第三章蛋白質(zhì)的共價結(jié)構(gòu)

1、第三章 蛋白質(zhì)的共價結(jié)構(gòu)一、蛋白質(zhì)通論（一）、蛋白質(zhì)的化學(xué)組成 碳 50% 氫 7% 氧 23% 氮 16% 硫 0-3% 其它微量元素（包括磷，金屬元素等，這些是蛋白質(zhì)的輔助成份或修飾成份）在這些化學(xué)元素中，氮的含量在不同蛋白質(zhì)中很穩(wěn)定，所以可以根據(jù)氮元素的含量測定蛋白質(zhì)的含量：蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)氮 × 6.25這是蛋白質(zhì)定量分析的理論基礎(chǔ)，經(jīng)典的蛋白質(zhì)含量測定方法就是先測定蛋白質(zhì)氮的含量，再根據(jù)上述公式計算蛋白質(zhì)的含量。 （二）、蛋白質(zhì)的分類（三）、蛋白質(zhì)的形狀和大小 蛋白質(zhì)的大小與分子量 蛋白質(zhì)的分子量變化較大，從6000到1,000,000道爾頓（dolton）。蛋白質(zhì)的分子量

2、可以通過實驗予以測定，通常也可根據(jù)氨基酸的數(shù)目估計： 蛋白質(zhì)的分子量（dolton）氨基酸殘基數(shù)×110 但對于結(jié)合蛋白上述公式不適應(yīng)。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次一級結(jié)構(gòu)： 氨基酸序列二級結(jié)構(gòu)： 螺旋，折疊三級結(jié)構(gòu)： 所有原子空間位置四級結(jié)構(gòu)： 蛋白質(zhì)多聚體 1969年正式將一級結(jié)構(gòu)定義為氨基酸序列和雙硫鍵的位置。 介于二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)之間還存在超二級結(jié)構(gòu)（二級結(jié)構(gòu)的組合）和結(jié)構(gòu)域（在空間上相對獨立）這兩個層次。(五）蛋白質(zhì)的功能 1.酶2.結(jié)構(gòu)成分3.氨基酸的貯藏 4.運輸功能 5.運動 6.激素 7.免疫 8.信息傳遞 9.基因表達調(diào)控 二、肽由氨基酸聚合而成的線性結(jié)構(gòu)叫肽鏈（pepti

3、de chain)，蛋白質(zhì)就是由一條或多條肽鏈組成。蛋白質(zhì)的共價結(jié)構(gòu)也即是肽鏈的結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的共價結(jié)構(gòu)有時也稱一級結(jié)構(gòu)。但根據(jù)IUPAC的規(guī)定蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)指肽鏈的氨基酸順序。 （一）、肽和肽鍵的結(jié)構(gòu) 1.蛋白質(zhì)是由氨基酸通過肽鍵連接起來的多肽鏈分子，肽鍵是它的連接方式。蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)中的另一種共價結(jié)構(gòu)是二硫鍵。它使同一條鏈內(nèi)或兩條鏈間的兩個巰基形成二硫鍵。 2.肽鍵的結(jié)構(gòu) 3.有關(guān)肽的名稱 多肽，環(huán)肽，閱讀方向，氨基酸殘基 4.肽鍵的性質(zhì) 剛性，反式 肽鍵將氨基酸與氨基酸頭尾相連殘基：在肽鏈中每個氨基酸都脫去一個水分子，脫水后的殘余部分叫殘基（residue), 因此蛋白質(zhì)肽鏈中的氨基酸統(tǒng)

4、統(tǒng)是殘基形式。（二）肽的物理與化學(xué)性質(zhì) 1.帶電性短肽：酸堿性由末端的氨基和羧基和R基團的可解離基團決定，滴定曲線相似于氨基酸的滴定曲線。其中氨基的pK值較游離氨基酸小，羧基的pK值較游離羧基大，R-基團變化不大。長肽或蛋白質(zhì)中酸堿性由R-基團決定。電荷計算：根據(jù)R基團在某一pH值時的解離狀態(tài)確定；等電點計算：同樣，先寫解離式，再根據(jù)pK值進行計算。 2.化學(xué)性質(zhì)氨基，羧基和R基團與游離氨基酸一樣，同樣有茚三酮反應(yīng)，還有肽鍵特有的反應(yīng)雙縮尿反應(yīng)。 3.旋光性短肽為各氨基酸的旋光度的綜和，而長肽不等于其總和。 (三）、天然肽有許多種生物活性：激素，抗生素等。肽激素，鵝膏蕈堿，谷胱甘肽。 三、蛋白

5、質(zhì)一級結(jié)構(gòu)測定(一)、氨基酸序列分析的基本策略重疊法(二)、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)測定的步驟1、蛋白質(zhì)的分離純化 2、測定多肽鏈的數(shù)目 3、(亞基分離） 4、二硫鍵的拆分與保護 5、氨基酸組成分析 6、鑒定N-或C-末端殘基7、多種方法的部分水解和肽段分離 8、測序 9、重疊 10、確定二硫鍵的位置 1.N-末端測定（1）二硝基氟苯（DNFB or FDNB)法；（2）丹黃酰氯（DNS)法;（3）苯異硫氰酸酯（PITC)法；（4）氨肽酶（amino peptidase)法2.C-末端測定（1）肼解法（hydrazinolysis)法；（2）還原法（reduction);（3）羧肽酶（Cardoxype

