生物12《基因工程的基本操作程序》ppt(新人教版選修3

1、原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)( (補(bǔ)充內(nèi)容）補(bǔ)充內(nèi)容）非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 與與RNARNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)聚合酶結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)子啟動(dòng)子終止子終止子不編碼蛋白質(zhì)。不編碼蛋白質(zhì)。：編碼蛋白質(zhì)：編碼蛋白質(zhì) , ,連續(xù)不間斷連續(xù)不間斷編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)原核原核細(xì)胞細(xì)胞的的 基因基因結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)調(diào)控遺傳信息表達(dá)調(diào)控遺傳信息表達(dá), ,上上 游有啟動(dòng)子，下游有終止子游有啟動(dòng)子，下游有終止子真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)（補(bǔ)充內(nèi)容）真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)（補(bǔ)充內(nèi)容）編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與與RNARNA聚合酶聚合酶結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合

2、位點(diǎn)內(nèi)含子內(nèi)含子 外顯子外顯子 啟動(dòng)子啟動(dòng)子終止子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 真核真核細(xì)胞細(xì)胞的的 基因基因結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控作用有調(diào)控作用, ,上游有啟動(dòng)子，下上游有啟動(dòng)子，下游有終止子游有終止子非編碼序列：非編碼序列： 包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1 1、目的基因的獲取、目的基因的獲取2 2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3 3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)

3、胞4 4、目的基因的檢測(cè)與鑒定、目的基因的檢測(cè)與鑒定 目前被較廣泛提取目前被較廣泛提取使用的目的基因有：蘇使用的目的基因有：蘇云金桿菌抗蟲基因、人云金桿菌抗蟲基因、人胰島素基因、人干擾素胰島素基因、人干擾素基因、種子貯藏蛋白基基因、種子貯藏蛋白基因、植物抗病基因等。因、植物抗病基因等。一、目的基因的獲取一、目的基因的獲取目的基因目的基因供體生物細(xì)胞供體生物細(xì)胞取出取出DNADNA限制酶剪去限制酶剪去多余部分多余部分限制酶限制酶1.1.目的基因主要是指目的基因主要是指_編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因2 2、獲取目的基因的常用方法、獲取目的基因的常用方法（1 1）從基因文庫(kù)中獲?。幕?/p>

4、文庫(kù)中獲?。? 2）利用）利用PCRPCR技術(shù)擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增（3 3）人工合成）人工合成1.概念：概念：基因文庫(kù)基因文庫(kù) （gene library）基因組文庫(kù)基因組文庫(kù)部分基因文庫(kù)部分基因文庫(kù)（如（如cDNA文庫(kù)）文庫(kù)） 將含有某種生物不同基因的許多將含有某種生物不同基因的許多DNA片段片段,導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存,各個(gè)受體菌各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因分別含有這種生物的不同的基因,稱為稱為基因基因文庫(kù)文庫(kù)(gene library)基因組文庫(kù)基因組文庫(kù): 基因文庫(kù)中包含了基因文庫(kù)中包含了一種生物所有的基一種生物所有的基因因,這種基因文庫(kù)叫做基因組文庫(kù)這種基因文

5、庫(kù)叫做基因組文庫(kù).部分基因文庫(kù)部分基因文庫(kù): 基因文庫(kù)中包含了基因文庫(kù)中包含了一種生物的一部分一種生物的一部分基因基因,這種基因文庫(kù)叫做部分基因文庫(kù)這種基因文庫(kù)叫做部分基因文庫(kù).基因組文基因組文庫(kù)與部分庫(kù)與部分基因文庫(kù)基因文庫(kù)的關(guān)系的關(guān)系提取某種生物的全部提取某種生物的全部DNADNA用適當(dāng)?shù)南拗泼盖杏眠m當(dāng)?shù)南拗泼盖幸欢ù笮〉囊欢ù笮〉腄NADNA片段片段將將DNADNA片段與載體連接片段與載體連接導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存基因組文庫(kù)基因組文庫(kù)2 2基因文庫(kù)的構(gòu)建方法之一基因文庫(kù)的構(gòu)建方法之一（1 1）直接分離法）直接分離法( (鳥槍法鳥槍法) )某種生物的單鏈某種生物的單鏈mRNAmR

6、NA單鏈互補(bǔ)單鏈互補(bǔ)DNADNA雙鏈雙鏈cDNAcDNA片段片段導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存與載體連接與載體連接cDNAcDNA文庫(kù)文庫(kù)逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶DNADNA聚合酶聚合酶3.如何從基因文庫(kù)中得到所需要的基因？如何從基因文庫(kù)中得到所需要的基因？依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。如：根據(jù)如：根據(jù)基因的核苷酸序列基因的核苷酸序列 基因的功能基因在染色體上的位置基因的功能基因在染色體上的位置 基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA 基因基因的的翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì) 等特性。等特性。4.4.為什么要構(gòu)建基因文庫(kù)？直接從含有目的基因?yàn)槭裁匆獦?gòu)建基因文庫(kù)？直接從含有目的基因

