蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)ppt課件

1、蛋白質(zhì)分別純化蛋白質(zhì)分別純化2021-3-28蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì) 蛋白質(zhì)分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨蛋白質(zhì)分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側(cè)鏈中某些基團(tuán)，在一定基酸殘基側(cè)鏈中某些基團(tuán)，在一定pH的溶液的溶液中都可解離成帶負(fù)電荷或正電荷的基團(tuán)。中都可解離成帶負(fù)電荷或正電荷的基團(tuán)。 蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)( isoelectric point, pI) 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時，蛋白質(zhì)解離成時，蛋白質(zhì)解離成正、負(fù)離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈正、負(fù)離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時溶液的電荷為零，此時溶液的pH稱為蛋白質(zhì)的

2、等電稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。點(diǎn)。蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì) 蛋白質(zhì)屬于生物大分子之一，分子量范圍可達(dá)蛋白質(zhì)屬于生物大分子之一，分子量范圍可達(dá)1萬至萬至100萬之間，其分子的直徑在萬之間，其分子的直徑在1100 nm，為膠粒范圍之內(nèi)。為膠粒范圍之內(nèi)。 蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的要素蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的要素 顆粒外表電荷雙電層顆粒外表電荷雙電層 水化膜水化膜蛋白質(zhì)分別純化的普通原那蛋白質(zhì)分別純化的普通原那么么 總目的：添加蛋白制品的純度或比活總目的：添加蛋白制品的純度或比活 1.1.前處置前處置(pretreatment)(pretreatment)：因動：因動/ /植物植物/ /細(xì)菌而異細(xì)菌而異 2.2.粗

3、分級分別粗分級分別(rough fractionation)(rough fractionation)：采用鹽析采用鹽析/ /等電點(diǎn)沉淀等電點(diǎn)沉淀/ /有機(jī)溶劑分級分別有機(jī)溶劑分級分別等方法等方法 3.3.細(xì)分級分別細(xì)分級分別(fine frationation)(fine frationation)：采：采用凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析用凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析以及親和層析等以及親和層析等 4.4.結(jié)晶：分別純化的最后步驟結(jié)晶：分別純化的最后步驟蛋白質(zhì)的分別純化方法蛋白質(zhì)的分別純化方法根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的差別分別根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的差別分別透析和超濾透析和超濾根據(jù)蛋白質(zhì)的溶解度差

4、別分別根據(jù)蛋白質(zhì)的溶解度差別分別沉淀、鹽析等沉淀、鹽析等根據(jù)蛋白質(zhì)的電荷差別分別根據(jù)蛋白質(zhì)的電荷差別分別電泳、離子交換等電泳、離子交換等根據(jù)蛋白質(zhì)與某些物質(zhì)的吸附差別根據(jù)蛋白質(zhì)與某些物質(zhì)的吸附差別吸附分別吸附分別利用生物分子專注性結(jié)合的特性利用生物分子專注性結(jié)合的特性親和層析親和層析透析透析dialysis 原理：利用蛋白質(zhì)分子不能經(jīng)過半原理：利用蛋白質(zhì)分子不能經(jīng)過半透而將其與小分子物質(zhì)分開透而將其與小分子物質(zhì)分開 常用的半透膜為玻璃紙或纖維素資常用的半透膜為玻璃紙或纖維素資料料按照分子大小進(jìn)展分別，分別取決于透析按照分子大小進(jìn)展分別，分別取決于透析袋截留的分子量。袋截留的分子量。透析透析只用

5、來除鹽類和小分子只用來除鹽類和小分子雜質(zhì)雜質(zhì)超越濾超越濾ultrafiltrationultrafiltration加壓加壓蛋白質(zhì)溶液蛋白質(zhì)溶液半透膜半透膜支持膜的柵板支持膜的柵板超濾液超濾液原理原理: :是利用壓是利用壓力或離心力，力或離心力，強(qiáng)行使水和其強(qiáng)行使水和其他小分子溶質(zhì)他小分子溶質(zhì)經(jīng)過半透膜，經(jīng)過半透膜，而蛋白質(zhì)留在而蛋白質(zhì)留在半透膜上，以半透膜上，以到達(dá)濃縮和脫到達(dá)濃縮和脫鹽的目的鹽的目的鹽析鹽析(salt precipitation)(salt precipitation) 原理：將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等原理：將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等參與蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)外表電荷參與蛋白

6、質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)外表電荷被中和以及水化膜被破壞，導(dǎo)致蛋白被中和以及水化膜被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀。質(zhì)沉淀。 蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀鹽析鹽析(NH4)2SO4分子在等電點(diǎn)時，相互吸引，聚合沉淀，參與少量分子在等電點(diǎn)時，相互吸引，聚合沉淀，參與少量鹽離子后破壞了這種吸引力，使分子分散，溶于水鹽離子后破壞了這種吸引力，使分子分散，溶于水中中鹽溶鹽溶等電點(diǎn)沉淀和等電點(diǎn)沉淀和pH控制控制 不同蛋白質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)，利用蛋不同蛋白質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)，利用蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時溶解度最低的原理，可白質(zhì)在等電點(diǎn)時溶解度最低的原理，可以把蛋白質(zhì)混合物分開。這樣沉淀出的以把蛋白質(zhì)混合物分開。這樣沉淀出的蛋白質(zhì)堅(jiān)持著

7、天然構(gòu)象，能重新溶解于蛋白質(zhì)堅(jiān)持著天然構(gòu)象，能重新溶解于適當(dāng)?shù)倪m當(dāng)?shù)膒H和一定濃度的鹽溶液中。和一定濃度的鹽溶液中。 有機(jī)溶劑分級分別有機(jī)溶劑分級分別 丙酮、甲醇、乙醇等沉淀丙酮、甲醇、乙醇等沉淀: : 能使蛋能使蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度將低。低白質(zhì)在水溶液中的溶解度將低。低溫零下溫零下40-6040-60度進(jìn)展，丙酮用量度進(jìn)展，丙酮用量普通普通1010倍于蛋白質(zhì)溶液體積。蛋白倍于蛋白質(zhì)溶液體積。蛋白質(zhì)被丙酮沉淀后，應(yīng)立刻分別。質(zhì)被丙酮沉淀后，應(yīng)立刻分別。溫度對蛋白質(zhì)溶解度的影響溫度對蛋白質(zhì)溶解度的影響 在一定溫度范圍內(nèi)，約在一定溫度范圍內(nèi)，約040之間，大部分球狀之間，大部分球狀蛋白質(zhì)的溶解

8、度隨溫度升高而添加，但也有例外，蛋白質(zhì)的溶解度隨溫度升高而添加，但也有例外，如人的血紅蛋白從如人的血紅蛋白從025，溶解度隨溫度上升而將，溶解度隨溫度上升而將低。在低。在4050以上，大部分蛋白量變得不穩(wěn)定并開以上，大部分蛋白量變得不穩(wěn)定并開場變性，普通在中性場變性，普通在中性pH介質(zhì)中即失去溶解力。介質(zhì)中即失去溶解力。 大多數(shù)蛋白質(zhì)在低溫下比較穩(wěn)定，因此蛋白質(zhì)的大多數(shù)蛋白質(zhì)在低溫下比較穩(wěn)定，因此蛋白質(zhì)的分級分別操作普通都在分級分別操作普通都在0或更低的溫度下進(jìn)展?；蚋偷臏囟认逻M(jìn)展。 層析也稱色譜，根本原理是待分別蛋白質(zhì)溶液在層析也稱色譜，根本原理是待分別蛋白質(zhì)溶液在流動相的帶動下經(jīng)過一個固