6、ptidase)法3.二硫鍵的切割與保護1、過甲酸performic acid 不可逆 CH2SO3H2、亞硫酸分解Sulfitolysis 可逆 R1-S-S-R2 SO3- R1-S- + R2-S-SO33、還原氧化 不可逆 巰基乙醇，DTT 碘乙酸等 S-CH2-COOH4.氨基酸組成分析 1.酸水解； 2.堿水解； 3.氨基酸分析5.肽鍵的專一性水解酶水解化學(xué)法: BrCN，NH2OH 酶法水解6.N末端和C末端測序法N末端：1、Sanger法 DNFB2、Edman法3、Dansyl chloride/Edman組合法4、酶降解法C末端：1、肼法2、3H標(biāo)記法3、酶降解法 4、PF

7、PA/PFPAA法C末端的肼(hydrazine)法測定C端的氚3H標(biāo)記法測定酶解法末端測序 利用外切蛋白水解酶(exo-peptidase) 將肽鏈的氨基酸從N端(aminopeptidase)或C端(carboxypeptidase)一個接一個游離出來，在不同時間取樣進行分析，根據(jù)所游離的氨基酸的摩爾數(shù)的多少來判斷氨基酸的排列順序。PFPA和PFPAA法C端測序PFPA：pentafluoropropionic acid C2F5COOHPFPAA：Pentafluoropropionic acid anhydride C2F5-COOOC-C2F5 這兩種物質(zhì)在酸性條件下低溫反應(yīng)，可以從

8、C端一個接一個地切除氨基酸，與質(zhì)譜相結(jié)合就可以確定C端多個氨基酸的序列。7.肽段氨基酸序列的測定Edman 降解法氨基酸的鑒定、分離純化Edman降解與DNS-Cl法的結(jié)合其它方法：1.酶解法2.質(zhì)譜法3.根據(jù)核苷酸序列推斷質(zhì)譜法 Edman循環(huán)后看分子量的變化7.二硫鍵位置的確定法1、為防止Cys跟Cys-Cys發(fā)生交換反應(yīng)，先 將自由SH基封閉。2、進行專一性部分水解3、紙層析分離水解產(chǎn)物4、氣相過甲酸法切斷S-S鍵，作第二相紙層 析5、將遷移率發(fā)生變化的多肽進行測序 N末端和C末端的測序除了用于未知蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)的研究以外，最常用于基因工程表達產(chǎn)物的末端分析。四、蛋白質(zhì)氨基酸序列與生物

9、學(xué)功能的關(guān)系（一）同源蛋白質(zhì)的物種差異與生物進化1.蛋白質(zhì)的同源性（sequence homology)2.不變殘基（invariant residue)3.可變殘基（varible residue)（二）同源蛋白質(zhì)的起源共同性（三）蛋白質(zhì)斷裂與激活第三章 蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)不具有功能，只有形成正確的結(jié)構(gòu)才具有功能。二級結(jié)構(gòu)以上的結(jié)構(gòu)叫高級結(jié)構(gòu)，由于高級結(jié)構(gòu)是指各原子或基團在空間上的分布，所以又叫空間結(jié)構(gòu)，或三維結(jié)構(gòu)。一、蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)（一）維持蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的作用力作用力 破壞因子氫鍵： -螺旋，-折疊 尿素，鹽酸胍疏水作用： 形成球蛋白的核心 去垢劑，有機溶劑Van de

10、r Waals力：穩(wěn)定緊密堆積的集團和原子離子鍵：穩(wěn)定-螺旋，三、四級結(jié)構(gòu) 酸、堿二硫鍵：穩(wěn)定三、四級結(jié)構(gòu) 還原劑配位鍵：與金屬離子的結(jié)合 螯合劑 EDTA（二）影響蛋白折疊的因素1.二面角的轉(zhuǎn)動2.非鍵合原子之間的最小接觸距離3.側(cè)鏈基團的空間位阻、電荷性質(zhì)、基團間的相互作用等二、典型的二級結(jié)構(gòu)1.螺旋右旋，3.6個氨基酸一個周期，螺距0.54 nm第n個AA(NH)與第n-4個 AA(CO)形成氫鍵，環(huán)內(nèi)原子數(shù)13。氫鍵取向與主軸基本平行1.- 螺旋的結(jié)構(gòu)特征： = -57o ;=-47o ; 3.613-螺旋 螺距=5.4Å；每個氨基酸上升1.5 Å,直徑=5

11、97; 2. - 螺旋的偶極矩和帽化 3. - 螺旋的手性 - 螺旋都是右手的，其旋光性是- 碳原子的不對稱性與- 螺旋的構(gòu)象不對稱性的結(jié)合。 4.影響- 螺旋的形成的因素： pH 的影響  一級結(jié)構(gòu)與二級結(jié)構(gòu)的關(guān)系（空間位阻，電荷效應(yīng)，特殊結(jié)構(gòu)，如脯氨酸）。2. 折疊折疊旋的結(jié)構(gòu)特征： = 139o ;=135o （反平行折疊） 主要存在于球狀蛋白和纖維蛋白中 = 119o ;=113o （平行折疊） 主要存在于球狀蛋白 折疊較為伸展。3.轉(zhuǎn)角半圈3.010 螺旋-凸起4、無規(guī)卷曲（randon coil) 指那些沒有明確重復(fù)周期結(jié)構(gòu)的“卷曲結(jié)構(gòu)”，它并非是“無規(guī)”卷曲，而是有序的

12、非重復(fù)結(jié)構(gòu)。這些無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)常常構(gòu)成蛋白質(zhì)的活性結(jié)構(gòu)部位和特異功能部位。三、纖維狀蛋白功能：動物支架蛋白，占一半或一半以上。分子軸比大于10,分類：不可溶和可溶兩種：前者包括角蛋白，膠原蛋白，后者包括肌球蛋白和纖維蛋白原。注意，有的象纖維狀的蛋白是球狀蛋白的長軸方向的聚集體不是纖維蛋白。-角蛋白 存在 分類 結(jié)構(gòu) 特性: 伸縮性螺旋圈間的氫鍵 剛性鏈間二硫鍵（含硫量）-角蛋白存在結(jié)構(gòu)：反平行-折疊片，多肽鏈呈鋸齒狀折疊構(gòu)象，側(cè)鏈交替的分布在折疊片兩側(cè)； 主要由具有Gly、Ser、Ala組成。作用力：鏈間以氫鍵連接 層間以范德華力維系特性: 抗張性 柔軟性 不能拉伸（二）膠原蛋白Collagen