7、的生物體內(nèi)提取不行嗎？的生物體內(nèi)提取不行嗎？ 構(gòu)建基因文庫(kù)是獲取目的基因的方法之一，并不是構(gòu)建基因文庫(kù)是獲取目的基因的方法之一，并不是唯一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可唯一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通過以通過PCRPCR方式從含有該基因的生物的方式從含有該基因的生物的DNADNA中，直接獲中，直接獲得，也可以通過反轉(zhuǎn)錄，用得，也可以通過反轉(zhuǎn)錄，用PCRPCR方式從方式從mRNAmRNA中獲得，中獲得，不一定要構(gòu)建基因文庫(kù)。不一定要構(gòu)建基因文庫(kù)。 但如果但如果所需要的目的基因的序列完全不知所需要的目的基因的序列完全不知，或，或只只知道目的基因序列的一段知道目的基因序

8、列的一段，或，或想從一種生物體內(nèi)獲得想從一種生物體內(nèi)獲得許多基因許多基因，或者，或者想知道這種生物與另一種生物之間有想知道這種生物與另一種生物之間有多少基因不同多少基因不同，或者，或者想知道一種生物在個(gè)體發(fā)育的不想知道一種生物在個(gè)體發(fā)育的不同階段表達(dá)的基因有什么不同同階段表達(dá)的基因有什么不同，或者，或者想得到一種生物想得到一種生物的全基因組序列的全基因組序列，往往就需要構(gòu)建基因文庫(kù)。，往往就需要構(gòu)建基因文庫(kù)。2 2. .利用利用PCRPCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因技術(shù)擴(kuò)增目的基因PCR多多聚聚酶酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 是一項(xiàng)生物是一項(xiàng)生物體外復(fù)制體外復(fù)制特定特定DNA片片段的核酸合成技術(shù)。通過此技術(shù)，可段

9、的核酸合成技術(shù)。通過此技術(shù)，可獲取大量的目的基因。獲取大量的目的基因。PCR技術(shù)技術(shù) 原理：原理： 前提：前提： 原料原料 方式方式PCR擴(kuò)增儀擴(kuò)增儀DNA復(fù)制復(fù)制一段已知目的基因的核苷酸序列一段已知目的基因的核苷酸序列：以：以_方式擴(kuò)增，方式擴(kuò)增， 即即_（n n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）指數(shù)指數(shù)2 2n n模板模板DNA；DNA引物；引物；四種脫氧核苷酸；四種脫氧核苷酸；熱穩(wěn)定熱穩(wěn)定DNA聚合酶（聚合酶（Taq酶）；酶）；離子離子n 過程變性、退火、延伸三步曲變性：加熱至加熱至9095雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA退火：冷卻至冷卻至5560引物與部分部分模板的單鏈DNA的特定互補(bǔ)部

10、位相配對(duì)和結(jié)合延伸：加熱至加熱至7075以目的基因?yàn)槟０?，合成互補(bǔ)的新DNA鏈變性變性退火退火延伸延伸2 2、具體過程、具體過程3. 人工合成人工合成根據(jù)已知的氨基酸序列合成根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA DNA 蛋白質(zhì)的氨基酸序列蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測(cè)推測(cè)推測(cè)推測(cè)目的基因目的基因化學(xué)合成化學(xué)合成質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA分子分子一個(gè)一個(gè)切口切口兩個(gè)兩個(gè)黏性末端黏性末端兩個(gè)兩個(gè)切口切口獲得目的基因獲得目的基因DNA DNA 連接酶連接酶重組重組DNADNA分子（重組質(zhì)粒）分子（重組質(zhì)粒）同一種同一種 限制酶限制酶目的基因

11、與運(yùn)載體的結(jié)合過程，目的基因與運(yùn)載體的結(jié)合過程，實(shí)際上是不同來源的基因重組的實(shí)際上是不同來源的基因重組的過程。過程。目的：目的：組成：組成：1、使目的基因在、使目的基因在受體細(xì)胞受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，中穩(wěn)定存在，且可以遺傳給下一代，且可以遺傳給下一代，2、使目的基因能夠、使目的基因能夠表達(dá)表達(dá)和和發(fā)揮作用發(fā)揮作用。它們各自它們各自的作用是的作用是什么什么?目的基因目的基因+啟動(dòng)子啟動(dòng)子+終止子終止子+標(biāo)記基因標(biāo)記基因+復(fù)制原點(diǎn)復(fù)制原點(diǎn)啟動(dòng)子：?jiǎn)?dòng)子：位于基因的首端的位于基因的首端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片斷，它是片斷，它是RNARNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才

