細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)復(fù)習(xí)

1、實(shí)驗(yàn)一、細(xì)胞膜的滲透性1. 細(xì)胞膜具有對物質(zhì)選擇透過的生理功能。脂溶性越高通透性越大，水溶性越高通透性越?。环菢O性分子比極性容易透過，小分子比大分子容易透過。水分子可通過由膜脂運(yùn)動(dòng)而產(chǎn)生的間隙。非極性的小分子如O2、CO2、N2可以很快透過脂雙層，不帶電荷的極性小分子，如尿素、甘油等也可以透過人工脂雙層，盡管速度較慢，分子量略大一點(diǎn)的葡萄糖、蔗糖則很難透過，而膜對帶電荷的物質(zhì)如：H+、Na+、K+、Cl、HCO3 是高度不通透的。2.hemolysis（溶血現(xiàn)象）：滲入紅細(xì)胞的溶質(zhì)能提高紅細(xì)胞的滲透壓，使水進(jìn)入細(xì)胞，引起細(xì)胞吸水脹破；即紅細(xì)胞膜破裂，血紅蛋白從紅細(xì)胞中逸出的現(xiàn)象稱為溶血現(xiàn)象。3

2、.isotonic solution（等滲溶液）：滲透壓與血漿滲透壓相等的溶液稱為等滲溶液。4.Hypertonic solution（高滲溶液）：滲透壓高于血漿滲透壓的溶液稱為高滲液。5.Hypotonic solution（低滲溶液）：滲透壓低于血漿滲透壓的溶液稱為低滲溶液。6.semipermeable（半透性）：膜或膜狀結(jié)構(gòu)只允許溶劑(通常是水)或部分溶質(zhì)(一般為小分子物質(zhì))透過，而不允許其他溶質(zhì)(一般為大分子物質(zhì))透過的特性。 7.osmosis（滲透作用）：膜兩側(cè)溶液濃度存在差異，造成化學(xué)勢能差，在勢能差的驅(qū)動(dòng)下，溶劑穿過對溶質(zhì)不透膜的過程。一、 實(shí)驗(yàn)材料及作用：150 mmol/

3、L NaCl , 蒸餾水，5 mmol/L NaCl，65 mmol/L NaCl，0.8 mol/L甲醇，0.8 mol/L乙醇，0.8 mol/L丙醇，0.8 mol/L乙二醇，0.8 mol/L丙三醇，2%Triton X-100，氯仿(三氯甲烷)。1.NaCl的作用：將正常紅細(xì)胞懸浮于不同濃度的NaCI溶液中：等滲溶液中的紅細(xì)胞保持正常大小與雙凹圓碟形；滲透壓遞減的一系列溶液中，紅細(xì)胞逐步脹大并雙側(cè)凸起，當(dāng)體積增加30%時(shí)成為球形；體積增加45%60%則細(xì)胞膜損傷而發(fā)生溶血，這時(shí)血紅蛋白逸出細(xì)胞外，僅留下一個(gè)雙凹圓碟形細(xì)胞膜空殼，稱為血影細(xì)胞（ghost cell）。正常人的紅細(xì)胞一般

4、在0.42%NaCI溶液中時(shí)開始出 現(xiàn)溶血,在0.35%NaCI溶液中時(shí)完全溶血. 2.甲醇：小分子、親脂性的非極性分子甲醇為低滲溶液，容易溶解于脂雙層，并迅速透過，提高紅細(xì)胞的滲透壓，促使水分進(jìn)入細(xì)胞，引起溶血。3. 乙醇：乙醇是脂溶性小分子，可以自由擴(kuò)散進(jìn)出細(xì)胞。紅細(xì)胞外有相對高濃度的乙醇，大量乙醇分子順濃度差進(jìn)入紅細(xì)胞，使紅細(xì)胞內(nèi)滲透壓高于紅細(xì)胞外滲透壓，水通道開放，大量水分子進(jìn)入紅細(xì)胞，發(fā)生溶血。4. 丙醇，丙二醇，丙三醇的作用與甲醇，乙醇的作用相似，都是脂溶性分子，隨著分子量的增加，分子的增大，溶血時(shí)間增加。5. 去垢劑是一些具有親水的極性基團(tuán)與疏水的非極性基團(tuán)的長鏈分子。非離子型去