9、態(tài)物質(zhì)固定相時，根流動相的帶動下經(jīng)過一個固態(tài)物質(zhì)固定相時，根據(jù)溶液中待分別的蛋白質(zhì)顆粒大小、電荷多少及親和據(jù)溶液中待分別的蛋白質(zhì)顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分別的蛋白質(zhì)組分在兩相中反復(fù)分配，并力等，使待分別的蛋白質(zhì)組分在兩相中反復(fù)分配，并以不同速度流經(jīng)固定相而到達(dá)分別蛋白質(zhì)的目的以不同速度流經(jīng)固定相而到達(dá)分別蛋白質(zhì)的目的 。 層析因固相介質(zhì)不同又分為離子交換層析、凝膠層析因固相介質(zhì)不同又分為離子交換層析、凝膠層析和吸附層析等。層析和吸附層析等。層析層析(chromatography)技術(shù)技術(shù)層析的主要設(shè)備層析的主要設(shè)備常見色譜柱常見色譜柱自動分步搜集器自動分步搜集器 將作為固相成分的將作

10、為固相成分的不溶性基質(zhì)，例如葡不溶性基質(zhì)，例如葡聚糖凝膠、纖維素、聚糖凝膠、纖維素、樹脂等填充到柱子中，樹脂等填充到柱子中，用平衡液平衡。用平衡液平衡。 然后加樣品，再用然后加樣品，再用適當(dāng)?shù)娜軇┫疵摗＿m當(dāng)?shù)娜軇┫疵摗?樣品中各種成分經(jīng)樣品中各種成分經(jīng)過柱子取決于與固相過柱子取決于與固相成分的相互作用，最成分的相互作用，最后以不同速率被洗脫后以不同速率被洗脫出來，到達(dá)將各個成出來，到達(dá)將各個成分分別的目的。分分別的目的。 凝膠層析亦稱凝膠過濾、排阻色譜或分子篩凝膠層析亦稱凝膠過濾、排阻色譜或分子篩層析等。其機(jī)理是分子篩效應(yīng)，主要根據(jù)蛋白質(zhì)層析等。其機(jī)理是分子篩效應(yīng)，主要根據(jù)蛋白質(zhì)分子的大小進(jìn)展

11、分別和純化。層析柱中的填料是分子的大小進(jìn)展分別和純化。層析柱中的填料是某些惰性的多孔網(wǎng)狀構(gòu)造物質(zhì)，多是交聯(lián)的聚糖某些惰性的多孔網(wǎng)狀構(gòu)造物質(zhì)，多是交聯(lián)的聚糖( (如葡聚糖或瓊脂糖如葡聚糖或瓊脂糖) )類物質(zhì)，凝膠顆粒在適宜的類物質(zhì)，凝膠顆粒在適宜的溶劑中浸泡，充分吸脹后裝入色譜柱內(nèi)，參與欲溶劑中浸泡，充分吸脹后裝入色譜柱內(nèi)，參與欲分別的混合物后，再以同一溶劑洗脫。因此，混分別的混合物后，再以同一溶劑洗脫。因此，混合樣品好像合樣品好像“過篩一樣，因分子大小的不同得過篩一樣，因分子大小的不同得以彼此分開。以彼此分開。凝膠凝膠gel chromatography 層析層析單個凝膠珠本身象單個凝膠珠本身

12、象“篩子。不同類型凝膠的篩篩子。不同類型凝膠的篩孔的大小不同?？椎拇笮〔煌?。分子量大的物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠粒子內(nèi)部，隨洗分子量大的物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠粒子內(nèi)部，隨洗脫液從凝膠粒子之間的空隙擠落下來，所以大脫液從凝膠粒子之間的空隙擠落下來，所以大分子物質(zhì)遷移速度快；分子物質(zhì)遷移速度快；小分子物質(zhì)要經(jīng)過凝膠網(wǎng)孔進(jìn)入凝膠粒子內(nèi)部，小分子物質(zhì)要經(jīng)過凝膠網(wǎng)孔進(jìn)入凝膠粒子內(nèi)部，所以小分子物質(zhì)遷移速度慢。所以小分子物質(zhì)遷移速度慢。凝膠過濾層析過程表示圖凝膠過濾層析過程表示圖凝膠過濾層析過程表示圖凝膠過濾層析過程表示圖優(yōu)優(yōu) 點(diǎn)點(diǎn)1.1.凝膠是一種不帶電荷的惰性載體。其構(gòu)造穩(wěn)定，凝膠是一種不帶電荷的惰性載體。其構(gòu)造穩(wěn)定

13、，所以凝膠本身不與樣品發(fā)生化學(xué)反響。所以凝膠本身不與樣品發(fā)生化學(xué)反響。 2. 2.凝膠層析的操作條件較溫暖，不易引起生物物凝膠層析的操作條件較溫暖，不易引起生物物質(zhì)的變性，即使用來分別一些理化性質(zhì)不穩(wěn)定的質(zhì)的變性，即使用來分別一些理化性質(zhì)不穩(wěn)定的物質(zhì)也很少被破壞。物質(zhì)也很少被破壞。 3. 3.樣品得率高，反復(fù)性好。假設(shè)按比例擴(kuò)展柱的樣品得率高，反復(fù)性好。假設(shè)按比例擴(kuò)展柱的體積和高度，可進(jìn)展大量樣品的分別純化。體積和高度，可進(jìn)展大量樣品的分別純化。缺缺 點(diǎn)點(diǎn)1.要求樣品和洗脫液的粘度很低。要求樣品和洗脫液的粘度很低。2.凝膠顆粒網(wǎng)絡(luò)孔徑大小非常有限，所以可凝膠顆粒網(wǎng)絡(luò)孔徑大小非常有限，所以可被純

14、化的物質(zhì)的分子量范圍遭到限制。被純化的物質(zhì)的分子量范圍遭到限制。3.凝膠構(gòu)造對某些溶質(zhì)分子具有吸附作用，凝膠構(gòu)造對某些溶質(zhì)分子具有吸附作用，如芳香族化合物與脂蛋白等。如芳香族化合物與脂蛋白等。凝膠的構(gòu)造與性能凝膠的構(gòu)造與性能 凝膠也稱分子篩，是具有三維空間網(wǎng)狀構(gòu)造的凝膠也稱分子篩，是具有三維空間網(wǎng)狀構(gòu)造的物質(zhì)，有天然的，也可人工合成。根據(jù)網(wǎng)孔不物質(zhì)，有天然的，也可人工合成。根據(jù)網(wǎng)孔不同可制成不同規(guī)格。同可制成不同規(guī)格。常用分子篩：常用分子篩：1、葡聚糖凝膠、葡聚糖凝膠Sephadex 型號：型號：G200、 G150、 G100、 G75、 G50、 G25、 G15 分別大蛋白質(zhì)分別大蛋白質(zhì)

15、 小蛋白質(zhì)小蛋白質(zhì) 除除鹽鹽 2、瓊脂糖凝膠瑞典、瓊脂糖凝膠瑞典Sepharose、美國、美國Bio-GelA 孔徑大，用于分別大分子物質(zhì)孔徑大，用于分別大分子物質(zhì) 3、聚丙烯酰胺凝膠、聚丙烯酰胺凝膠 Bio-GelP構(gòu)造：葡聚糖用交聯(lián)劑構(gòu)造：葡聚糖用交聯(lián)劑1-氯氯-2,3-環(huán)丙烷使環(huán)丙烷使葡聚糖之間經(jīng)過醚鍵葡聚糖之間經(jīng)過醚鍵(C-O-CH2-CH-CH2-O-)交聯(lián)聚合而成的交聯(lián)聚合而成的三維空間網(wǎng)狀構(gòu)造。三維空間網(wǎng)狀構(gòu)造。OH葡聚糖凝膠商品名為葡聚糖凝膠商品名為Sephadex Sephadex的三維空間網(wǎng)狀構(gòu)造的網(wǎng)孔大小取決于交的三維空間網(wǎng)狀構(gòu)造的網(wǎng)孔大小取決于交聯(lián)度，交聯(lián)度的大小可在合