13、的特殊性膠原蛋白的要點：1.膠原的組織分布和類型2.膠原的氨基酸組成3.膠原蛋白的結(jié)構(gòu)4.穩(wěn)定膠原蛋白結(jié)構(gòu)的作用力穩(wěn)定膠原三股螺旋的作用力： 層間的范德華作用力； 螺旋鏈間氫鍵； 鏈間的共價交聯(lián) 賴氨酸間的交聯(lián) 吡啶啉結(jié)構(gòu)。（三）彈性蛋白（四）肌球蛋白四、蛋白質(zhì)的超二級結(jié)構(gòu)超二級結(jié)構(gòu)的類型：keratin, myosin, 、：擁有-sheet的蛋白質(zhì)形成超二級結(jié)構(gòu)的作用力： 螺旋的側(cè)鏈位置的20度錯位：伸展肽鏈的12.5度自然扭曲六、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域(domain)在空間上相對獨立七、球狀蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)（一）球狀蛋白的分類（二）球狀蛋白三維結(jié)構(gòu)的特征1.球狀蛋白分子含有多種二級結(jié)構(gòu)元件2

14、.球狀蛋白具有明顯的折疊層次3.球狀蛋白分子為緊密的球狀或橢球狀實 體4.球狀蛋白疏水側(cè)鏈埋藏在分子內(nèi)部，親 水側(cè)鏈暴露在分子的表面5.球狀分子的表面有溝穴。八、膜蛋白的結(jié)構(gòu)（一）生物膜的結(jié)構(gòu)（二）膜內(nèi)在蛋白的結(jié)構(gòu)1.單跨膜肽段的膜蛋白2.具有7個跨膜肽段的膜蛋白3.桶型膜蛋白膜孔蛋白（三）脂錨定蛋白九、蛋白折疊和結(jié)構(gòu)預(yù)測（一）蛋白質(zhì)的變性 蛋白質(zhì)的變性是指蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，活性喪失的現(xiàn)象。 變性不是降解（分解）1.變性的表現(xiàn)：（1）活性喪失；（2）一些側(cè)鏈基團的暴露，側(cè)鏈基團的化學(xué)反應(yīng)特性發(fā)生改變；（3）理化性質(zhì)發(fā)生改變；（4）生化性質(zhì)發(fā)生改變。2、引起變性的因素（1）物理因素：光、熱

15、、射線、高壓、表面張力等；（2）化學(xué)因素：變性劑，去污劑，重金屬等。3、變性的本質(zhì) 變性是蛋白質(zhì)分子高級結(jié)構(gòu)的變化，主要是三級結(jié)構(gòu)，二級結(jié)構(gòu)的改變。 蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)是一個柔性、動態(tài)的結(jié)構(gòu)，這種動態(tài)的結(jié)構(gòu)在活性范圍內(nèi)變化，不會引起活性的變化，而超過允許的范圍，次級鍵發(fā)生改變，蛋白就變性。4.蛋白質(zhì)變性的可逆性 蛋白質(zhì)變性后，消除變性因素后，蛋白質(zhì)可恢復(fù)其活性的變性叫可逆變性。 蛋白質(zhì)變性后，消除變性因素后，蛋白質(zhì)不能恢復(fù)其活性的變性叫不可逆變性。二、一級結(jié)構(gòu)對高級結(jié)構(gòu)的規(guī)定性蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)決定高級結(jié)構(gòu) 結(jié)論：蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)決定其高級結(jié)構(gòu)。換言之，蛋白質(zhì)的三維立體結(jié)構(gòu)完全取決于其氨基酸的序列

16、。蛋白質(zhì)的天然立體結(jié)構(gòu)一般是自由能最低的狀態(tài)。 （三）、蛋白質(zhì)的折疊1.蛋白折疊研究的現(xiàn)狀：多數(shù)是采用體外變性/復(fù)性過程研究折疊過程，而這種過程與體內(nèi)過程是不一樣的。所以這一研究方法本身存在缺陷。2.異構(gòu)酶和分子伴侶在體內(nèi)蛋白質(zhì)折疊中的作用 在一部分蛋白質(zhì)中，其正確的空間結(jié)構(gòu)的形成需要一些輔助蛋白的作用，這些輔助蛋白即是異構(gòu)酶和分子伴侶。 蛋白二硫鍵異構(gòu)酶（protein disulfide isomerse PDI)，其作用是加速二硫鍵的形成； 肽基脯氨酸異構(gòu)酶（peptidyl prolyl isomerse),其作用是幫助脯氨酸的順反異構(gòu)過程。 分子伴侶（molecular chaper

17、one)的作用是幫助肽鏈的正確折疊。（四）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測1.二級結(jié)構(gòu)預(yù)測2. 三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測（1）同源蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測（2）能量最小原則預(yù)測（3）“局部”和“分層”方法LINUS預(yù)測方法結(jié)構(gòu)預(yù)測的意義：對于新的功能基因的研究，通過結(jié)構(gòu)預(yù)測，推斷其可能的功能，為進一步開展其功能研究奠定基礎(chǔ)。十、亞基的締合和四級結(jié)構(gòu)（一）名稱： 1.四級結(jié)構(gòu)：多個亞基締合形成聚集體即四級結(jié)構(gòu)； 2.亞基（單體 monomer)：一條多肽鏈形成的球狀蛋白結(jié)構(gòu)； 3.原(聚)體（protomer)：對稱的寡聚蛋白質(zhì)分子是由兩個或多個不對稱的等同結(jié)構(gòu)組成,這種等同結(jié)構(gòu)成分稱為原體; 4.寡聚體：兩個以上的亞基組成的蛋白質(zhì)