5、垢劑如TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)可與脂雙層形成混合微團(tuán)，它們主要與蛋白質(zhì)疏水部位相互作用，一般不會(huì)引起蛋白質(zhì)變性。而離子型去垢劑與蛋白結(jié)合后可改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，使之變性，尤其是加熱后可使蛋白質(zhì)解離為單體，如十二烷基磺酸鈉（SDS）等。多種去污劑可以溶解細(xì)胞膜上的磷脂化合物，從而使細(xì)胞膜破裂，釋放出細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)。6.氯仿：氯仿是很好的脂類萃取劑，不能夠發(fā)生溶血現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)二、植物細(xì)胞的胞吞作用與內(nèi)膜系統(tǒng)的熒光顯微觀察分析及抑制恢復(fù)： 疊氮化鈉可抑制呼吸作用，從而阻斷能量供應(yīng)，但是沒有發(fā)生溶血抑制，說明水孔蛋白不需要提供能量。 水通道蛋白對水的通透性受氯化汞的可逆性抑制,對汞的敏感位點(diǎn)

6、是結(jié)構(gòu)域5與6之間的189位的半胱氨酸。氯化汞到達(dá)一定的濃度時(shí)就可以抑制水的通透性，從而抑制溶血現(xiàn)象的產(chǎn)生。水通道蛋白對氯化汞的敏感位點(diǎn)是結(jié)構(gòu)域5與6之間的189位的半胱氨酸。半胱氨酸含有巰基，而-巰基乙醇能消除氯化汞對水孔蛋白的抑制作用。因?yàn)?巰基乙醇可以修復(fù)被氯化汞破壞的巰基，從而是水順利通過。1、細(xì)胞伸長生長所需要的物質(zhì)分別在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(如蛋白質(zhì)、脂類)與高爾基體(細(xì)胞壁的一些組分，如果膠、半纖維素)合成，運(yùn)輸小泡通過胞吐作用分泌至胞外或質(zhì)膜上，促進(jìn)新的細(xì)胞膜與細(xì)胞壁的生長。2、在細(xì)胞擴(kuò)展增長過程中一些過剩的蛋白質(zhì)、多糖、細(xì)胞壁前體物質(zhì)等細(xì)胞成分，需要通過胞吞作用重新回到胞質(zhì)中使之得以及時(shí)回

7、收，循環(huán)利用，即細(xì)胞的內(nèi)吞與外排兩個(gè)過程保持基本的相對平衡。3、在整個(gè)膜泡吞排作用中，必須有能量的保證。4、內(nèi)膜系統(tǒng)是指內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、囊泡、溶酶體與液泡等細(xì)胞器與質(zhì)膜。這些細(xì)胞器的膜是相互流動(dòng)的, 處于動(dòng)態(tài)平衡, 在功能上也是相互協(xié)同的。1、 實(shí)驗(yàn)材料：1、 水稻懸浮細(xì)胞：非極性生長，生長速度慢。2、 FM4-64染料：是一種膜染料，水溶性的苯乙烯類復(fù)合物，對細(xì)胞無毒性作用，能與質(zhì)膜及內(nèi)膜細(xì)胞器特異結(jié)合后發(fā)出高強(qiáng)度的熒光。FM4-64由一條親脂的尾部與一個(gè)帶正電荷的頭部經(jīng)雙鍵相連而成的，親脂尾部可以插入脂雙層的外葉中，而頭部則阻止其進(jìn)一步穿越脂雙層，需要借助胞吞作用才能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。FM4-

8、64在水相中沒有熒光，只有插入脂質(zhì)生物膜后才顯示較強(qiáng)的熒光，胞吞回收的囊泡因吞進(jìn)細(xì)胞內(nèi)部而被熒光標(biāo)記，利用這種熒光探針能夠?qū)?xì)胞的胞吞過程進(jìn)行有效標(biāo)記。3、 疊氮化鈉：抑制細(xì)胞的內(nèi)吞作用。它能夠抑制細(xì)胞色素氧化酶與其他酶活性，由于細(xì)胞的內(nèi)吞作用是一個(gè)耗能的過程，所以疊氮化鈉能夠通過切斷能量供應(yīng)來抑制內(nèi)吞作用。4、 ER-Tracker Blue-White：是Dapoxyl 染料中的一種，它的主要成分是格列本脲，是一種糖尿病患者每日降低血糖的藥物。也被用于研究胰腺B-細(xì)胞活性與胰島素分泌與研究心肌細(xì)胞功能與心律不齊。格列本脲連接到ATP-敏感 K+通道的磺脲受體，這個(gè)受體主要在ER上。能夠?qū)?nèi)