16、成聯(lián)度，交聯(lián)度的大小可在合成Sephadex時控制參與時控制參與交聯(lián)劑的百分比決議。交聯(lián)劑的百分比高，交聯(lián)度交聯(lián)劑的百分比決議。交聯(lián)劑的百分比高，交聯(lián)度大，網(wǎng)狀構(gòu)造愈嚴(yán)密，孔隙愈小，吸水后膨脹也愈大，網(wǎng)狀構(gòu)造愈嚴(yán)密，孔隙愈小，吸水后膨脹也愈小，機(jī)械強(qiáng)度高，分別物質(zhì)的分子量也小。反之小，機(jī)械強(qiáng)度高，分別物質(zhì)的分子量也小。反之,交聯(lián)劑的百分比低，分別物質(zhì)的分子量大。交聯(lián)劑的百分比低，分別物質(zhì)的分子量大。G類類Sephadex的型號表示每克干凝膠吸水量，如的型號表示每克干凝膠吸水量，如G-50表示每克干凝膠吸水量為表示每克干凝膠吸水量為5ml。 Sephadex的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不溶于水、鹽、弱酸和的

17、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不溶于水、鹽、弱酸和堿，耐熱耐堿不耐酸。堿，耐熱耐堿不耐酸。葡聚糖凝膠特點(diǎn)葡聚糖凝膠特點(diǎn) 它是一種大孔凝膠，其任務(wù)范圍的下它是一種大孔凝膠，其任務(wù)范圍的下限幾乎是限幾乎是Sephadex的上限，可分別的上限，可分別MW40萬以上的物質(zhì)，因此可用來分別核酸及病萬以上的物質(zhì)，因此可用來分別核酸及病毒。毒。 瓊脂糖凝膠不帶電荷，不受微生物作瓊脂糖凝膠不帶電荷，不受微生物作用而降解，但對熱不穩(wěn)定，易受用而降解，但對熱不穩(wěn)定，易受pH影響影響(只只在在pH4.5-9.0范圍內(nèi)穩(wěn)定。范圍內(nèi)穩(wěn)定。瓊脂糖凝膠商品名為瓊脂糖凝膠商品名為Sepharose) 運(yùn)用范圍及效果同葡聚糖凝膠類似，運(yùn)用范圍

18、及效果同葡聚糖凝膠類似，但化學(xué)性質(zhì)較葡聚糖穩(wěn)定，可在但化學(xué)性質(zhì)較葡聚糖穩(wěn)定，可在pH 2-11范圍內(nèi)運(yùn)用范圍內(nèi)運(yùn)用. 聚丙烯酰胺凝膠的商品為生物膠聚丙烯酰胺凝膠的商品為生物膠-PBio-Gel P，由美國，由美國Bio-Rod廠消費(fèi)，廠消費(fèi)，型號很多，從型號很多，從P-2至至P-300共共10種，種，P后面后面的數(shù)字再乘的數(shù)字再乘1000就相當(dāng)于該凝膠的排阻就相當(dāng)于該凝膠的排阻限制。限制。 聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠 選擇何種凝膠以及它的型號，這需選擇何種凝膠以及它的型號，這需求根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件，溶質(zhì)的分子量大小和求根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件，溶質(zhì)的分子量大小和分別任務(wù)的目的而定，每種型號凝膠都分別任務(wù)的目的

19、而定，每種型號凝膠都有一定分別溶質(zhì)分子量的范圍，選擇的有一定分別溶質(zhì)分子量的范圍，選擇的型號凝膠要能滿足實(shí)驗(yàn)要求。型號凝膠要能滿足實(shí)驗(yàn)要求。凝膠的選擇凝膠的選擇凝膠的排阻極限凝膠的排阻極限 排阻極限是指不能進(jìn)入凝膠顆?？籽▋?nèi)部的最排阻極限是指不能進(jìn)入凝膠顆?？籽▋?nèi)部的最小分子的分子量。一切大于排阻極限的分子都小分子的分子量。一切大于排阻極限的分子都不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，直接從凝膠顆粒外流不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，直接從凝膠顆粒外流出，所以它們同時被最先洗脫出來。出，所以它們同時被最先洗脫出來。 排阻極限代表一種凝膠能有效分別的最大分子排阻極限代表一種凝膠能有效分別的最大分子量，大于這種凝膠的排阻極

20、限的分子用這種凝量，大于這種凝膠的排阻極限的分子用這種凝膠不能得到有效分別。例如膠不能得到有效分別。例如Sephadex G-50的的排阻極限為排阻極限為30,000，它表示分子量大于，它表示分子量大于30,000的分子都將直接從凝膠顆粒之外被洗脫出來。的分子都將直接從凝膠顆粒之外被洗脫出來。2003年中科院考研題年中科院考研題 今有今有a a、b b、c c、d d四種蛋白質(zhì)，其分子體積由大四種蛋白質(zhì)，其分子體積由大到小的順序是到小的順序是abcdabcd，在凝膠過濾柱層析中，在凝膠過濾柱層析中，最先洗脫出來的蛋白質(zhì)普通應(yīng)該是最先洗脫出來的蛋白質(zhì)普通應(yīng)該是 A A、a a B B、b b C

21、 C、c c D D、d d2000年中科院考研題年中科院考研題2003年上海師范大學(xué)考研題年上海師范大學(xué)考研題 指出從分子排阻層析柱上洗脫下來以下蛋白質(zhì)指出從分子排阻層析柱上洗脫下來以下蛋白質(zhì)時的洗脫順序，為什么？分別蛋白質(zhì)的范圍是時的洗脫順序，為什么？分別蛋白質(zhì)的范圍是5,000-400,0005,000-400,000。 肌紅蛋白馬心肌肌紅蛋白馬心肌 1690016900 過氧化氫酶馬肝過氧化氫酶馬肝 247500247500 細(xì)胞色素細(xì)胞色素c c牛心肌牛心肌 1337013370 肌球蛋白鱈魚肌肌球蛋白鱈魚肌 524800524800 糜蛋白酶原牛胰糜蛋白酶原牛胰 232402324

22、0 血清清蛋白人血清清蛋白人 6850068500 假設(shè)被分別的蛋白質(zhì)樣品中各個成分受溶液假設(shè)被分別的蛋白質(zhì)樣品中各個成分受溶液pH的影響，或帶正電荷或帶負(fù)電荷，因此可利用離子的影響，或帶正電荷或帶負(fù)電荷，因此可利用離子交換層析法進(jìn)展分別。交換層析法進(jìn)展分別。 離子交換層析的固相是離子交換體，包括離子交離子交換層析的固相是離子交換體，包括離子交換樹脂、離子交換纖維素、離子交換葡聚糖。換樹脂、離子交換纖維素、離子交換葡聚糖。 帶有帶有SO3或或COO基團(tuán)，通常以基團(tuán)，通常以SO3Na 或或COOH方式出現(xiàn)的叫做陽離子交換基；方式出現(xiàn)的叫做陽離子交換基； 帶有帶有N(C2H5)基團(tuán)通常以基團(tuán)通常以