18、； 5.同多聚體(homomultimeric) ：相同亞基 6.雜多聚體(heteromultimeric) ：不同亞基（二）四級結(jié)構(gòu)的作用力和作用方式所有三級結(jié)構(gòu)的作用力，在四級結(jié)構(gòu)形成中都有作用； 同種締合：相同表面間的締合； 異種締合：不同表面間的締合（三）蛋白四級結(jié)構(gòu)的對稱性點群對稱環(huán)狀對稱：只有一個對稱軸；立方體對稱：2個以上的對稱軸，根據(jù)對稱軸的多少，分別有二面體對稱；四面體對稱；八面體對稱，二十面體對稱。螺旋體對稱: 對稱點繞軸旋轉(zhuǎn)的聚合形式。四、四級締合在結(jié)構(gòu)和功能上的優(yōu)越性1.增強結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性：締合降低總表面積，使得結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定2.遺傳經(jīng)濟性：一個基因編碼的蛋白可組成同多聚體

19、。3.使催化基團匯集在一起，提高催化效率4.具有協(xié)同效應(yīng)和別構(gòu)效應(yīng)多亞基蛋白的別構(gòu)效應(yīng) 蛋白質(zhì)與配基結(jié)合改變蛋白質(zhì)構(gòu)象, 進而改變蛋白質(zhì)生物活性的現(xiàn)象稱為別構(gòu)效應(yīng)。 同促效應(yīng) （homotropic effect） 指配體的結(jié)合對其它同種配體的效應(yīng)； 異促效應(yīng)（heterotropic effect) 指配體的結(jié)合對其它異種配體的效應(yīng)； 正效應(yīng)物（activator),使其它配體與結(jié)合部位結(jié)合能力加強（飽和濃度降低）。 負效應(yīng)物（inhebitor),使其它配體與結(jié)合部位結(jié)合能力減弱（飽和濃度提高）。 第五章 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能 蛋白質(zhì)在與其它分子的相互作用中行使其生物功能。在蛋白質(zhì)與其它分子的

20、相互作用中能被它可逆結(jié)合的其它分子稱為配體。 氧的轉(zhuǎn)運肌紅蛋白、血紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能 免疫應(yīng)答免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)與功能 肌肉收縮 肌球蛋白（粗絲）、肌動蛋白（粗絲）與肌肉收縮 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能進化一、胰島素的結(jié)構(gòu)與功能一級結(jié)構(gòu)：A鏈和B鏈組成，A鏈21AA,B鏈30AA,二級結(jié)構(gòu)：A鏈A12-A15是非標(biāo)準(zhǔn)的右手螺旋，其他為不同伸展程度的肽鏈結(jié)構(gòu)；B鏈在B1B6是伸展結(jié)構(gòu)，B8為Gly,轉(zhuǎn)折進入螺旋結(jié)構(gòu)，B9-B19為右手螺旋，其中兩圈為標(biāo)準(zhǔn)的螺旋。B21-23間有一回折。B23-B27間為一折疊。分子內(nèi)部為非極性的疏水核，全部極性側(cè)鏈在表面上。在表面有一個疏水區(qū)，在疏水區(qū)表面周圍有帶電荷基團

21、或極性基團。其中疏水區(qū)的芳香環(huán)除了具有疏水作用外，可能還與受體的識別有關(guān)。胰島素的這個表面結(jié)構(gòu)可能與其作為配體的作用有關(guān)。二、肌紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能存在：Sperm whale (抹香鯨, 巨頭鯨) myoglobin (肌紅蛋白), the oxygen carrier in muscle, was the first protein to be seen in atomic detail by X-ray analysis (John Kendrew, 1950s)功能：肌細胞儲存和分配氧的蛋白質(zhì)（一）肌紅蛋白的三級結(jié)構(gòu)組成：珠蛋白和血紅素大小和形狀：扁平狀分子，4.5nm×3.5

22、nm×2.5nm結(jié)構(gòu)描述：153個aa,8段-螺旋組成，分兩層，單結(jié)構(gòu)域。分子結(jié)構(gòu)緊密，內(nèi)部只能容納4個水分子的空間。疏水基團在分子的內(nèi)部，親水基團在分子表面，介于疏水和親水之間的基團在分子內(nèi)部和外部都可以找到。（二）輔基血紅素由4個吡咯環(huán)通過甲基橋連接成原卟啉IX，另外有4個甲基，2個乙烯基和2個丙酸基。原卟啉IX與Fe形成絡(luò)合物，即是血紅素。Fe有6個配位鍵，其中4個鍵與卟啉環(huán)的4個N原子相連，第5配位鍵與His F8相連，第6配位鍵與O2相連。 如果血紅素含F(xiàn)e2+，為亞鐵血紅素，F(xiàn)e3+，為高鐵血紅素。相應(yīng)的肌紅蛋白分別為亞鐵肌紅蛋白和高鐵肌紅蛋白。（三）O2與肌紅蛋白的結(jié)合

