工作效率。免疫磁珠(Immunomagnetic Beads IMB)就是將直徑0. 054微米具有超順磁性的微粒的表面經(jīng)化學(xué)修飾， 使之與特異性抗體牢固結(jié)合， 成為能與特異性抗原結(jié)合且有磁性的微珠。

28、樣品經(jīng)618小時(shí)增菌后，分別取1 1. 2毫升增菌液和50 微升免疫磁珠加入帶蓋塑料瓶中， 在磁板背景下混合， 如果有相應(yīng)抗原存在， 免 疫磁珠就會(huì)將其捕獲， 然后利用磁性將免疫磁珠聚集， 經(jīng)清洗后接種到選擇性分 離平板上 .5 .磁分離技術(shù)及其在食源性致病菌監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)行分離免疫磁珠分離技術(shù)的最突出的優(yōu)點(diǎn)是特異性強(qiáng)， 可以明顯提高檢免疫磁珠分離技術(shù)在傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法中的應(yīng)用免疫磁珠分離技術(shù)可以選擇性的富集樣品溶液或增菌液中的目標(biāo)致病菌 , 通過洗脫可以除去檢樣中的各種雜菌和干擾物質(zhì), 因此可以顯著提高食源性致病菌的檢出率。Skjerve21等報(bào)道采用免疫磁性分離技術(shù), 從乳及乳制品、肉類和

29、蔬菜中分離沙門菌 , 其檢測(cè)靈敏度為 100 cfu / g。Chapm an 22分別用選擇性平板直接分離和免疫磁珠分離的方法從84 份牛糞中 分離O157: H7,分離菌株數(shù)分別為23和61,說明免疫磁珠分離O157: H7的靈敏度、特異性都較好。陳純23等應(yīng)用自動(dòng)酶標(biāo)免疫檢測(cè)系統(tǒng)(V IDAS)自動(dòng)免疫磁珠收集系統(tǒng)( AIM S)、 傳統(tǒng)的常規(guī)分離方法對(duì)腸出血性大腸桿菌 O157: H 7檢測(cè)進(jìn)行了比較, 結(jié)果應(yīng)用自動(dòng)免疫磁珠收集系統(tǒng)對(duì)79 份樣品檢測(cè) , 檢出率為 6133%,而自動(dòng)酶標(biāo)免疫檢測(cè)系統(tǒng)(VIDA竽口傳統(tǒng)分離方法未檢出。測(cè)靶細(xì)菌的準(zhǔn)確性，止匕外，在有些情況下可以節(jié)約 121

30、 8小時(shí)的時(shí)間。結(jié)論：免疫磁珠分離技術(shù)(Immunomagnetic beads sep aration techniques ， IMB)是將免疫學(xué)反應(yīng)的高度特異性與磁珠特有的磁響應(yīng)性相結(jié)合的一種新的免疫學(xué)技術(shù)；是一種特異性強(qiáng)、靈質(zhì)純化敏度高的免疫學(xué)檢測(cè)方法和抗原純化手段。是近年來國內(nèi)外研究較多的一種新的免疫學(xué)技術(shù)。目前該項(xiàng)技術(shù)在細(xì)胞分離、蛋白、免疫學(xué)及微生物學(xué)檢測(cè)等方面均取得了較大的進(jìn)展，是目前最有推廣價(jià)值的技術(shù)之一。參考文獻(xiàn)： Y;Radu A;Shaaban A;Flake AW Selection, enrichment, and culture expansion of murin

31、e mesenchymal progenitor cells by retroviral transduction of cycling adherent bone marrow cells外文期干U 2000LT;Weiss L The development of vertebral bone marrow in the human fetuses1976EA;Kinsey SE;English A;Jones RA, Straszynski L, Meredith DM, Markham AF, Jack A, Emery P,McGonagle D Isolation and char

32、acterization of bone marrow multipotential mesenchymal progenitor cells(外文期刊2002DJ;Nye SH;Hantzopoulos P;Macchi M J,Squinto SP,Goldfarb M,Yancopoulos GD TrkB mediatesBDNF/NT-3-dependent survival and proliferation in fibroblasts lacking the low affinity NGF-receptor 外文期刊 1991N;Morgan S;Evans M;Issa R, Fine D, Afford S, Wilkins B, Iredale J Hepatic stellate cells express the low affinity nerve growth factor receptor p75 and undergo apoptosis in response to nerve growth factor stimulation 外文期干U 2000PJ;Torok-Storb B CD34 expression by stromal precursors in normal hu