23、N(C2H5) Cl出現(xiàn)出現(xiàn)的叫做陰離子交換基。的叫做陰離子交換基。離子交換層析離子交換層析(ion exchange chromatography)陽離子交換基陽離子交換基強(qiáng)酸性，聚苯乙烯樹脂強(qiáng)酸性，聚苯乙烯樹脂弱酸性，羧甲基纖維素弱酸性，羧甲基纖維素弱酸性，螯協(xié)作用，聚苯乙烯樹脂弱酸性，螯協(xié)作用，聚苯乙烯樹脂陰離子交換基陰離子交換基強(qiáng)堿性，聚苯乙烯樹脂強(qiáng)堿性，聚苯乙烯樹脂弱堿性，二乙氨氨乙基纖維素弱堿性，二乙氨氨乙基纖維素陽陽離離子子交交換換層層析析過過程程離子交離子交換樹脂換樹脂蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)高離子高離子強(qiáng)度洗強(qiáng)度洗脫液洗脫液洗高離子高離子強(qiáng)度洗強(qiáng)度洗脫液洗脫液洗加加樣樣平平衡衡液液洗洗搜

24、集搜集1998年上海交大考研題年上海交大考研題 有一蛋白水解物，在有一蛋白水解物，在pH6時，用陽離子時，用陽離子交換柱層析，第一個被洗脫出來的氨基交換柱層析，第一個被洗脫出來的氨基酸是：酸是： Val (pI=5.96), Lys (pI=9.74) Asp (pI=2.77), Arg (pI=10.76) Tyr (pI=5.66)是一種吸附層析，依賴于蛋白質(zhì)和它的配體ligand之間的相互作用來分別的。配體通常指的是能與另一個分子或原子結(jié)合普通是非共價結(jié)合的分子、基團(tuán)、離子、或原子。但在親和層析中，配體是經(jīng)過共價鍵先與基質(zhì)結(jié)合，配體可以是酶結(jié)合的一個反響物或產(chǎn)物，或是一種可以識別靶蛋白

25、的抗體。親和層析親和層析(Affinity chromatography) 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)混合物經(jīng)過裝有銜接了配體的基質(zhì)的當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)混合物經(jīng)過裝有銜接了配體的基質(zhì)的親和層析柱時，只需靶蛋白可以特異地與基質(zhì)親和層析柱時，只需靶蛋白可以特異地與基質(zhì)結(jié)合，而其它沒有結(jié)合的蛋白質(zhì)首先被洗脫下結(jié)合，而其它沒有結(jié)合的蛋白質(zhì)首先被洗脫下來。特異結(jié)合在基質(zhì)上的靶蛋白最后可以用含來。特異結(jié)合在基質(zhì)上的靶蛋白最后可以用含有高濃度自在配體的溶劑洗下。所以有時只用有高濃度自在配體的溶劑洗下。所以有時只用親和層析就可使蛋白質(zhì)的純化提高親和層析就可使蛋白質(zhì)的純化提高10001000至至1000010000倍。倍。原原 理理親和層

26、析過程親和層析過程吸附本質(zhì)：非共價銜接吸附本質(zhì)：非共價銜接常用吸附劑：結(jié)晶磷酸鈣、硅膠等常用吸附劑：結(jié)晶磷酸鈣、硅膠等脫附洗脫方式：脫附洗脫方式： 1、改動蛋白質(zhì)帶電形狀；、改動蛋白質(zhì)帶電形狀； 2、改動環(huán)境溶液的、改動環(huán)境溶液的pH、離子強(qiáng)度等。、離子強(qiáng)度等。含配體溶液含配體溶液搜集目的蛋白搜集目的蛋白 洗下未結(jié)合的蛋白洗下未結(jié)合的蛋白混合蛋白混合蛋白樣品樣品平衡液平衡液帶有配體的樹脂帶有配體的樹脂珠或膠粒珠或膠粒優(yōu)優(yōu) 點(diǎn)點(diǎn) 親和層析純化過程簡單、迅速，且分別效親和層析純化過程簡單、迅速，且分別效率高。對分別含量極少又不穩(wěn)定的活性物率高。對分別含量極少又不穩(wěn)定的活性物質(zhì)尤為有效。但本法必需針

27、對某一分別對質(zhì)尤為有效。但本法必需針對某一分別對象，制備專注的配基和尋求層析的穩(wěn)定條象，制備專注的配基和尋求層析的穩(wěn)定條件，因此親和層析的運(yùn)用范圍遭到了一定件，因此親和層析的運(yùn)用范圍遭到了一定的限制。的限制。分配層析分配層析 柱層析柱層析 紙層析紙層析 薄層層析薄層層析氣相色譜氣相色譜(gas chromatograph, GC) 是利用樣品中個組分在色譜柱中的氣相和固定相間是利用樣品中個組分在色譜柱中的氣相和固定相間的分配系數(shù)不同到達(dá)分別的目的。的分配系數(shù)不同到達(dá)分別的目的。 當(dāng)汽化后的樣品被載氣帶入色譜柱中運(yùn)轉(zhuǎn)時，組分當(dāng)汽化后的樣品被載氣帶入色譜柱中運(yùn)轉(zhuǎn)時，組分就在其中的兩相間進(jìn)展反復(fù)多次

28、的分配吸附脫就在其中的兩相間進(jìn)展反復(fù)多次的分配吸附脫附放出由于固定相對各種組分的吸附才干不同，附放出由于固定相對各種組分的吸附才干不同，各組份在色譜柱中的運(yùn)轉(zhuǎn)速度就不同，經(jīng)過一定的各組份在色譜柱中的運(yùn)轉(zhuǎn)速度就不同，經(jīng)過一定的柱長后，便彼此分別，按順序分開色譜柱進(jìn)入檢測柱長后，便彼此分別，按順序分開色譜柱進(jìn)入檢測器，產(chǎn)生的離子流信號經(jīng)放大后，在記錄器上描畫器，產(chǎn)生的離子流信號經(jīng)放大后，在記錄器上描畫出各組分的色譜峰。出各組分的色譜峰。氣相色譜分類氣相色譜分類 GC根據(jù)固定相不同又可分為氣固色譜法根據(jù)固定相不同又可分為氣固色譜法(GSC)和和氣液色譜法氣液色譜法(GLC)，其中以，其中以GLC運(yùn)用

29、最廣。液相運(yùn)用最廣。液相色譜法適用于分別低揮發(fā)性或非揮發(fā)性、熱穩(wěn)定色譜法適用于分別低揮發(fā)性或非揮發(fā)性、熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)。當(dāng)層析系統(tǒng)的流動相為氣體如氫、性差的物質(zhì)。當(dāng)層析系統(tǒng)的流動相為氣體如氫、氦、氮，固相為涂漬在固體顆粒外表的液體時，氦、氮，固相為涂漬在固體顆粒外表的液體時，此層析技術(shù)稱為氣液層析或氣液色譜此層析技術(shù)稱為氣液層析或氣液色譜氣相色譜法的特點(diǎn)氣相色譜法的特點(diǎn)運(yùn)用范圍廣：氣候色譜法可以分析氣體和易揮發(fā)的運(yùn)用范圍廣：氣候色譜法可以分析氣體和易揮發(fā)的物質(zhì)物質(zhì)高效：可以分析沸點(diǎn)非常相近的組分，和極為復(fù)高效：可以分析沸點(diǎn)非常相近的組分，和極為復(fù)雜的多組份混合物。例如，用毛細(xì)管，可以分析雜的多

30、組份混合物。例如，用毛細(xì)管，可以分析輕油中輕油中150150個組份。個組份。高選擇性：是指固定相對性質(zhì)極為類似的組份，好高選擇性：是指固定相對性質(zhì)極為類似的組份，好像位素，烴類的異構(gòu)體等有較強(qiáng)的分別才干。主要像位素，烴類的異構(gòu)體等有較強(qiáng)的分別才干。主要經(jīng)過選用高選擇性的固定液。經(jīng)過選用高選擇性的固定液。高靈敏度：指用高靈敏度的檢測器可檢測出高靈敏度：指用高靈敏度的檢測器可檢測出10-1110-1110-1310-13克的物質(zhì)。因此可用于痕量分析。克的物質(zhì)。因此可用于痕量分析。高速：普通分析一次用幾分鐘到十幾分鐘。某些快高速：普通分析一次用幾分鐘到十幾分鐘。某些快速分析中，一秒鐘可以分析假設(shè)干份

