熒光分光光度計課件

1、2021-12-11光學分析儀器培訓1光學分析儀器（2）熒光分光度計的原理與應用技術2021-12-11光學分析儀器培訓2熒光分光光度法 光光的基本性質 光是一定波段范圍的電磁波，具有波粒二象性。光的波動性可用波長、頻率、光速c、波數(shù)（cm-1）等參數(shù)來描述： = c ； 波數(shù) = 1/ = /c 光的粒子性說明光是有能量的： E = h = h c / （Planck常數(shù)：h=6.626 10 -34 J S )1、熒光分光光度法簡介2021-12-11光學分析儀器培訓3熒光分光光度法 光學分析儀器主要是通過電磁波與物質互作用后，物質對電磁輻射產生吸收或再發(fā)射，測量所得到的信息來對物質加以研

2、究的分析儀器。這方面的儀器很多，在這里我們主要對紫外可見分光光度計和熒光分光光讀計加以討論。1、熒光分光光度法簡介2021-12-11光學分析儀器培訓4熒光分光光度法光學分析儀器 因為物質對光的選擇性吸收的特點，他的吸收有 如下的特性性 M + h M * M + 熱 基態(tài)基態(tài) 激發(fā)態(tài)激發(fā)態(tài) M + 熒光或磷光1、熒光分光光度法簡介2021-12-11光學分析儀器培訓5 熒光分光光度法 原子發(fā)射光譜法：原子熒光分析 發(fā)射光譜法 分子發(fā)射光譜法 ： 熒光分析、磷光分析 光譜分析法 原子吸收光譜法：原子吸收分光分析 吸收光譜法 分子吸收光譜發(fā)：紫外可見、紅外吸收光譜 1、熒光分光光度法簡介2021

3、-12-11光學分析儀器培訓6熒光分光光度法 熒光分光光度法 熒光現(xiàn)象早在16世紀就比發(fā)現(xiàn)，但對熒光產生的原理和條件直到19世紀才基本清楚。Stokes在1852年考察了奎寧和葉綠素的熒光后發(fā)現(xiàn)，他們的熒光波長要比照射的波長要長。認定是物質吸收光能后重新發(fā)射的光，并且波長不同，熒光是發(fā)射光才被證實。 1、熒光分光光度法簡介2021-12-11光學分析儀器培訓7熒光分光光度法 熒光分光光度法 當用紫外光照射某種物質時，這些物質會發(fā)出各種顏色和不同強度的光，當紫外光停止照射時，這種光線也隨之消失。我們這種光線稱為熒光。依據(jù)物質所發(fā)熒光的顏色和強度建立起來的定性和定量的分析方法稱為熒光分光光度法。

4、1、熒光分光光度法簡介2021-12-11光學分析儀器培訓8熒光分光光度法 熒光的產生： 熒光是一種自然現(xiàn)象，在我們的日常生活中到處可以看見。產生熒光的原因是：熒光物質分子吸收了特征頻率的能量后，由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，然后內能轉換消耗部分能量，返回到最低電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級，再從這個能級返回基態(tài)時所發(fā)的光，這束光我們稱為熒光。熒光發(fā)射的能量要比吸收光的能量小（波長要長）。在這里我們用分子能級圖就能夠很好的理解它的產生過程。 1、熒光分光光度法簡介2021-12-11光學分析儀器培訓9熒光分光光度法n分子能級圖：n 1、熒光分光光度法簡介2021-12-11光學分析儀器培訓10熒光分光光度法

5、2、熒光分光光度計的基本結構 F-7000熒光分光光度計2021-12-11光學分析儀器培訓11熒光分光光度法熒光分析儀器的結構和主要部件： 2、熒光分光光度計的基本結構2021-12-11光學分析儀器培訓12熒光分光光度法 2、熒光分光光度計的基本結構2.1、光源： 對光源的要求是必須有足夠的強度且具有連續(xù)光譜，其波長范圍能滿足儀器的需要。大部分儀器由氙燈組成,它對能量的要求沒有紫外可見分光光度計那么嚴格。2021-12-11光學分析儀器培訓13熒光分光光度法 2、熒光分光光度計的基本結構2021-12-11光學分析儀器培訓14熒光分光光度法 2、熒光分光光度法簡介2.2、單色器： 色器也是