23、 Fe的第六配位鍵在沒有O2時，是空著的，O2與肌紅蛋白中的Fe 結(jié)合，結(jié)合以后與Fe-O鍵形成60度的夾角，同時夾在遠側(cè)組氨酸的中間。 除了O2與Fe結(jié)合外，CO也會與Fe結(jié)合，導(dǎo)致CO中毒。 肌紅蛋白的微環(huán)境的作用： 1.固定血紅素； 2.保護血紅素Fe不被氧化； 3.為分子氧提供一個合適的結(jié)合部位。O2與血紅素Fe結(jié)合后，會改變肌紅蛋白的構(gòu)象沒有結(jié)合氧時，鐵卟啉處于凸出位置，并且Fe是圓頂狀，結(jié)合氧后鐵卟啉收回形成平面狀。（四）氧結(jié)合曲線肌紅蛋白的功能肌細胞中儲存和分配氧的蛋白質(zhì)。靜脈血中氧濃度為15torr 線粒體中0-10torr 肌紅蛋白的P50為2torr三、血紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能

24、血液中結(jié)合和轉(zhuǎn)運氧的蛋白質(zhì)。還可運輸H+和CO2（一）結(jié)構(gòu)4條多肽鏈，兩條為 鏈，兩條鏈，每個亞基都有一個血紅素分子，具有氧結(jié)合能力。人在不同的發(fā)育階段有不同的種類。 鏈和鏈的三級結(jié)構(gòu)與肌紅蛋白相似。 四個亞基形成對稱結(jié)構(gòu)。（二）氧結(jié)合引起的血紅蛋白構(gòu)象變化1.氧結(jié)合改變Hb的四級結(jié)構(gòu)2.血紅素鐵的微小移動導(dǎo)致血紅蛋白構(gòu)象的轉(zhuǎn)換3.氧合血紅蛋白和去氧血紅蛋白代表不同的構(gòu)象態(tài),氧合后導(dǎo)致鹽鍵斷裂，結(jié)構(gòu)變得松弛。（三）血紅蛋白的協(xié)同性氧結(jié)合（四） H+,CO2和BPG對血紅蛋白結(jié)合氧的影響1.玻爾效應(yīng)及其意義2.BPG降低Hb對O2的親合力的機制及意義（1）Bohr效應(yīng)HbO2 + H+ HbH+

25、 + O2玻爾效應(yīng)是因為H+促進鹽鍵的形成，使血紅蛋白轉(zhuǎn)變成T態(tài)，有利于氧的釋放。在組織中，CO2濃度高，pH低，有利于氧的釋放，在肺組織中，p(O2)高，有利氧的結(jié)合。Bohr效應(yīng)的生理意義在同樣氧分壓差下，血紅蛋白在代謝迅速的組織中放氧量更大。血紅蛋白還通過Bohr效應(yīng)轉(zhuǎn)運走組織中形成的H+和CO2血紅蛋白的功能血紅蛋白除了運輸氧和CO2外，還能夠?qū)ρ旱膒H起緩沖作用。因為HbO2在釋放出一分子氧的同時，結(jié)合一個氫質(zhì)子。這樣就可以消除由于呼吸作用產(chǎn)生的CO2引起pH的降低。肌紅、血紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能比較肌紅蛋白肌細胞中儲存和分配氧的蛋白質(zhì)。屬于珠蛋白一族組成： 1條多肽鏈（珠蛋白）1個輔

26、基血紅素結(jié)構(gòu)描述：最高結(jié)構(gòu)為三級結(jié)構(gòu)。 血紅蛋白血液中結(jié)合和轉(zhuǎn)運氧的蛋白質(zhì)。 還可運輸H+和CO2屬于珠蛋白一族4條多肽鏈（兩種亞基） 4個輔基血紅素結(jié)構(gòu)描述：四級結(jié)構(gòu)呈四面體 屬于點群對稱（五）血紅蛋白的分子病四、免疫球蛋白免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）是指具有抗體活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗體相似的球蛋白?？贵w（antibody,Ab)是B細胞識別抗原后增殖分化為槳細胞所產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)，主要存在于血清等體液中，能與相應(yīng)抗原特異性地結(jié)合，具有免疫功能。（一） 免疫反應(yīng)的基本概念當(dāng)外源的分子（蛋白或細胞表面分子）進入哺乳動物體內(nèi)，與淋巴細胞接觸，會產(chǎn)生一種免疫球蛋白，當(dāng)這種分子再次進

27、入肌體，就會被這種免疫球蛋白的識別，并動員相關(guān)的免疫系統(tǒng)清除這種分子（及細胞）。這種外源分子即為抗原；識別這種抗原的免疫球蛋白叫抗體。（二）免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)（三）免疫球蛋白的種類及功能人類Ig根據(jù)其重鏈穩(wěn)定區(qū)的分子結(jié)構(gòu)和抗原特異性的不同，分為五類：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE，其重鏈分別為：、輕鏈可分為兩型：、型IgG于出生后3個月開始合成IgG多為單體，半衰期約為23天，占血清免疫球蛋白總量的75%80%結(jié)合補體，激活補體的傳統(tǒng)途徑 IgG是唯一能通過胎盤的抗體,穿過胎盤介導(dǎo)新生兒抗感染免疫 結(jié)合巨噬細胞、中性粒細胞、NK細胞，參與調(diào)理吞噬和ADCC效應(yīng) 與葡萄球菌A蛋白（SPA）

28、結(jié)合，可以純化抗體，也可以用于免疫診斷 抗感染的主要抗體。抗菌抗體、抗病毒抗體、抗毒素抗體IgM為五聚體，是分子量最大的Ig，稱巨球蛋白。激活補體能力比IgG強天然血型抗體是IgMIgM是個體發(fā)育過程最早能產(chǎn)生的抗體，胚胎晚期已能合成，新生兒臍帶血中若IgM水平升高，表示該兒曾有宮內(nèi)感染 IgM是抗原刺激后出現(xiàn)最早的抗體，故檢測IgM水平可用于傳染病的早期診斷。 IgM是B細胞抗原受體的主要成分IgA分為血清型和分泌型兩種，血清型IgA主要由腸系膜淋巴組織中的漿細胞產(chǎn)生。分泌型IgA（SIgA）是由呼吸道、消化道、泌尿生殖道等處的固有層中漿細胞產(chǎn)生。主要存在于初乳、唾液、淚液，以及呼吸道消化道