31、。色譜法易于速分析中，一秒鐘可以分析假設(shè)干份。色譜法易于自動化操作與處置都自動化，速度很快。自動化操作與處置都自動化，速度很快。液相色譜液相色譜 (liquid chromatograph, LC) LC同樣可分為液固色譜法同樣可分為液固色譜法(LSC)和液液色譜法和液液色譜法(LLC)。此外還有超臨界流體色譜法。此外還有超臨界流體色譜法(SFC)，它，它以超臨界流體界于氣體和液體之間的一種物以超臨界流體界于氣體和液體之間的一種物相為流動相常用相為流動相常用CO2，因其分散系數(shù)大，因其分散系數(shù)大，能很快到達(dá)平衡，故分析時間短，特別適用于能很快到達(dá)平衡，故分析時間短，特別適用于手性化合物的拆分。

32、手性化合物的拆分。 高效液相色譜法高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC) 也稱高壓液相層析也稱高壓液相層析high pressure liquid chromatography。這是近二十年內(nèi)開展起來。這是近二十年內(nèi)開展起來的一項(xiàng)快速、靈敏、高效的分別技術(shù)。它是在的一項(xiàng)快速、靈敏、高效的分別技術(shù)。它是在經(jīng)典液相層析法根底上，引進(jìn)了氣相層析的實(shí)經(jīng)典液相層析法根底上，引進(jìn)了氣相層析的實(shí)際，利用高壓保送流動相，擁有高效固定相及際，利用高壓保送流動相，擁有高效固定相及高靈敏度檢測器，具有氣相層析的全部優(yōu)點(diǎn)。高靈敏度檢測器，具有氣相層析

33、的全部優(yōu)點(diǎn)。 原原 理理 混合物中各組分在固定相和流動相之間會發(fā)生吸附、溶解或其他親和作用，這種作用存在差別，從而使各組分在色譜柱中的遷移速度不同得到分別高效液相色譜的主要類型高效液相色譜的主要類型按分別機(jī)制的不同分為四類：按分別機(jī)制的不同分為四類：液液分配色譜法液液分配色譜法partition chromatography液固吸附色譜法液固吸附色譜法adsorption chromatography離子交換色譜法離子交換色譜法IEC空間排阻色譜法空間排阻色譜法SEC液固吸附色譜法液固吸附色譜法固定相：吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度固定相：吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度5-10m流動相：有機(jī)溶劑流動相

34、：有機(jī)溶劑適用于分別分子量適用于分別分子量200-1000的組分，大多數(shù)用于的組分，大多數(shù)用于非離子型化合物的分別，常用于分別同分異構(gòu)體。非離子型化合物的分別，常用于分別同分異構(gòu)體。各組分的出峰順序各組分的出峰順序 極性較小組分，吸附力較弱，容易解吸，先流出。極性較小組分，吸附力較弱，容易解吸，先流出。 極性較大組分滯留作用大，后流出。極性較大組分滯留作用大，后流出。 飽和烴飽和烴 烯烯 芳烴芳烴 醚醚 醛酮醛酮 pI 蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，電泳中向正極挪動蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，電泳中向正極挪動 pHpI 蛋白質(zhì)帶正電荷，電泳中向負(fù)極挪動蛋白質(zhì)帶正電荷，電泳中向負(fù)極挪動 pH=pI 蛋白質(zhì)凈電荷為零，電泳

35、中不動蛋白質(zhì)凈電荷為零，電泳中不動聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 支持物:單體丙稀酰胺(Acr) 交聯(lián)劑:甲叉(or亞甲)雙丙稀酰胺(Bis) 聚合 1、光聚合:核黃素為催化劑(陽光,日光) 制大孔膠 2、化學(xué)聚合: 過硫酸銨(NH4)2S2O3，縮寫為APS為催化劑 N,N,N,N,-四甲基乙二胺 縮寫為TEMED是加速劑用來制小孔膠聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 凝膠網(wǎng)孔大?。耗z網(wǎng)孔大?。?聚合鏈長度聚合鏈長度:由由Acr濃度決議濃度決議 交聯(lián)程度交聯(lián)程度:由由Acr與與Bis相對比例決議相對比例決議 Bis的濃度低，孔徑大，可在聚合前調(diào)理單的濃度低，孔徑大，可在聚合前調(diào)理單

36、體與體與Bis的濃度比的濃度比 如如: Acr Bis T(%) 小孔小孔 28.0g 0.735g 7% 大孔大孔 10.0g 2.5g 2.5%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 SDS-聚丙烯酰胺凝聚丙烯酰胺凝膠電泳膠電泳SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE： 常用于蛋白質(zhì)分常用于蛋白質(zhì)分 子子量的測定。量的測定。SDS 十二烷基磺酸鈉十二烷基磺酸鈉 SDS十二烷基磺酸鈉是一種陰離子型外表十二烷基磺酸鈉是一種陰離子型外表活性劑，它可以與蛋白質(zhì)多肽鏈中的氨基酸殘活性劑，它可以與蛋白質(zhì)多肽鏈中的氨基酸殘基按大約基按大約1 1

37、.4比例結(jié)合。比例結(jié)合。 每一個蛋白質(zhì)分子都由于結(jié)合了許多的每一個蛋白質(zhì)分子都由于結(jié)合了許多的SDS而而帶有大量的負(fù)電荷，而蛋白質(zhì)分子原有的電荷帶有大量的負(fù)電荷，而蛋白質(zhì)分子原有的電荷那么可以忽略。該法主要利用了蛋白質(zhì)分子量那么可以忽略。該法主要利用了蛋白質(zhì)分子量大小不同而分別蛋白質(zhì)。大小不同而分別蛋白質(zhì)。 用知分子量的蛋白質(zhì)作為規(guī)范，那么可以估算用知分子量的蛋白質(zhì)作為規(guī)范，那么可以估算出不同蛋白質(zhì)的分子量。出不同蛋白質(zhì)的分子量。作業(yè)：作業(yè)：1997年清華大學(xué)考研題年清華大學(xué)考研題 有兩個純的蛋白質(zhì)有兩個純的蛋白質(zhì)a和和b，相對分子質(zhì)量都是，相對分子質(zhì)量都是100000的近似球形的蛋白質(zhì)。的近

38、似球形的蛋白質(zhì)。 其中，蛋白質(zhì)其中，蛋白質(zhì)a：由：由2個相對分子質(zhì)量為個相對分子質(zhì)量為40000的亞的亞基和基和2個相對分子質(zhì)量為個相對分子質(zhì)量為10000的亞基組成的四聚的亞基組成的四聚體，該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)體，該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)pI=6.0。 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)b：由相對分子質(zhì)量為：由相對分子質(zhì)量為25000的單一亞基組的單一亞基組成的四聚體，該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)也是成的四聚體，該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)也是pI=6.0。 試預(yù)測這兩種蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)試預(yù)測這兩種蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)和和SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)中的電泳結(jié)果。聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)中的電泳結(jié)果。等電聚焦電泳等電聚焦電泳i