6、熒光分光度計的核心部件。它有兩個單色器。激發(fā)單色器它的作用是將光源發(fā)出的白色光色散成各種波長的單色光用于照射樣品，發(fā)射單色器的作用只讓樣品發(fā)出的熒光通過。2021-12-11光學分析儀器培訓15熒光分光光度法 2、熒光分光光度計的基本結構2.3、樣品室 樣品室比較寬大，以容納各種光徑的樣品池和附件。如流動池，微量池等。樣品池全用石英材料制成，沒有玻璃樣品池。2021-12-11光學分析儀器培訓16熒光分光光度法 F-7000 熒光分 光光度 計樣品 室2、熒光分光光度計的基本結構2021-12-11光學分析儀器培訓17熒光分光光度法 2、熒光分光光度計的基本結構2021-12-11光學分析儀器

7、培訓18熒光分光光度法 2、熒光分光光度計的基本結構2.4、檢測器 熒光分光光度計常用的是光電檢測器。如光電池、光電管、光電倍增管和二極管陣列檢測器。現(xiàn)在大部分是光電管 2.5、數(shù)據(jù)測量和控制： 控制儀器，并把測量到的熒光強度顯示出來。2021-12-11光學分析儀器培訓19熒光分光光度法 2、熒光分光光度計的基本結構2.3、樣品室 樣品室比較寬大，以容納各種光徑的樣品池和附件。如流動池，微量池等。樣品池全用石英材料制成，沒有玻璃樣品池。2021-12-11光學分析儀器培訓20熒光分光光度法n熒光分光光度計于紫外-可見分光光度計的區(qū)別 2、熒光分光光度計的基本結構2021-12-11光學分析儀

8、器培訓21熒光分光光度法 3、熒光分光光度法的特點 3.1、特點有以下幾點： （1）靈敏度高 熒光分析的最大特點是靈敏度高，通常比紫外可見光度計高出23個數(shù)量級。 （2）選擇性強 熒光光譜包括激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。因此確定恰當?shù)募ぐl(fā)光譜和發(fā)射波長，能達到很高的選擇。 2021-12-11光學分析儀器培訓22熒光分光光度法 3、熒光分光光度法的特點 （3）試樣量少和方法簡單 由于熒光分析法靈敏度高，因而分析時需試樣量較小。特別在使用微量池時，用樣量可以大大減小。 （4）能獲得更多的信息 熒光分析可提供激發(fā)光譜、發(fā)射光譜、熒光強度、總熒光量、峰位、譜帶寬度、量子產率、熒光壽命等參數(shù)。2021-12-

9、11光學分析儀器培訓23熒光分光光度法 3、熒光分光光度法的特點 （5）受外界影響較大 ， 外界因素如溫度、PH值、溶劑和其它因素都可能顯著地影響分析結果。其中溫度對他的影響最大，這也是熒光分析需標準的原因。2021-12-11光學分析儀器培訓24熒光分光光度法 3、熒光分光光度法的特點 3.2、熒光分光光度法的發(fā)展 近年來，熒光分光度計隨著新技術的的采用，發(fā)展非常快，特別是計算機和其它先進技術應用的引入，是熒光光度計發(fā)生了根本的變化，相應的分析方法也得到很快的發(fā)展，象激光熒光分析技術、時間分辨熒光分光光度法、同步熒光分析法，這些又大的推動了分析方法在理論和應用方面的進展。同時促進熒光分析技術

10、的不斷完善。2021-12-11光學分析儀器培訓25熒光分光光度法 3、熒光分光光度法的特點 3.3、熒光和分子的關系： 熒光和分子結構的關系是個比較重要而復雜的問題，但是，由于對激發(fā)態(tài)分子的性質了解得不多，所以對他們的關系還不十分清楚。一般來說，能發(fā)出熒光的物質具有較大的吸收光能力、較高的熒光量子效率和合適的環(huán)境。分子中含有能發(fā)熒光的基團稱為熒光團。對于能產生熒光的物質與分子結構之間關系的描述可簡單的總結以下幾點，僅供參考。2021-12-11光學分析儀器培訓26熒光分光光度法 3、熒光分光光度法的特點 3.3、熒光和分子的關系： 3.3.1、 有機物的熒光 （1） 共軛效應： 具有共軛雙鍵

11、的芳環(huán)或雜環(huán)化合物，其電子共軛程度越大，越容易產生熒光;環(huán)越多，發(fā)光峰紅移程度越大,發(fā)光也越強。同一共軛環(huán)數(shù)的芳族化合物，線性環(huán)結構的熒光波長比非線性者要長。2021-12-11光學分析儀器培訓27熒光分光光度法 3、熒光分光光度法的特點 3.3、熒光和分子的關系： （2）鰲合物中配位體的發(fā)光：不少有機化合物雖然具有共軛雙鍵，但由于不是剛性的分子不處于同一平面，因而不發(fā)熒光。若這些化合物和金屬離子形成鰲合物，隨著分子的剛性增加，平面結構增大，常常會發(fā)熒光。2021-12-11光學分析儀器培訓28熒光分光光度法 3、熒光分光光度法的特點 3.3、熒光和分子的關系： （3）剛性結構和平面結構效應：

