白藜蘆醇苷四種異構(gòu)體

1、高效液相色譜法檢測白藜蘆醇及其糖甘四種異構(gòu)體曾瑋馬志玲中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，分析科學(xué)研究所廣州510275摘要本實(shí)驗(yàn)建立了 RP-HPL C法同時分離測定白藜蘆醇及其糖甘四種異構(gòu)體的 方法，將方法用于紅葡萄酒中白藜蘆醇及其糖甘的四種異構(gòu)體、虎杖中反式白藜蘆醇及其糖甘的分析測定獲得滿意的結(jié)果。以Hypersil ODS2 （ 5叩1I.D. 4.0mm x 200mm色譜柱，用甲醇，水作為流動相進(jìn)行梯度洗脫，二極管陣列檢測器在306nm（反式白藜蘆醇及甘），288nm（順式白藜蘆醇及甘）檢測，白藜蘆醇及其糖甘的四種異 構(gòu)體在30min內(nèi)得到較好的分離。確定了提取紅葡萄酒中白藜蘆醇及其糖甘的

2、 四種異構(gòu)體的最佳預(yù)處理方法，在pH=2的條件下，以乙酸乙酯為溶劑可獲得最佳萃取效果，此方法用于5種不同的紅葡萄酒中，白藜蘆醇及其糖甘的回收率分別為94.6%、97.8%。使用微波破壁-溶劑提取-高效液相色譜法測定虎杖中的 反式白藜蘆醇及其糖甘，大大簡化了分析步驟。關(guān)鍵詞 高效液相色譜法，葡萄酒，虎杖1.前言白藜蘆醇（Resveratrol）是植物體內(nèi)產(chǎn)生的天然二苯乙烯類多酚物質(zhì)，一種天然活性成分。糖甘可以分解為白藜蘆醇。白藜蘆醇及糖甘，存（trans-resveratrol），順式白藜蘆醇（cis-在自然條件下，白藜蘆醇主要以其糖甘的形式存在，分子中，其連續(xù)環(huán)狀分子中的雙鍵能夠在紫外光或其它

3、物理化學(xué)因素的誘導(dǎo)下發(fā)生幾何異構(gòu)在白藜蘆醇及其糖甘的4種異構(gòu)體，即反式白藜蘆醇glucoside）和順式白藜蘆醇-3-O"糖甘resveratrol），反式白藜蘆醇-3-O- p 糖甘（trans-resveratrol98-3-O- 3糖昔HO反式白藜蘆醇-3-O- 6糖甘順式白藜蘆醇圖1白藜蘆醇及其甘的異構(gòu)體化學(xué)結(jié)構(gòu)圖*基金項(xiàng)目 中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院第三屆創(chuàng)新化學(xué)實(shí)驗(yàn)與研究項(xiàng)目（批準(zhǔn)號02018）第一作者 曾瑋 （1981年1月出生） 女 中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院材料化學(xué)系 99級指導(dǎo)老師 馬志玲Email地址cesmzl白藜蘆醇及白藜蘆醇甘具有抗癌、預(yù)防動脈粥樣硬化、抗

4、細(xì)菌、抗真菌、抗休克、鎮(zhèn)咳平喘等多種藥理作用。可以使用氣相色譜、毛細(xì)管電泳法2和高效液相色譜35對其進(jìn)行分離測定。本文采用高效液相色譜法分別對葡萄酒和中草藥虎杖中白藜蘆醇及其糖甘進(jìn)行分析。本實(shí)驗(yàn)以葡萄酒作為研究對象，在比較固相萃取法和液液萃取法的萃取效率的基礎(chǔ)上，提出了乙酸乙酯作為萃取劑的液液萃取法同時萃取紅葡萄酒中白藜蘆醇及其甘的四種異構(gòu)體是最好的前處理方法，優(yōu)化了乙酸乙酯萃取紅葡萄酒中白藜蘆醇及其甘的四種異構(gòu)體的最佳條件，使用液液萃取法一HPLC法對5種紅葡萄酒中白藜蘆醇及其甘的四種異構(gòu)體進(jìn)行了分離測定。本文還采用微波破壁一溶劑提取一HPLC法直接測定虎杖中白藜蘆醇及其糖甘反式白藜蘆醇及其