39、soelectric focusing electrophoresis, IEFE 利器具有利器具有pHpH梯度的支持介質(zhì)分別等點(diǎn)電不梯度的支持介質(zhì)分別等點(diǎn)電不同的蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)。同的蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)。pHpH梯度是以兩性梯度是以兩性電解質(zhì)在外電場作用下自然構(gòu)成。電解質(zhì)在外電場作用下自然構(gòu)成。原原 理理 等電聚焦就是在電泳介質(zhì)中放入載體兩性等電聚焦就是在電泳介質(zhì)中放入載體兩性電解質(zhì)，當(dāng)通以直流電時，兩性電解質(zhì)即電解質(zhì)，當(dāng)通以直流電時，兩性電解質(zhì)即構(gòu)成一個由陽極到陰極逐漸添加的構(gòu)成一個由陽極到陰極逐漸添加的pH梯度，梯度，在此體系中，不同的蛋白質(zhì)即挪動到或聚在此體系中，不同的蛋白質(zhì)即挪動到或聚

40、焦于其相當(dāng)?shù)牡入婞c(diǎn)位置上，也就是說被焦于其相當(dāng)?shù)牡入婞c(diǎn)位置上，也就是說被聚焦于一個狹的區(qū)帶中，電泳技術(shù)中的等聚焦于一個狹的區(qū)帶中，電泳技術(shù)中的等電點(diǎn)聚焦也稱為聚焦電泳。電點(diǎn)聚焦也稱為聚焦電泳。pH梯度的建立梯度的建立 用多種兩性電解質(zhì)混合物建立穩(wěn)定良好的用多種兩性電解質(zhì)混合物建立穩(wěn)定良好的pH梯度梯度 本質(zhì)：一系列脂肪族多氨基、多羧酸同系本質(zhì)：一系列脂肪族多氨基、多羧酸同系物和異構(gòu)體，具有很多既不一樣又非常接近相物和異構(gòu)體，具有很多既不一樣又非常接近相互銜接的互銜接的pI值。值。 pH范圍：范圍：pH310pH梯度的構(gòu)成梯度的構(gòu)成 載體兩性電解質(zhì)是一系列不同分載體兩性電解質(zhì)是一系列不同分子的兩

41、性電解質(zhì)的混合物，在通電子的兩性電解質(zhì)的混合物，在通電后，它們各自遷移到適當(dāng)位置構(gòu)成后，它們各自遷移到適當(dāng)位置構(gòu)成一個延續(xù)的一個延續(xù)的pHpH梯度。梯度。一切的載體兩性電解一切的載體兩性電解質(zhì)分子都帶電荷，只質(zhì)分子都帶電荷，只是溶液中正電荷和負(fù)是溶液中正電荷和負(fù)電荷的基團(tuán)數(shù)目相等，電荷的基團(tuán)數(shù)目相等，凈電荷為零。凈電荷為零。沒通電時的變化沒通電時的變化引入電場時的變化引入電場時的變化 載體兩性電解質(zhì)分子將載體兩性電解質(zhì)分子將向陰極或陽極遷移，等電點(diǎn)向陰極或陽極遷移，等電點(diǎn)最低的分子負(fù)電荷最多的最低的分子負(fù)電荷最多的將最快地向陽極遷移。當(dāng)它將最快地向陽極遷移。當(dāng)它到達(dá)凈電荷是零的位置時才到達(dá)凈電

42、荷是零的位置時才停頓。停頓。 其次一些低其次一些低pI的載體兩的載體兩性電解質(zhì)分子負(fù)電荷比較性電解質(zhì)分子負(fù)電荷比較多的也將向陽極挪動，直多的也將向陽極挪動，直到它的凈電荷被減少到零才到它的凈電荷被減少到零才停頓。停頓。電泳終了后的變化電泳終了后的變化一切的載體兩性電解一切的載體兩性電解質(zhì)分子以添加質(zhì)分子以添加pI級數(shù)級數(shù)的方法將分別在陽、的方法將分別在陽、陰極之間到達(dá)它們本陰極之間到達(dá)它們本人的位置而給出一個人的位置而給出一個pI梯度。梯度。載體兩性電解質(zhì)載體兩性電解質(zhì)ampholyte，商，商品名為品名為ampholine 早期的早期的IFE方法用的是載體兩性電解質(zhì)方法用的是載體兩性電解質(zhì)p

43、H梯度梯度聚丙烯酰胺管狀膠。載體兩性電解質(zhì)是兩性小聚丙烯酰胺管狀膠。載體兩性電解質(zhì)是兩性小分子，當(dāng)電壓經(jīng)過含有這些分子的混合物時，分子，當(dāng)電壓經(jīng)過含有這些分子的混合物時，載體兩性電解質(zhì)按照其載體兩性電解質(zhì)按照其pI排成一線，可使凝膠排成一線，可使凝膠構(gòu)成延續(xù)的構(gòu)成延續(xù)的pH梯度。梯度。 理想的兩性電解質(zhì)載體應(yīng)在理想的兩性電解質(zhì)載體應(yīng)在pI處有足夠的緩沖處有足夠的緩沖才干及電導(dǎo)，保證才干及電導(dǎo)，保證pH梯度的穩(wěn)定和允許一定的梯度的穩(wěn)定和允許一定的電流經(jīng)過。電流經(jīng)過。 載體兩性電解質(zhì)的局限性載體兩性電解質(zhì)的局限性 1、不是明確定義上的分子混合物。在消費(fèi)加、不是明確定義上的分子混合物。在消費(fèi)加工方面

44、，不同批次之間產(chǎn)品有很大變化，影響工方面，不同批次之間產(chǎn)品有很大變化，影響分別的反復(fù)性。分別的反復(fù)性。 2、pH梯度不穩(wěn)定，隨時間的推移有向陰極漂梯度不穩(wěn)定，隨時間的推移有向陰極漂移的趨勢。過酸過堿的蛋白質(zhì)較難分別。移的趨勢。過酸過堿的蛋白質(zhì)較難分別。 3、軟的丙烯酰胺管膠的操作非常困難，由于、軟的丙烯酰胺管膠的操作非常困難，由于膠容易被伸長或斷裂，引起分別結(jié)果之間的變膠容易被伸長或斷裂，引起分別結(jié)果之間的變化。化。IEFE的改良的改良 1982年，年，Bjellqvist等提出了固相化等提出了固相化pH梯度梯度immobilized pH gradients, IPG 方法：經(jīng)過在灌膠時將丙

45、烯酰胺緩沖液中方法：經(jīng)過在灌膠時將丙烯酰胺緩沖液中加到聚丙烯酰胺凝膠中來產(chǎn)生加到聚丙烯酰胺凝膠中來產(chǎn)生pH梯度。在梯度。在聚合過程中，緩沖液中的丙烯酰胺部分和聚合過程中，緩沖液中的丙烯酰胺部分和丙烯酰胺及亞甲基雙丙烯酰胺單體一同共丙烯酰胺及亞甲基雙丙烯酰胺單體一同共聚合構(gòu)成聚丙烯酰胺凝膠。聚合構(gòu)成聚丙烯酰胺凝膠。固相化固相化pH梯度凝膠梯度凝膠(IPG)的優(yōu)點(diǎn)的優(yōu)點(diǎn) 1、防止陰極漂移：因、防止陰極漂移：因pH梯度是共價固定于梯度是共價固定于凝膠內(nèi)部的，具有更寬的凝膠內(nèi)部的，具有更寬的pH分別范圍，使分別范圍，使過酸過堿的蛋白質(zhì)得到分別過酸過堿的蛋白質(zhì)得到分別 2、具有更高的負(fù)載蛋白質(zhì)的才干、具