12、一般來說，熒光物質的剛性和平面性增強，可使分子與溶劑或其它溶質分子的相互作用減小，既使外轉移能量損失減小，從而有利于熒光的發(fā)射。如果分子內取代基之間形成氫鍵，加強了分子的剛性結構，其熒光強度將增加。2021-12-11光學分析儀器培訓29熒光分光光度法 3、熒光分光光度法的特點 3.3、熒光和分子的關系： 取代基的類型和位置：取代基對熒光體的影響分為加強熒光的、減弱熒光的和影響不明顯的。 加強熒光的取代基有OHORRNH2CN、NHR、NR2、OCH3等給電子取代基，由于它們n電子的電子云幾乎與芳環(huán)上的軌道平行，因而共享了功軛 電子結構，同時，擴大了共軛雙鍵體系。2021-12-11光學分析儀

13、器培訓30熒光分光光度法 3、熒光分光光度法的特點 3.3、熒光和分子的關系： 減弱熒光的有COOH、NO2、NO、SH等得電子取代基，它們n電子的電子云并不與芳環(huán)上電子平面。影響不明顯的取代基有NH3、R、SO3H等。 （4）電子躍遷類型：含有氮、氧、硫雜原子的有機物，它們的熒光強度與電子躍遷類型有關。2021-12-11光學分析儀器培訓31熒光分光光度法 3、熒光分光光度法的特點 3.3、熒光和分子的關系： 3.3.2、金屬鰲合物的熒光： 除過元素的順磁性原子會發(fā)生線狀熒光光譜外，大多數(shù)無機鹽類金屬離子在溶液中只能發(fā)生無輻射躍遷，因而不產生熒光。但是,在某些條件下，金屬鰲合物卻能產生很強的

14、熒光，并可用于痕量金屬離子的測定。2021-12-11光學分析儀器培訓32熒光分光光度法 3、熒光分光光度法的特點 3.3、熒光和分子的關系： （1）鰲合物中配位體的發(fā)光：不少有機化合物雖然具有共軛雙鍵，但由于不是剛性的分子不處于同一平面，因而不發(fā)熒光。若這些化合物和金屬離子形成鰲合物，隨著分子的剛性增加，平面結構增大，常常會發(fā)熒光。2021-12-11光學分析儀器培訓33熒光分光光度法 3、熒光分光光度法的特點 3.3、熒光和分子的關系： （2）鰲合物中金屬離子的特征光譜：這類發(fā)光過程通常是鰲合物首先通過配位體的*躍遷而被激發(fā)，接著配位體把能量轉移給金屬離子，導致dd*或f f*路遷，最終

15、發(fā)射的是d*d或f *f路遷光譜。2021-12-11光學分析儀器培訓34熒光分光光度法 4、熒光分析中常用參數(shù)4.1、激發(fā)光譜和發(fā)射光譜 熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜是用熒光分析法進行定量和定性分析是的基本參數(shù)和依據(jù)。因次我們在學習熒光分光光度法時要對它加以了解。2021-12-11光學分析儀器培訓35熒光分光光度法 4、熒光分析中常用參數(shù) 4.1.1、激發(fā)光譜: 將樣品放入光路中選擇合適的發(fā)射單色器的波長和帶寬并使之固定不變，讓激發(fā)單色器的波長掃描，所得的圖譜既為激發(fā)光譜。它反映了物質的熒光強度對激發(fā)波長的關系。2021-12-11光學分析儀器培訓36熒光分光光度法 4、熒光分析中常用參數(shù) 4

16、.1.1、激發(fā)光譜: F激發(fā)2021-12-11光學分析儀器培訓37熒光分光光度法 4、熒光分析中常用參數(shù) 4.1.1、激發(fā)光譜: 它的特性：激發(fā)光譜從理論上講同一物質的最大激發(fā)波長和最大吸收波長一致，但由于熒光測量儀器的特性如光源的分布、單色器的透射和檢測器響應的影響，實際測量的熒光激發(fā)光譜與吸收光譜不完全一致。2021-12-11光學分析儀器培訓38熒光分光光度法 4、熒光分析中常用參數(shù) 4.1.2、發(fā)射光譜（也叫熒光光譜）： 將熒光樣品放入光路中后，選擇合適的激發(fā)單色器波長與帶寬使之固定不變，讓發(fā)射單色器的波長掃描圖譜，所得光譜既為發(fā)射光譜。它反映了物質的熒光強度對發(fā)射波長的關系。202