5、糖甘，與傳統(tǒng)的溶劑浸取方法相比較，大大簡化了分析步驟，獲得滿意的結(jié)果。2.實(shí)驗(yàn)部分2.1儀器配有二極管陣列檢測器的1100型高效液相色譜儀（Agilent公司），化學(xué)工作站（AgilentChemStation for LC 3D ）, QW-2HC©多管微波機(jī)（箱式）,ZF-3型三用紫外儀，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。2.2試劑反式白藜蘆醇純品（經(jīng)HPLC檢驗(yàn)純度99.99% , Sigma公司）；反式白藜蘆醇甘純品（經(jīng)HPLC檢驗(yàn)純度99.9%，北京迪爾塔金生物有限公司） ；順式白藜蘆醇及其糖甘的標(biāo)準(zhǔn)品由經(jīng)紫 外光照射其相應(yīng)的反式化合物獲得。甲醇（ HPLC級，MTEDLA ）,流動相所用水為雙

6、蒸水； 其余試劑均為分析純。2.3色譜條件色譜柱（依利特公司）Hypersil ODS2（5Mm I.D. 4.0mm x 200mm ），并配有 C18保護(hù)柱；流動相為 MeOH和H2O,采用下列梯度淋洗方式分別分離測定紅葡萄酒和虎杖中白藜蘆醇及其 糖甘的4種異構(gòu)體，（1）紅葡萄酒的梯度洗脫程序：015min 10%22%、1525min 22%50%、2534min 50%66% （ MeOH 濃度，v/v） , （2）虎杖的梯度洗脫程序：020min 20%60%、2030min 60%100% （ MeOH 濃度，v/v）；柱溫30 C； 流速0.8mL/min ;檢測波長分別為 28

7、8nm（順式白藜蘆醇和甘）、306nm （反式白藜蘆醇和甘）；進(jìn)樣量：10卜L。在上述色譜條件下，白 藜蘆醇及其糖甘的 4種異構(gòu)體的色譜分離圖如圖2。圖2梯度B分離白藜蘆醇及其昔四種異構(gòu)體的色譜圖梯度A分離白藜蘆醇及其昔四種異構(gòu)體的色譜圖A反式白藜蘆醇昔，B反式白藜蘆醇，C順式白藜蘆醇昔 ，D順式白藜蘆醇；色譜條 件如正文。2.4實(shí)驗(yàn)萬法1 .紅葡萄酒中白藜蘆醇及其糖甘的4種異構(gòu)體的分離測定取適量市售紅葡萄酒，用 2mol/L的HCl調(diào)其pH值至2,準(zhǔn)確移取上述紅葡萄酒于分液漏 斗中，用三倍于試樣體積的乙酸乙酯分三次萃取，每次萃取時間為10min,分出有機(jī)層，合并有機(jī)層用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀低溫旋干，加

8、50%甲醇水溶液溶解，使用0.45Mm濾膜過濾，濾液按上述色譜條件分析檢測，用外標(biāo)法、峰面積進(jìn)行定量。2.虎杖中反式白藜蘆醇及其糖甘的2種異構(gòu)體的分離測定稱取適量虎杖樣品，適量水浸泡，除去水分，以一定功率的微波輻照，無水乙醇，水浴加熱 回流。向提取液加入適量的HCl，繼續(xù)加熱回流。 處理后的提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，定容，使用0.45麗濾膜過濾，濾液按上述色譜條件分析檢測，用外標(biāo)法、峰面積進(jìn)行定量。3.結(jié)果與討論3.1色譜梯度洗脫條件優(yōu)化通過嘗試不同的梯度淋洗，對四種異構(gòu)體的混合標(biāo)準(zhǔn)樣品、紅葡萄酒實(shí)際樣品和虎杖實(shí)際樣品進(jìn)行分離分析，從分離度、峰形、實(shí)際試樣的背景及分析時間等多因素考慮，最終確定分離紅葡萄

9、酒和虎杖的梯度洗脫程序分別為A和B。A : 015min 10%22%、1525min 22%50%、2534min 50%66% ; B : 020min 20%60%、2030min 60%100% （ MeOH 濃度，v/v）; 使用最佳色譜條件對紅葡萄酒和虎杖的色譜分離圖如圖3, 4所示。那201510DADI:/非苔:消徹'二點(diǎn)'：；.三三I： flnl_圖3用梯度A分離紅酒實(shí)際樣品色譜圖A反式白藜蘆醇昔， B反式白藜蘆醇， C一 一順式白藜蘆醇昔 D順式白藜蘆醇；色譜條 件如正文。I II"'：10:2025 T-圖4 用梯度B分離虎杖實(shí)際樣品色譜