12、能位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出錄出mRNAmRNA，最終獲得蛋白質(zhì)，最終獲得蛋白質(zhì)終止子：終止子：位于基因的尾端的位于基因的尾端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片斷，片斷，能終能終止止mRNAmRNA的轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因標(biāo)記基因的作用是的作用是為了為了鑒別鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來胞篩選出來三、三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（一）轉(zhuǎn)化：（一）轉(zhuǎn)化： （二）方法（二）方法將目的基因?qū)雽⒛康幕驅(qū)胫参锛?xì)胞植物細(xì)胞將目的基因?qū)雽⒛康幕驅(qū)雱?dòng)物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)雽⒛康幕驅(qū)?/p>

13、入微生物細(xì)胞微生物細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法基因槍法花粉管通道法花粉管通道法顯微注射法顯微注射法感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞目的基因進(jìn)入目的基因進(jìn)入_內(nèi)，并且在內(nèi)，并且在 受體細(xì)胞內(nèi)維持受體細(xì)胞內(nèi)維持_和和_的過程的過程受體細(xì)胞受體細(xì)胞穩(wěn)定穩(wěn)定表達(dá)表達(dá)1 1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法：、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法：（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 農(nóng)桿菌特點(diǎn)：農(nóng)桿菌特點(diǎn)：易感染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多易感染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力數(shù)單子葉植物沒有感染能力原理：原理：Ti質(zhì)粒上的質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞到受體細(xì)胞，并整合

14、到受體細(xì)胞染色染色體的體的DNA上上。過程過程：（2）基因槍法基因槍法（3）花粉管通道法花粉管通道法2 2、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞方法：顯微注射法方法：顯微注射法程序：程序：目的基因表達(dá)載體提純目的基因表達(dá)載體提純 取卵（受精卵）取卵（受精卵） 顯微注射顯微注射 受精卵受精卵 新性狀動(dòng)物新性狀動(dòng)物3 3、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞原核生物特點(diǎn)：繁殖快、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)少原核生物特點(diǎn)：繁殖快、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)少方法：方法： 用用Ca2+處理細(xì)胞處理細(xì)胞 感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞 表表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合 感受態(tài)感受態(tài)細(xì)胞吸收細(xì)胞

15、吸收DNA分子分子四、目的基因的檢測(cè)與鑒定四、目的基因的檢測(cè)與鑒定檢查是否成功檢查是否成功（一）、檢測(cè)（一）、檢測(cè)1 1、檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的、檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNADNA上上是否插入是否插入了目的基因了目的基因 ( (關(guān)鍵步驟關(guān)鍵步驟) )首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA用含用含目的基因的目的基因的DNA片段片段用放射性同位素用放射性同位素等作標(biāo)記等作標(biāo)記,以此做以此做探針探針使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯示若顯示出雜交帶出雜交帶,表明染色體已插入染色體表明染色體已插入染色體DNA中中（1）方法方法: :DNADNA分子雜

16、交分子雜交（2）過程）過程:知識(shí)延伸知識(shí)延伸DNADNA分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù) 該方法是根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，把互補(bǔ)的雙鏈該方法是根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，把互補(bǔ)的雙鏈DNA解開，把單股的解開，把單股的DNA小片段用同位素、熒光分子或小片段用同位素、熒光分子或化學(xué)發(fā)光催化劑等進(jìn)行標(biāo)記，之后同被檢測(cè)的化學(xué)發(fā)光催化劑等進(jìn)行標(biāo)記，之后同被檢測(cè)的DNA中的中的同源互補(bǔ)序列雜交，從而檢出所要查明的同源互補(bǔ)序列雜交，從而檢出所要查明的DNA或基因?；蚧?。歸納步驟（二）、鑒定（個(gè)體生物學(xué)水平）（二）、鑒定（個(gè)體生物學(xué)水平）2 2、檢測(cè)目的基因、檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了是否轉(zhuǎn)錄出了mRNAmRNA3 3、檢測(cè)

17、目的基因、檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法方法: :分分 子子 雜雜 交交方法方法: :抗原抗體雜交抗原抗體雜交過程過程: 用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交雜交,若出現(xiàn)雜交帶若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA歸納步驟( (四四) )目的基因的檢測(cè)與鑒定目的基因的檢測(cè)與鑒定檢查是否成功檢查是否成功檢測(cè)檢測(cè)鑒定鑒定檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNAmRNA檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法方法方法方法方法方法DNADNA分子雜交分子雜交分子雜交（