29、和泌尿生殖道黏膜表面的分泌中。分泌型IgA的合成和主要作用部位在黏膜IgD單體形式存在血清中，含量低，僅占血清總Ig的1%；IgD是B細胞的重要表面標(biāo)志B細胞的分化過程中首先出現(xiàn)SmIgM，后來出現(xiàn)SmIgD，他的出現(xiàn)標(biāo)志著B細胞成了,參與B細胞的活化、增殖和分化 。IgE又稱親細胞抗體CH2和CH3功能區(qū)可與肥大細胞、嗜堿性粒細胞上的高親和力Fc受體結(jié)合，引起敏反應(yīng)（四）免疫檢測應(yīng)用肌肉收縮的機制：肌絲滑動模型ATP水解與肌動蛋白與肌球蛋白的締合和解離相偶聯(lián)。六、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的進化 生物的形態(tài)和分子結(jié)構(gòu)在進化過程中不斷向多樣化和專業(yè)化方向發(fā)展。這種多樣化是指群體的多樣化，專一化是個體的

30、專一化。這種多樣化和專一化的基礎(chǔ)是分子變異。這種變異通過自然選擇，進行多樣化和專一（業(yè)）化。 新的蛋白質(zhì)是在舊的蛋白質(zhì)基礎(chǔ)上經(jīng)過突變，遺傳，自然選擇產(chǎn)生和發(fā)展起來的。第五章 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與分離和純化蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與分離方法 蛋白質(zhì)溶液膠體性質(zhì) 沉淀 特定的空間構(gòu)象，分子量一定 分子篩層析； 在大部分pH條件下，蛋白質(zhì)分子同時存在兩種電荷 等電點沉淀，鹽溶，鹽析，電泳，離子交換層析等； 一般而言，蛋白質(zhì)分子上同時存在疏水和親水區(qū)域 有機溶劑沉淀，疏水層析一、蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)（一）蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì) 1.蛋白中的解離基團 2.等電點 3.等離子點 蛋白質(zhì)與多肽一樣，能夠發(fā)生兩性離解，也有等電點

31、。在等電點時(Isoelectric point pI)，蛋白質(zhì)的溶解度最小，在電場中不移動。 在不同的pH環(huán)境下，蛋白質(zhì)的電學(xué)性質(zhì)不同。在pH小于等電點的溶液中，蛋白質(zhì)粒子帶正電荷，在電場中向負極移動；在pH大于等電點溶液中，蛋白質(zhì)粒子帶正電荷，在電場中向負極移動。這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)電泳(Electrophoresis)。（二）蛋白質(zhì)分子的大小和形狀 蛋白質(zhì)的大小從60001000000 Dalton 不同的蛋白質(zhì)常常有不同的分子量； 蛋白質(zhì)的形狀：球狀和纖維狀，不同的蛋白質(zhì)的長短軸比值也有差異。這些差異也是進行分離純化的依據(jù)。（三）蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì) 由于蛋白質(zhì)的分子量很大，它在水中能夠形成

32、膠體溶液。蛋白質(zhì)溶液具有膠體溶液的典型性質(zhì)，如丁達爾現(xiàn)象、布郎運動等。 由于膠體溶液中的蛋白質(zhì)不能通過半透膜，因此可以應(yīng)用透析法將非蛋白的小分子雜質(zhì)除去。 蛋白質(zhì)分子的直徑在膠體的范圍內(nèi)； 蛋白質(zhì)膠體溶液穩(wěn)定的因素： （1）直徑1-100nm; （2）表面帶有同種電荷; （3）溶劑化層。（四）、蛋白質(zhì)的沉淀作用 蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性與它的分子量大小、所帶的電荷和水化作用有關(guān)。 改變?nèi)芤旱臈l件，將影響蛋白質(zhì)的溶解性質(zhì) 在適當(dāng)?shù)臈l件下，蛋白質(zhì)能夠從溶液中沉淀出來。 消除穩(wěn)定蛋白質(zhì)的幾個因素，就會導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀。通常進行蛋白質(zhì)沉淀的方法有以下幾種： （1）鹽析； （2）有機溶劑沉淀法； （3）重金

33、屬沉淀； （4）生物堿試劑或某些酸類； （5）加熱變性沉淀 前兩種方法可以使蛋白質(zhì)不變性，后3種方法通常會使蛋白質(zhì)變性?？赡娉恋?在溫和條件下，通過改變?nèi)芤旱膒H或電荷狀況，使蛋白質(zhì)從膠體溶液中沉淀分離。 在沉淀過程中，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都沒有發(fā)生變化，在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以重新溶解形成溶液，所以這種沉淀又稱為非變性沉淀。 可逆沉淀是分離和純化蛋白質(zhì)的基本方法，如等電點沉淀法、鹽析法和有機溶劑沉淀法等。不可逆沉淀 在強烈沉淀條件下，不僅破壞了蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性，而且也破壞了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)沉淀不可能再重新溶解于水。 由于沉淀過程發(fā)生了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化，所以又稱為變性沉淀。 如

