細胞中蛋白提取及含量測定

1、蛋白提取及含量測定試劑準備1.74mg/ml (10mmol/L)PMSF PMSF 0.174g 異丙醇 100ml溶解后，分裝于1.5ml離心管中，20保存單去污劑裂解液（50mmol/L Tris·HCl pH8.0，150mmol/L NaCl，1TritonX100，100mg/ml PMSF）： 1mol/L Tris·HCl（pH8.0） 2.5mlNaCl 0.438gTritonX100 0.5ml蒸餾水至 50ml 混勻后， 4保存。使用時，加入PMSF至終濃度為100mg/ml（0.87ml裂解液加入1.74mg/ml PMSF50l）。G250考馬斯

2、亮藍溶液（測蛋白含量專用） 考馬斯亮藍G250： 100mg 95乙醇： 50ml 磷酸： 100ml 蒸餾水至 1000ml 配制時，先用乙醇溶解考馬斯亮藍染料，再加入磷酸與水，混勻后，用濾紙過濾，4保存。0.15 mol/L NaCl NaCl（MW58.44） 0.877g 蒸餾水至 100 ml高溫滅菌后，室溫保存。100mg/ml 牛血清白蛋白（BSA） BSA 0.1g 0.15 mol/L NaCl 1ml溶解后，20保存。制作蛋白標準曲線時，用0.15 mol/L NaCl進行100倍稀釋成1mg/ml，20保存。操作步驟：（一）   蛋白樣品制備（1）&#

3、160;        單層貼壁細胞總蛋白的提?。?、   倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液（或將瓶直立放置一會兒使殘余培養(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）。2、   每瓶細胞加3ml 4預冷的PBS（0.01M pH7.27.3）。平放輕輕搖動1min洗滌細胞，然后棄去洗液。重復以上操作兩次，共洗細胞三次以洗去培養(yǎng)液。將PBS棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。3、   按1ml裂解液加10 ml PMSF（100mM），搖勻置于冰上。（PMSF要搖勻至無

4、結晶時才可與裂解液混合。）4、   每瓶細胞加400 ml含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，為使細胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回搖動。5、   裂解完后，用干凈的刮棒將細胞刮于培養(yǎng)瓶的一側（動作要快），然后用槍將細胞碎片與裂解液移至1.5ml離心管中。（整個操作盡量在冰上進行。）6、   于4下12000rpm離心5min。（提前開離心機預冷）7、將離心后的上清分裝轉移倒0.5min的離心管中放于20保存。（2）    組織中總蛋白的提?。?、將少量組織塊置于12ml勻漿器中球狀部位（或者在1.5ml

5、離心管中加入少量裂解液，將其剪碎），用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎。2、加400 ml(250ul)單去污劑裂解液裂（含PMSF）于勻漿器中，置于冰上進行勻漿。3、幾分鐘后再碾一會兒再置于冰上，要重復碾幾次使組織盡量碾碎。4、裂解30 min后，即可用移液器將裂解液移至1.5ml離心管中，然后在4下12000rpm離心5min，取上清分裝于0.5ml離心管中并置于20或70保存。（3）         加藥物處理的貼壁細胞總蛋白的提?。河捎谑芩幬锏挠绊?，一些細胞脫落下來，所以除按（一）操作外還應收集培養(yǎng)液中的細胞。以

6、下是培養(yǎng)液中細胞總蛋白的提取：1、   將培養(yǎng)液倒至15ml離心管中，于2500rpm離心5min。2、   棄上清，加入4ml PBS并用槍輕輕吹打洗滌，然后2500rpm離心5min。棄上清后用PBS重復洗滌一次。3、   用槍洗干上清后，加100 ml裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解過程中要經(jīng)常彈一彈以使細胞充分裂解。4、 將裂解液與培養(yǎng)瓶中裂解液混在一起4、12000rpm離心5min，取上清分裝于0.5ml離心管中并置于20保存。（二）   蛋白含量的測定（1）  

7、0; 制作標準曲線1、從20取出1mg/ml BSA，室溫融化后，備用。2、取18個1.5ml離心管，3個一組，分別標記為0mg，2.5mg，5.0mg ，10.0mg ，20.0mg ，40.0mg。3、按下表在各管中加入各種試劑。0mg2.5mg5.0mg10.0mg20.0mg40.0mg1mg/ml BSA2.5ml5.0ml10.0ml20.0ml40.0ml0.15mol/L NaCl100ml97.5ml95.0ml90.0ml80.0ml60.0mlG250考馬斯亮藍溶液1ml1ml1ml1ml1ml1ml4、混勻后，室溫放置2min。在生物分光光度計（BioPhotometer，Eppentoff）上比色分析。（2）    檢測樣品蛋白含量1、取足量的1.5ml離心管，每管加入4儲存的考馬斯亮藍溶液1ml。室溫放置30min后即可用于測蛋白。2、取一管考馬斯亮藍加0.15mol/L NaCl溶液100 ml，混勻放置2分鐘可做為空白樣品，將空白倒入比色杯中在做好標準曲線的程序下按blank測空白樣品。3、棄空白樣品，用無水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5ml），再用無菌水洗一次。4、取一管考馬斯亮藍加95 ml 0.15mol/L NaCl Na