46、有更高的負(fù)載蛋白質(zhì)的才干 3、消費(fèi)上反復(fù)性好、消費(fèi)上反復(fù)性好雙向電泳雙向電泳(two-dimensional electrophoresis, 2DE) 最早是由最早是由Smithies和和Poulik提出，蛋白質(zhì)第一向提出，蛋白質(zhì)第一向根據(jù)其自在遷移率，在濾紙條上進(jìn)展的；第二向根據(jù)其自在遷移率，在濾紙條上進(jìn)展的；第二向電泳方向與第一向垂直，在淀粉膠上進(jìn)展。電泳方向與第一向垂直，在淀粉膠上進(jìn)展。 隨著聚丙烯酰胺凝膠的發(fā)明，雙向電泳支持介質(zhì)隨著聚丙烯酰胺凝膠的發(fā)明，雙向電泳支持介質(zhì)逐漸轉(zhuǎn)向聚丙烯酰胺凝膠，即雙向凝膠電泳。逐漸轉(zhuǎn)向聚丙烯酰胺凝膠，即雙向凝膠電泳。 雙向凝膠電泳雙向凝膠電泳 雙向凝膠

47、電泳是一種由恣意兩個單向凝膠電雙向凝膠電泳是一種由恣意兩個單向凝膠電泳組合而成的，即在第一向電泳后再在與第泳組合而成的，即在第一向電泳后再在與第一向垂直的方向上進(jìn)展第二向電泳。一向垂直的方向上進(jìn)展第二向電泳。 該技術(shù)結(jié)合了根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)進(jìn)展分別的該技術(shù)結(jié)合了根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)進(jìn)展分別的等電聚焦技術(shù)以及根據(jù)蛋白質(zhì)的大小進(jìn)展分等電聚焦技術(shù)以及根據(jù)蛋白質(zhì)的大小進(jìn)展分別的別的SDS-PAGE電泳技術(shù)。這兩項(xiàng)技術(shù)結(jié)合電泳技術(shù)。這兩項(xiàng)技術(shù)結(jié)合構(gòu)成的二維電泳是分別分析蛋白質(zhì)最有效的構(gòu)成的二維電泳是分別分析蛋白質(zhì)最有效的一種電泳手段。一種電泳手段。 2DE儀器系統(tǒng)恒溫水浴垂直板電泳儀第二向電源等電聚焦儀第一向

48、目前，第一向等電聚焦電泳普遍采用預(yù)目前，第一向等電聚焦電泳普遍采用預(yù)制的固定制的固定pH梯度膠條梯度膠條(immobilized pH gradient strips, IPG strips)。商品化的。商品化的IPG strips可以從可以從Amersham Pharmacia公司或公司或BioRad公司購買。公司購買。圖像分析圖像分析在用雙向電泳進(jìn)展差別表達(dá)蛋白質(zhì)組分析在用雙向電泳進(jìn)展差別表達(dá)蛋白質(zhì)組分析時，需求利用軟件對產(chǎn)生的時，需求利用軟件對產(chǎn)生的2D膠進(jìn)展差別膠進(jìn)展差別分析，以尋覓差別表達(dá)蛋白。常用的軟件分析，以尋覓差別表達(dá)蛋白。常用的軟件如安瑪西亞公司的如安瑪西亞公司的Image

49、Master 2D Elite或或Image Master 2D Planium分析軟件。分析軟件。圖像分析圖像分析在用雙向電泳進(jìn)展差別表達(dá)蛋白質(zhì)組分析在用雙向電泳進(jìn)展差別表達(dá)蛋白質(zhì)組分析時，需求利用軟件對產(chǎn)生的時，需求利用軟件對產(chǎn)生的2D膠進(jìn)展差別膠進(jìn)展差別分析，以尋覓差別表達(dá)蛋白。常用的軟件分析，以尋覓差別表達(dá)蛋白。常用的軟件如安瑪西亞公司的如安瑪西亞公司的Image Master 2D Elite或或Image Master 2D Planium分析軟件。分析軟件。離心技術(shù)離心技術(shù) 離心是利用物體高速旋轉(zhuǎn)時產(chǎn)生強(qiáng)大的離心是利用物體高速旋轉(zhuǎn)時產(chǎn)生強(qiáng)大的離心力，使置于該旋轉(zhuǎn)體中的懸浮顆粒離心

50、力，使置于該旋轉(zhuǎn)體中的懸浮顆粒發(fā)生沉降或漂浮，從而使某些顆粒到達(dá)發(fā)生沉降或漂浮，從而使某些顆粒到達(dá)濃縮或與其他顆粒分別之目的。離心機(jī)濃縮或與其他顆粒分別之目的。離心機(jī)的種類繁多，用途各異。的種類繁多，用途各異。 離心技術(shù)的原理離心技術(shù)的原理 將處于懸浮形狀的細(xì)胞、細(xì)胞器、病毒和生物將處于懸浮形狀的細(xì)胞、細(xì)胞器、病毒和生物大分子等稱為大分子等稱為“顆粒。每個顆粒都有一定大顆粒。每個顆粒都有一定大小、外形、密度和質(zhì)量。當(dāng)離心機(jī)轉(zhuǎn)子高速旋小、外形、密度和質(zhì)量。當(dāng)離心機(jī)轉(zhuǎn)子高速旋轉(zhuǎn)時這些顆粒在介質(zhì)中發(fā)生沉降或漂浮，它的轉(zhuǎn)時這些顆粒在介質(zhì)中發(fā)生沉降或漂浮，它的沉降速度與作用在顆粒上的力的大小和力的方沉降

51、速度與作用在顆粒上的力的大小和力的方向有關(guān)。向有關(guān)。 沉降系數(shù)沉降系數(shù) 沉降系數(shù)為顆粒在單位離心力場作用下的沉降速沉降系數(shù)為顆粒在單位離心力場作用下的沉降速度，是度，是1924年年Svedberg提出的。沉降系數(shù)的物理提出的。沉降系數(shù)的物理意義是顆粒在離心力作用下從靜止形狀到達(dá)極限意義是顆粒在離心力作用下從靜止形狀到達(dá)極限速度所經(jīng)過的時間。沉降系數(shù)的單位用速度所經(jīng)過的時間。沉降系數(shù)的單位用Svedberg表示，單位為秒，表示，單位為秒，1 Svedberg10-13秒，簡稱秒，簡稱S。S常用來近似描畫生物大分子的大小，蛋白質(zhì)、常用來近似描畫生物大分子的大小，蛋白質(zhì)、核酸、核糖體和病毒的沉降系數(shù)

52、介于核酸、核糖體和病毒的沉降系數(shù)介于110-13到到20010-13S范圍，如人的范圍，如人的Hb沉降系數(shù)為沉降系數(shù)為4.46S，即為即為4.4610-13S。 相對離心力相對離心力 相對離心力相對離心力(RCF)是指在離心力場中，作用于是指在離心力場中，作用于顆粒的離心力相當(dāng)于地球引力的倍數(shù)。普通情顆粒的離心力相當(dāng)于地球引力的倍數(shù)。普通情況下，低速離心時常以況下，低速離心時常以rpm來表示，超速離心來表示，超速離心那么以那么以g表示。計(jì)算顆粒的相對離心力時，應(yīng)表示。計(jì)算顆粒的相對離心力時，應(yīng)留意離心管與旋轉(zhuǎn)中心的間隔留意離心管與旋轉(zhuǎn)中心的間隔R。由于轉(zhuǎn)子的。由于轉(zhuǎn)子的外形及設(shè)計(jì)差別，離心管的

53、口部和底部到旋轉(zhuǎn)外形及設(shè)計(jì)差別，離心管的口部和底部到旋轉(zhuǎn)軸中心間隔差別很大。如：離心管口軸中心間隔差別很大。如：離心管口R4.8厘厘米，管底米，管底R8.0厘米，厘米，rpm12000離心機(jī)的分類離心機(jī)的分類 目前在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)常用的離心機(jī)種類很多，目前在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)常用的離心機(jī)種類很多，按其離心轉(zhuǎn)子能到達(dá)最高轉(zhuǎn)速分：按其離心轉(zhuǎn)子能到達(dá)最高轉(zhuǎn)速分： 低速離心機(jī)低速離心機(jī)(在在6,000 rpm以下以下) 高速離心機(jī)高速離心機(jī)(在在25,000 rpm以下以下) 超速離心機(jī)超速離心機(jī)(在在30,000 rpm以上以上) 離心分別技術(shù)的種類離心分別技術(shù)的種類 差速離心法是指經(jīng)過不斷添加相對離心