34、加熱沉淀、強酸堿沉淀、重金屬鹽沉淀和生物堿沉淀等都屬于不可逆沉淀。（五）、蛋白質(zhì)的變性蛋白質(zhì)的性質(zhì)與它們的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。某些物理或化學(xué)因素，能夠破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)狀態(tài)，引起蛋白質(zhì)理化性質(zhì)改變并導(dǎo)致其生理活性喪失。這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的變性。變性蛋白質(zhì)通常都是固體狀態(tài)物質(zhì)，不溶于水和其它溶劑，也不可能恢復(fù)原有蛋白質(zhì)所具有的性質(zhì)。所以，蛋白質(zhì)的變性通常都伴隨著不可逆沉淀。引起變性的主要因素是熱、紫外光、激烈的攪拌以及強酸和強堿等。（六）、蛋白質(zhì)的紫外吸收 大部分蛋白質(zhì)均含有帶芳香環(huán)的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。 這三種氨基酸的在280nm 附近有最大吸收。因此，大多數(shù)蛋白質(zhì)在280nm 附近顯示強的吸收

35、。 利用這個性質(zhì)，可以對蛋白質(zhì)進行定性鑒定二、蛋白質(zhì)研究技術(shù)蛋白質(zhì)分析的基本技術(shù) 1.離心技術(shù) 2.層析技術(shù) 3.電泳技術(shù) 4.沉淀技術(shù) （一）離心技術(shù) 離心技術(shù)主要用于各種生物樣品的分離和制備，生物樣品懸浮液在高速旋轉(zhuǎn)下，由于巨大的離心力作用，使懸浮的微小顆粒（細胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，從而與溶液得以分離，而沉降速度取決于顆粒的質(zhì)量、大小和密度?；驹?當(dāng)一個粒子（生物大分子或細胞器）在高速旋轉(zhuǎn)下受到離心力作用時，此離心力“F”由下式定義，即： F = m·a =m.V2/r= m·2 r a 粒子旋轉(zhuǎn)的加速度， m 沉降粒子的有效質(zhì)量，粒子旋轉(zhuǎn)的角

36、速度， r粒子的旋轉(zhuǎn)半徑( cm )。離心機的主要構(gòu)造和類型 離心機可分為工業(yè)用離心機和實驗用離心機。 實驗用離心機又分為： 制備性離心機：制備性離心機主要用于分離各種生物材料，每次分離的樣品容量比較大. 分析性離心機：一般都帶有光學(xué)系統(tǒng)，主要用于研究純的生物大分子和顆粒的理化性質(zhì)，依據(jù)待測物質(zhì)在離心場中的行為（用離心機中的光學(xué)系統(tǒng)連續(xù)監(jiān)測），能推斷物質(zhì)的純度、形狀和分子量等。 分析性離心機都是超速離心機。 工業(yè)離心機：主要用于工業(yè)上的分離。 制備性離心機可分為三類： 普通離心機：最大轉(zhuǎn)速6000 rpm左右，最大相對離心力近6000×g，容量為幾十毫升至幾升， 高速冷凍離心機：最大

37、轉(zhuǎn)速為2000025000rpm（r/min），最大相對離心力為89000×g，最大容量可達3升， 超速離心機：轉(zhuǎn)速可達5000080000 rpm，相對離心力最大可達510000×g，最著名的生產(chǎn)廠商有美國的貝克曼公司和日本的日立公司等，離心容量由幾十毫升至2升（二）層析技術(shù)層析法又稱色層分析法或色譜法（Chromatography），它是在1903-1906年由俄國植物學(xué)家M. Tswett首先系統(tǒng)提出來的。他將葉綠素的石油醚溶液通過CaCO3管柱，并繼續(xù)以石油醚淋洗，由于CaCO3對葉綠素中各種色素的吸附能力不同，色素被逐漸分離，在管柱中出現(xiàn)了不同顏色的譜帶或稱色譜圖

38、（Chromatogram）。蛋白質(zhì)分離純化中應(yīng)用的層析 分子篩層析 離子交換層析 親和層析 疏水/反相層析 物理吸附層析分子篩層析 凝膠層析是依據(jù)分子大小這一物理性質(zhì)進行分離純化的。層析過程。凝膠層析的固定相是惰性的珠狀凝膠顆粒，凝膠顆粒的內(nèi)部具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，形成很多孔穴。當(dāng)含有不同分子大小的組分的樣品進入凝膠層析柱后，各個組分就向固定相的孔穴內(nèi)擴散，組分的擴散程度取決于孔穴的大小和組分分子大小。比孔穴孔徑大的分子不能擴散到孔穴內(nèi)部，完全被排阻在孔外，只能在凝膠顆粒外的空間隨流動相向下流動，它們經(jīng)歷的流程短，流動速度快，所以首先流出；而較小的分子則可以完全滲透進入凝膠顆粒內(nèi)部，經(jīng)歷的流程長

39、，流動速度慢，所以最后流出；而分子大小介于二者之間的分子在流動中部分滲透，滲透的程度取決于它們分子的大小，所以它們流出的時間介于二者之間，分子越大的組分越先流出，分子越小的組分越后流出。這樣樣品經(jīng)過凝膠層析后，各個組分便按分子從大到小的順序依次流出，從而達到了分離的目的。 高效液相色譜技術(shù) （HPLC） 高效液相色譜（HPLC：High Performance Liquid Chromatography ）與普通的色譜技術(shù)不同的是：填料密度高，洗脫液壓力加大，分離效果更好。是化學(xué)、生物化學(xué)與分子生物學(xué)、醫(yī)藥學(xué)、農(nóng)業(yè)、環(huán)保、商檢、藥檢、法檢等學(xué)科領(lǐng)域與專業(yè)最為重要的分離分析技術(shù)，是分析化學(xué)家、生