17、1-12-11光學分析儀器培訓39熒光分光光度法 4、熒光分析中常用參數(shù) 4.1.2、發(fā)射光譜（也叫熒光光譜）： F發(fā)射2021-12-11光學分析儀器培訓40熒光分光光度法 4、熒光分析中常用參數(shù) 4.1.2、發(fā)射光譜（也叫熒光光譜）： 熒光光譜通常具有如下特性； （1）斯托克斯位移； （2）熒光發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)光波長無關； （3）熒光光譜與吸收光譜的鏡像關系。2021-12-11光學分析儀器培訓41熒光分光光度法n分子能級圖：n 4、熒光分析中常用參數(shù)2021-12-11光學分析儀器培訓42熒光分光光度法 4、熒光分析中常用參數(shù) 4.2 熒光強度 熒光強度是表示發(fā)射相對強度的物理量，它

18、是最常用的熒光參數(shù)之一。目前一般的商品儀器都采用熒光強度來表示，所以單位為任意單位，表示的是相對強度。2021-12-11光學分析儀器培訓43熒光分光光度法 4、熒光分析中常用參數(shù) 4.2 熒光強度 物質發(fā)射的熒光強度與它吸收的光能成正比，當測量的溶液很稀時，可用如下公式表示： F=KI0CL2021-12-11光學分析儀器培訓44熒光分光光度法 4、熒光分析中常用參數(shù)4.2 熒光強度 F=KI0CL F-熒光強度 K-儀器常數(shù) I0-激發(fā)光強度 C-樣品濃度 L-池的光徑長度 -樣品消光系數(shù) -樣品的量子產率 2021-12-11光學分析儀器培訓45熒光分光光度法 4、熒光分析中常用參數(shù) 4

19、.3、量子產率： 因為熒光強度只是相對強度，只能在同一儀器相同條件下加以比較，所以要想比較不同物質的熒光強弱，應當用量子產率來表示。 量子產率=發(fā)射量子數(shù)/吸收量子數(shù)2021-12-11光學分析儀器培訓46熒光分光光度法 4、熒光分析中常用參數(shù) 4.4、熒光的熄滅 廣義的講,指任何可使某種熒光物質的熒光強度下降的作用或任何可使熒光量子產率降低的作用。 狹義的說,熒光熄滅指熒光物質分子與溶劑分子或其他溶質分子的相互作用引起熒光強度降低的現(xiàn)象。2021-12-11光學分析儀器培訓47熒光分光光度法 4、熒光分析中常用參數(shù) 4.4、熒光的熄滅 導致熒光熄滅作用的幾種主要類型: a 碰撞熄滅; b 能

20、量轉移; c 電荷轉移 ; d 轉入三重態(tài); e 光化學反應熄滅; f 自熄滅和自吸收;2021-12-11光學分析儀器培訓48熒光分光光度法 4、熒光分析中常用參數(shù) 4.4、熒光的熄滅a 碰撞熄滅; 碰撞熄滅是熒光熄滅的主要原因是指處于激發(fā)單重態(tài)的熒光分子與熄滅劑發(fā)生碰撞，使激發(fā)態(tài)分子以無輻射躍遷方式回到基態(tài)，因而產生熒光熄滅。 碰撞熄滅與溶液的粘度有關，粘度大熄滅作用較小。2021-12-11光學分析儀器培訓49熒光分光光度法 4、熒光分析中常用參數(shù) 4.4、熒光的熄滅b 能量轉移; 這種熄滅作用產生于熄滅劑與處于激發(fā)但重態(tài)的熒光分子作用后，發(fā)生能量轉移是熄滅劑得到激發(fā)。如果溶液中熄滅劑濃

21、度足夠大，可能引起熒光物質的熒光光譜發(fā)生畸變，造成熒光強度測量的誤差。2021-12-11光學分析儀器培訓50熒光分光光度法 4、熒光分析中常用參數(shù) 4.4、熒光的熄滅c 電荷轉移 ; 這種熄滅作用產生于熄滅劑與處于激發(fā)態(tài)分子間發(fā)生電荷轉移而引起的。由于激發(fā)態(tài)分子往往被基態(tài)分子具有更強的氧化還原能力，因此熒光物質的激發(fā)態(tài)分子比基態(tài)分子更容易與其它物質的分子發(fā)生電荷轉移作用。2021-12-11光學分析儀器培訓51熒光分光光度法 4、熒光分析中常用參數(shù) 4.4、熒光的熄滅d 轉入三重態(tài); 由于內部能量轉移，發(fā)生由激發(fā)單重態(tài)到三重態(tài)的系間竄躍，多余的振動能在碰撞中損失而使熒光熄滅。2021-12-