10、圖A反式白藜蘆醇昔，B反式白藜蘆醇，色譜分離條件如正文乙醍液液萃取與5。實(shí)驗(yàn)表明對于紅酒中四種異構(gòu)體液液萃取明顯優(yōu)于固相萃取3.2紅酒預(yù)處理?xiàng)l件優(yōu)化1.液液萃取和固相萃取C18固相萃取柱固相萃取處理紅葡萄酒,以紅葡萄酒為研究對象， 使用乙酸乙酯、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2.液液萃取條件優(yōu)化以紅葡萄酒為研究對象，分別采用乙酸乙酯、乙醍，石油醍為萃取溶劑，按實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行圖5固相萃取法與液液萃取法研究波爾多紅酒中白 藜蘆醇及昔的四種異構(gòu)體萃取效率圖6不同萃取劑對波爾多紅酒中白藜蘆醇及其糖昔 四種異構(gòu)體萃取效率的影響trans-res-glu trans-res cis-res-glu cis-res石油醍PH

11、2 PH3 PH5 PH7 PH9圖7 pH值對波爾多紅酒中四種異構(gòu)體萃取效率的影響本實(shí)驗(yàn)對以乙酸乙酯為萃取劑進(jìn)行液液萃取時pH值進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7 o實(shí)驗(yàn)表明， 隨pH值的變化，除了順式白藜蘆醇外，其余三 種異構(gòu)體的提取率都減少，本實(shí)驗(yàn)選擇pH=2為最佳萃取酸度。3.3虎杖的預(yù)處理?xiàng)l件優(yōu)化本文采用正交設(shè)計法對微波破壁-溶劑提取的方法進(jìn)行優(yōu)化，最終確定了虎杖預(yù)處理的最佳 條件。3.4線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線及最小檢出量在選定的最佳測定條件下，按實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，反式白藜蘆醇及其糖甘、順式白藜蘆醇及其糖甘的峰面積與其含量分別在11110mg/ml , 47.2 472mg/ml , 9.599m

12、g/ml , 32.1192.8mg/ml 范圍里成線性關(guān)系；其標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為 A = 67.1364032 x C - 27.15776、R= 0.99924 , A=48.5681839x C -299.04331、R= 0.9999 , A=37.5594047 x C-76.61838、R=0.99430 , A=20.7779987 x C+158.5657、R=0.99413。在選定的最佳測定條件下，取適量紅葡萄酒，按實(shí)驗(yàn)方法操作，以峰面積定量，平行測定五次，求其標(biāo)準(zhǔn)偏差，標(biāo)準(zhǔn)偏差的 3倍即為方法最小檢出量。其分別為1.02Mg/ml、0.7Mg/ml、1.04Mg/ml、0.45

13、 Mg/ml。3.5回收率實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確吸取 20.00mL12%的乙醇水溶液，分別準(zhǔn)確加入 1.00 mL 42.0 Mg/ml、48.6g/ml反式白藜戶醇在，反式白藜戶醇的標(biāo)樣，按實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以峰面積定量，測得反式白藜戶醇及其糖甘的回收率分別為 94.6%、97.8%。3.6紅葡萄酒中白藜蘆醇及其糖昔的四種異構(gòu)體測定取適量市售不同品牌的紅葡萄酒，用2mol/L的HCl調(diào)其pH值至2,準(zhǔn)確吸取上述試液20.00mL按實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1 o從表中數(shù)據(jù)看來，紅酒中白藜蘆醇甘的含量比白藜蘆醇的含量高，反式白藜蘆醇及甘的含量比其對應(yīng)的順式異構(gòu)體含量高。表1五種不同紅酒中白藜蘆醇及甘四

14、種異構(gòu)體的含量白藜蘆醇甘白藜蘆醇牌子A(十/ml)B (電/ml)合計（電/ml）C (Jg/ml)D (十/ml)合計(Jg/ml)總計(Jg/ml)梅洛紅紅酒（20007.49.717.16.32.79.026.1年）梅洛紅紅酒（20015.72.48.13.32.76.014.1年）女士紅紅酒1.60.211.810.0950.290.3852.20新天瑪納斯干紅1.30.832.130.680.681.363.49波爾多紅酒0.940.861.800.600.431.042.84A反式白藜蘆醇甘，B順式白藜蘆醇甘，C反式白藜蘆醇，D順式白藜蘆醇3.7中草藥虎杖中反式白藜蘆醇及其糖昔的測