40、物化學(xué)家等用以解決他們面臨的各種實際分離分析課題必不可缺少的工具。 高效液相色譜的優(yōu)點是：檢測的分辨率和靈敏度高，分析速度快，重復(fù)性好，定量精度高，應(yīng)用范圍廣。適用于分析高沸點、大分子、強極性、熱穩(wěn)定性差的化合物。 其缺點是：價格昂貴，要用各種填料柱，容量小，分析生物大分子和無機離子困難，流動相消耗大且有毒性的居多。目前的發(fā)展趨勢是向生物化學(xué)和藥物分析及制備型傾斜。 (三）電 泳 技 術(shù) 電泳是指帶電顆粒在電場的作用下發(fā)生遷移的過程。許多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等都具有可電離基團，它們在某個特定的pH值下可以帶正電或負電，在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電

41、荷極性相反的電極方向移動。電泳技術(shù)就是利用在電場的作用下，由于待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而對樣品進行分離、鑒定或提純的技術(shù)。2.電泳的分類電泳按其分離的原理不同可分為： 區(qū)帶電泳：電泳過程中，待分離的各組分分子在支持介質(zhì)中被分離成許多條明顯的區(qū)帶，這是當(dāng)前應(yīng)用最為廣泛的電泳技術(shù)。 自由界面電泳： 這是瑞典Uppsala大學(xué)的著名科學(xué)家Tiselius最早建立的電泳技術(shù)，是在形管中進行電泳，無支持介質(zhì)，因而分離效果差，現(xiàn)已被其他電泳技術(shù)所取代。 等速電泳：需使用專用電泳儀，當(dāng)電泳達到平衡后，各電泳區(qū)帶相隨，分成清晰的界面，并以

42、等速向前運動。 等電聚焦電泳：由兩性電解質(zhì)在電場中自動形成pH梯度，當(dāng)被分離的生物大分子移動到各自等電點的pH處聚集成很窄的區(qū)帶。（5）脈沖電泳：通過改變電場方向和強度，從而提高大分子的分離效果。（6）毛細管電泳：將介質(zhì)填充在毛細管中，因散熱效果較好，可用高電壓進行電泳。按支持介質(zhì)的不同可分為： 紙電泳（Paper electrophorisis） 醋酸纖維薄膜電泳（Cellulose Acetate electrophoresis） 瓊脂凝膠電泳（Agar Gel electrophoresis） 聚丙烯酰胺凝膠電泳（Polyacrylamide Gel electrophoresis）（P

43、AGE） SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）。按支持介質(zhì)形狀不同可它為： 薄層電泳 ； 板電泳 ； 柱電泳。 按用途不同可分為： 分析電泳； 制備電泳； 定量免疫電泳； 連續(xù)制備電泳。 按所用電壓不同可分為： 低壓電泳：100V500V，電泳時間較長，適于分離蛋白質(zhì)等生物大分子。 高壓電泳：1000V5000V，電泳時間短，有時只需幾分鐘，多用于氨基酸、多肽、核苷酸和糖類等小分子物質(zhì)的分離。4.幾種常見的蛋白電泳方法1.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳. 2.不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳3.等點聚焦電泳 4.雙向電泳2.不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳 主要的分離介質(zhì)是聚丙烯酰胺凝膠。電泳分兩段進行，開

44、始是濃縮膠，其作用是使得蛋白質(zhì)被壓縮成很薄的薄層，使被分離的分子間盡可能地縮短距離。然后進入分離膠進行分離。 三種效應(yīng): 樣品濃縮效應(yīng) 分子篩效應(yīng) 電荷效應(yīng)電極緩沖液是pH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液。濃縮膠 pH 6.8: Gly- < protein- < Cl-分離膠 pH 8.9: protein- < Gly- < Cl-4. 雙向凝膠電泳 (2D-Page)2-DE的第一向電泳等電聚焦是基于等電點不同而將蛋白粗步分離，第二向SDS-PAGE是基于蛋白質(zhì)分子量不同，而將一向分離后的蛋白進一步分離。這樣就可以得到蛋白質(zhì)等電點和分子量的信息。 （四）沉淀技術(shù) 蛋

45、白質(zhì)的沉淀是蛋白質(zhì)分離的一種方法之一，由于其方法和設(shè)備簡單，費用低，常常是蛋白質(zhì)分離中的初分離所采用的方法。 蛋白質(zhì)沉淀一方面由于不同蛋白質(zhì)的溶解性質(zhì)不同，利用其溶解特性的差異進行初分離不同的蛋白；另一方面通過沉淀也是一種濃縮的方式。 蛋白質(zhì)沉淀的原理是消除蛋白質(zhì)在水溶液中的穩(wěn)定條件，即減少同種電荷；消除水化層。蛋白質(zhì)沉淀的方法有兩種： 中性鹽沉淀法 有極溶劑沉淀法常用中性鹽沉淀法硫酸銨法 溶解度大：尤其是在低溫時仍有相當(dāng)高的溶解度，這是其他鹽類所不具備的。由于酶和各種蛋白質(zhì)通常是在低溫下穩(wěn)定，因而鹽析操作也要求在低溫下（04）進行。（NH4）2SO4在0時仍有70.6的溶解度，遠遠高于其它鹽類。 分離效果好：有的提取液加入適量硫酸銨鹽析，一步就可以除去75的雜蛋白，純度提高了四倍。 不易引起變性，有穩(wěn)定酶與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用。有的酶或蛋白質(zhì)用23mol/L的（NH4）2SO4保存可達數(shù)年之久。 價格便宜，廢液不污染環(huán)境。硫酸銨沉淀蛋白質(zhì)主要與鹽濃度有關(guān)，硫酸銨濃度的表示方法是以飽和溶液的百分?jǐn)?shù)表示，稱為百分飽和度，而不用實際的克數(shù)或克分子數(shù)，這是由于當(dāng)固體硫酸銨加到水溶液中去時，會出現(xiàn)相當(dāng)大的非線性體積變化。有極溶劑沉淀法 有機溶劑多采用乙醇和丙酮，其作用