54、力，使差速離心法是指經(jīng)過不斷添加相對離心力，使沉降速度不同的顆粒，在不同離心速度及不同沉降速度不同的顆粒，在不同離心速度及不同離心時間下分批離心方法。差速離心法普通用離心時間下分批離心方法。差速離心法普通用于分別沉降系數(shù)相差較大的顆粒。主要用于分于分別沉降系數(shù)相差較大的顆粒。主要用于分別細(xì)胞器和病毒。別細(xì)胞器和病毒。 差速離心法差速離心法(differential (differential centrifugation) centrifugation) 密度梯度離心法密度梯度離心法 亦稱平衡密度梯度離心法。密度梯度離心法包亦稱平衡密度梯度離心法。密度梯度離心法包括速度區(qū)帶和等密度離心二種方法

55、。后者又可括速度區(qū)帶和等密度離心二種方法。后者又可分為預(yù)制梯度等密度及自構(gòu)成梯度等密度兩種分為預(yù)制梯度等密度及自構(gòu)成梯度等密度兩種方法。方法。 速度區(qū)帶離心法速度區(qū)帶離心法 在離心前離心管內(nèi)預(yù)先裝入密度梯度介質(zhì)在離心前離心管內(nèi)預(yù)先裝入密度梯度介質(zhì)(如蔗如蔗糖、甘油、糖、甘油、KBr、CsCl等等)，待分別的樣品鋪在，待分別的樣品鋪在梯度液的頂部或梯度層中間，同梯度液一同離心。梯度液的頂部或梯度層中間，同梯度液一同離心。由于離心力的作用，顆粒分開原樣品層，按不同由于離心力的作用，顆粒分開原樣品層，按不同沉降速度向管底沉降，離心一定時間后，沉降的沉降速度向管底沉降，離心一定時間后，沉降的顆粒逐漸分

56、開，最后構(gòu)成一系列界面清楚的不延顆粒逐漸分開，最后構(gòu)成一系列界面清楚的不延續(xù)區(qū)帶。沉降系數(shù)越大，往下沉降越快，所呈的續(xù)區(qū)帶。沉降系數(shù)越大，往下沉降越快，所呈的區(qū)帶也越低。沉降系數(shù)較小的顆粒，那么在較上區(qū)帶也越低。沉降系數(shù)較小的顆粒，那么在較上部分依次出現(xiàn)。部分依次出現(xiàn)。 蔗糖密度梯度離心蔗糖密度梯度離心等密度離心法等密度離心法 某些密度梯度介質(zhì)經(jīng)過離心后會本身構(gòu)成梯度，某些密度梯度介質(zhì)經(jīng)過離心后會本身構(gòu)成梯度，如細(xì)胞分別液如細(xì)胞分別液Percoll。待分別樣品可和梯度介質(zhì)。待分別樣品可和梯度介質(zhì)先均勻混合，梯度介質(zhì)由于離心力的作用逐漸構(gòu)先均勻混合，梯度介質(zhì)由于離心力的作用逐漸構(gòu)成管底部濃而管頂

57、稀的密度梯度，與此同時原來成管底部濃而管頂稀的密度梯度，與此同時原來分布均勻的顆粒也發(fā)生重新分布。當(dāng)管底介質(zhì)的分布均勻的顆粒也發(fā)生重新分布。當(dāng)管底介質(zhì)的密度大于顆粒的密度時，顆粒上??；當(dāng)管頂介質(zhì)密度大于顆粒的密度時，顆粒上?。划?dāng)管頂介質(zhì)的密度小于顆粒的密度時，那么顆粒沉降；最后的密度小于顆粒的密度時，那么顆粒沉降；最后顆粒進(jìn)入到一個它本身的密度位置，顆粒不再挪顆粒進(jìn)入到一個它本身的密度位置，顆粒不再挪動，構(gòu)成穩(wěn)定的區(qū)帶。動，構(gòu)成穩(wěn)定的區(qū)帶。 CsCl密度梯度離心密度梯度離心超速離心超速離心 超速離心法超速離心法(ultracentrifugation)既可以既可以用來分別純化蛋白質(zhì)，也可以用作

58、測定用來分別純化蛋白質(zhì)，也可以用作測定蛋白質(zhì)的分子量。蛋白質(zhì)的分子量。 超速：超速：50000-120000rpm蛋白質(zhì)純度的鑒定蛋白質(zhì)純度的鑒定1、各種細(xì)分級的方法都可以用于純度鑒定、各種細(xì)分級的方法都可以用于純度鑒定 常用各種電泳法，比較權(quán)威的有：等速電常用各種電泳法，比較權(quán)威的有：等速電泳、梯度電泳、等電聚焦電泳、聚丙烯酰泳、梯度電泳、等電聚焦電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳。胺凝膠電泳。2、沉降分析和分散分析、沉降分析和分散分析 測定沉降系數(shù)和分散系數(shù)。測定沉降系數(shù)和分散系數(shù)。3、溶解度恒定法、溶解度恒定法 參與樣品量為橫坐標(biāo)，樣品溶解量為縱坐參與樣品量為橫坐標(biāo)，樣品溶解量為縱坐標(biāo)，作標(biāo)，作圖

59、。如只需一個拐點(diǎn)那么闡明樣品純。圖。如只需一個拐點(diǎn)那么闡明樣品純。蛋白質(zhì)分子量的測定蛋白質(zhì)分子量的測定1、最小分子量測定法：、最小分子量測定法：如如Mb含含F(xiàn)e為為0.335%，那么，那么M=55.8/0.335%=16700。這就是最小分子量。其實(shí)，真實(shí)分子量是最小分這就是最小分子量。其實(shí)，真實(shí)分子量是最小分子量的子量的n倍，倍，n指指Fe的數(shù)目，的數(shù)目，Mb的的n=1，所以，所以M=16700；而而Hb用其他方法測得分子量為用其他方法測得分子量為68000，那么說，那么說Hb含含4個個Fe原子。原子。2、浸透壓法、浸透壓法3、超離心法、超離心法4、凝膠過濾法、凝膠過濾法5、SDS-聚丙烯酰

60、胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白質(zhì)含量的測定蛋白質(zhì)含量的測定 1、凱氏定氮法 2、雙縮脲反響 3、Folin-酚試劑反響 4、紫外吸收法 5、考馬斯亮藍(lán)法凱氏定氮法凱氏定氮法 是一種檢測物質(zhì)中是一種檢測物質(zhì)中“含氮總量的方法。當(dāng)天然含氮含氮總量的方法。當(dāng)天然含氮有機(jī)物與濃硫酸共熱，分解出碳、氫、氮構(gòu)成二氧有機(jī)物與濃硫酸共熱，分解出碳、氫、氮構(gòu)成二氧化碳、水及氨，產(chǎn)生的氨可以與硫酸結(jié)合，生成硫化碳、水及氨，產(chǎn)生的氨可以與硫酸結(jié)合，生成硫酸銨，此過程稱為酸銨，此過程稱為“消化。消化。 這個反響進(jìn)展的很慢，可參與硫酸鉀或硫酸鈉提高這個反響進(jìn)展的很慢，可參與硫酸鉀或硫酸鈉提高消化液的沸點(diǎn)，并參與硫酸銅