15、定準(zhǔn)確稱取20g虎杖試樣，適量水浸泡，除去水分，以一定功率的微波輻照，無水乙醇，水浴 加熱回流，定容，使用0.45收 濾膜過濾，濾液按上述色譜條件分析檢測，以峰面積定量測定反式白藜蘆醇的含量。另準(zhǔn)確稱取20g虎杖試樣，適量水浸泡，除去水分，以一定功率的微波輻照， 無水乙醇，水浴加熱回流。向提取液加入適量的HCl ,繼續(xù)加熱回流。處理后的提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，定容，使用 0.45Mm濾膜過濾，濾液按上述色譜條件分析檢測，以峰面積定量測定反式白藜 蘆醇的含量。水解前中草藥中反式白藜蘆醇甘的含量為0.65%，反式白藜蘆醇的含量為0.12%,水解后反式白藜蘆醇的含量為0.78%。D峋A SNI.M也枷疝W那

16、徵垃 的|圖8未水解的，其余步驟按 2. 5. 1進(jìn)行的虎杖提取液 在鹽酸濃度5%溫度90C水浴加熱回流 1h 的水解條件下水解后的虎杖提取液色譜圖A反式白藜蘆醇昔 ，B反式白藜蘆醇，C順式白藜蘆醇昔 ，D順式白藜蘆醇；色譜條件如正文。本實(shí)驗(yàn)對微波破壁后醇提與傳統(tǒng)提取方法進(jìn)行比較。傳統(tǒng)醇提方法是直接用乙醇提取目標(biāo)物。不經(jīng)微波破壁，直接以水浴加熱，無水乙醇回流1h,提取虎杖中白藜蘆醇，其余按實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行，得到白藜蘆醇的提取率為0.27%，是微波破壁后醇提得到的產(chǎn)率的約1/3。證明經(jīng)過微波破壁，可以明顯改善隨后的溶劑提取的效果。參考文獻(xiàn)1馬亭，李攻科，李曉東等.葡萄酒中白藜蘆醇的固相萃 GCM皴測

17、定及其生理活性的初步研究取.高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報.2 000, 25 (7): 10232鄭妍鵬，李曉東，莫金垣等.非水介質(zhì)毛細(xì)管電泳電導(dǎo)檢測虎杖中的白藜蘆醇.應(yīng)用化學(xué).2 002 ,19 (6): 5853戴蘊(yùn)青，陳雷，韓雅珊等.紅葡萄酒中白藜蘆醇及其糖昔異構(gòu)體的反相hplc分析.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報.2 002 , 7 (1)：144 Malovana S. , Montelongo G. , Perez J.P. , etc. Optimisation of sample preparation for the determination oftrans-resveratrol and othe

18、r polyphenolic compounds in wines by high performance liquid chromatographyJ. Anal.Chim.Acta . 2 001,428: 2455 Dominguez C. , Guillen D.A. , Barroso C.G. , Automated solid-phase extraction for sample preparation followed byhigh-performance liquid chromatography with diode array and mass spectrometri

19、c detection for the analysis of resveratrol derivatives in wine. J.Chromatogr. A. 2 001, 918： 303致謝本文在導(dǎo)師馬志玲副教授的指導(dǎo)下完成，并得到吳京洪老師、鄒世春副教授的大力支持，00級研究生歐陽姍的熱心幫助，特此表示衷心感謝。Determination of isomers of resveratrol and its glucosides by HPLCZeng Wei Ma Zhi Ling*(School of Chemistry and Chemical Engineering, Sun

20、yat-sen University, GZ 510275)Abstract The method for simultaneity determination the isomers of resveratrol and its glucoside with reversed-phase high performance liquid chromatography was studied using Hypersil ODS2 (5 碩 I.D. 4.0mm x 200mm) column, methanol/water as mobile phase for gradient elution, the photodiode array detector at 306nm for trans- resveratrol and glucoside, 288nm for cis- resveratrol and glucoside .A v