22、11光學分析儀器培訓52熒光分光光度法 4、熒光分析中常用參數(shù) 4.4、熒光的熄滅e 光化學反應熄滅; 由光致激發(fā)態(tài)分子所發(fā)生的化學反應稱為光化學反應，它可以是單分子也可以是雙分子反應。熒光分析中因發(fā)生光化學反應導致熄滅現(xiàn)象經常遇到，其中，影響最大的是光解反應。表現(xiàn)在熒光測定過程中熒光強度隨光照時間而減弱。2021-12-11光學分析儀器培訓53熒光分光光度法 4、熒光分析中常用參數(shù) 4.4、熒光的熄滅f 自熄滅和自吸收; 當熒光物質濃度較大時，經常發(fā)生自熄滅現(xiàn)象，使熒光強度降低。這可能是由于激發(fā)態(tài)分子之間的碰撞引起的能量損失。 當熒光物質的熒光光譜曲線與吸收光譜曲線重疊時，熒光被溶液中處于基

23、態(tài)的分子吸收。稱為自吸收。2021-12-11光學分析儀器培訓54熒光分光光度法 4、熒光分析中常用參數(shù) 4.5、熒光分析法的靈敏度 a 、 絕對靈敏度Sa；是用熒光物質的量子產率和摩爾吸收系數(shù)的乘積。 b 、 以硫酸奎寧的檢出線表示儀器的靈敏度。 c 、 用純水拉曼峰信噪比(S/N)表示儀器的靈敏度。2021-12-11光學分析儀器培訓55熒光分光光度法 5、熒光分光光度計的分析方法 5.1、定性分析 熒光分光光度劑的定性分析是根據(jù)掃描出來的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜進行的特性定性分析。 2021-12-11光學分析儀器培訓56熒光分光光度法5、熒光分光光度計的分析方法： 5.2、定量 分析 儀器分

24、析方法的定量基礎是： S=f(c) 當S=f(c)為線性響應時： F=kic 當S=f(c)為非線性響應時： F=kic+b 2021-12-11光學分析儀器培訓57熒光分光光度法5、熒光分光光度計的分析方法： 5.2、定量 分析 在定量分析時，除庫倫法和重量法外，所有的分析方法都需要校正，即需要建立待測組分的濃度與分析信號間的真正關系。儀器分析方法中常用的校正方法有：標準曲線法；標準加入法和內標法。我們要根據(jù)儀器和分析對象的條件，選擇適合的校正方法。 2021-12-11光學分析儀器培訓58熒光分光光度法 5、熒光分光光度計的分析方法 5. 2、定量分析 對熒光分光光度計而言定量分析的依據(jù)是

25、熒光強度的關系公式進行定量分析的，其主要的分析方法有：標準曲線法、標準樣品對照法和內標法。2021-12-11光學分析儀器培訓59熒光分光光度法 5、熒光分光光度計的分析方法 5.2、定量分析 5.2.1標準曲線法； 配制一系列標準溶液，其濃度在待樣品的濃度范圍內。選擇合適的激發(fā)、發(fā)射波長其熒光強度并與濃度C繪制標準曲線，在測未知樣品的強度，從標準曲線上可查出未知樣品的濃度。2021-12-11光學分析儀器培訓60熒光分光光度法 5、熒光分光光度計的分析方法 5.2、定量分析 5.2.1標準曲線法； 熒熒光光強強度度標準溶液濃度標準溶液濃度2021-12-11光學分析儀器培訓61熒光分光光度法 5、熒光分光光度計的分析方法 5. 2、定量分析 5.2.2、內標法： 在樣品溶液中加入已知的標準溶液分別測量樣品加標準溶液、樣品溶液和空白溶液的熒光強度，在根據(jù)它們之間的關系進行計算。2021-12-11光學分析儀器培訓62熒光分光光度法 5、熒光分光光度計的分析方法 5. 2、定量分析 5.2.2、內標法： 其計算公式如下： C樣/C標=F樣/(F標+樣-F樣)2021-12-11光學分析儀器培訓63熒光分光光度法 5、熒光分光光度計的分析方法 5. 2、定量分析 5.2.3、標準、樣品對照法(單點校正法) 當樣品溶液遵循