9、質(zhì)網(wǎng)染色。5、山梨醇：為高滲溶液，能夠誘發(fā)質(zhì)壁分離。1）FM4-64染料可以進(jìn)行什么生理過程及細(xì)胞器的標(biāo)記？答：FM4-64染料可以對細(xì)胞膜系統(tǒng)進(jìn)行熒光染色，所以凡是與膜系統(tǒng)相關(guān)的生理過程及細(xì)胞器都可以用FM4-64染料染色。例如：光合作用，呼吸作用，內(nèi)吞外排作用，細(xì)胞的分泌作用等等 細(xì)胞器：葉綠體，線粒體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，細(xì)胞膜，高爾基體等。2） 你在實(shí)驗(yàn)過程中看到的山梨醇預(yù)處理及疊氮化鈉預(yù)處理后再染色的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象有何不同，為什么？答：山梨醇預(yù)處理后，可觀察到質(zhì)壁分離現(xiàn)象，并且細(xì)胞壁上沒有熒光染色，從而證明染色發(fā)生在細(xì)胞膜上。但是細(xì)胞內(nèi)部也有染色現(xiàn)象。 疊氮化鈉預(yù)處理后，沒有發(fā)生質(zhì)壁分離，細(xì)胞膜被染色

10、，但是細(xì)胞內(nèi)部幾乎沒有熒光染色。 這是因?yàn)樯嚼娲际歉邼B溶液，可以使細(xì)胞發(fā)生質(zhì)壁分離現(xiàn)象，而疊氮化鈉可以阻止細(xì)胞的內(nèi)吞作用。二者的作用機(jī)理不同，所以實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象也不同。實(shí)驗(yàn)三、原生質(zhì)體的制備及基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)化與分選觀察1.植物原生質(zhì)體是除去細(xì)胞壁的被質(zhì)膜所包圍的裸露細(xì)胞。用酶解法脫去細(xì)胞壁的原生質(zhì)體在合適的離體培養(yǎng)條件下具有繁殖、分化、再生成為完整植物的能力。利用原生質(zhì)體可開展因細(xì)胞壁存在而難以進(jìn)行研究的問題，如質(zhì)膜的表面特性，細(xì)胞壁的形成、細(xì)胞器的提取，體細(xì)胞的雜交，也適于作為基因工程的良好受體系統(tǒng)，通過基因轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因植物。植物原生質(zhì)體是細(xì)胞水平生的一種良好的研究系統(tǒng)。2.質(zhì)膜蛋白分選：蛋白質(zhì)的分

11、選有翻譯后轉(zhuǎn)運(yùn)與共翻譯轉(zhuǎn)運(yùn)兩種類型。質(zhì)膜蛋白的分選屬于后者。首先在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)合成的質(zhì)膜蛋白通過跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成后轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體，最終通過膜泡運(yùn)輸?shù)姆绞椒诌x至質(zhì)膜。綠色熒光蛋白的特性：是一種能夠自身催化形成發(fā)色結(jié)構(gòu)，并在藍(lán)光或紫光的激發(fā)下發(fā)出熒光的新型報(bào)告基因。3.綠色熒光蛋白GFP是一種能夠自身催化形成發(fā)色結(jié)構(gòu)，并在藍(lán)光或紫光的激發(fā)下發(fā)出熒光的新型報(bào)告基因。GFP之所以能夠產(chǎn)生綠色熒光是由于其蛋白質(zhì)分子多肽鏈內(nèi)含有特殊的生色團(tuán)，即第65-67位氨基酸ser-Tyr-Gly鏈，他們在氧氣的參與下自身環(huán)化與周圍其他三個(gè)氨基酸形成六肽生色團(tuán)。晶體結(jié)構(gòu)分析，GFP分子為致密管狀，由

12、周圍11個(gè)折疊片圍繞中央一個(gè)螺旋構(gòu)成，其生色團(tuán)即包含在該中央螺旋結(jié)構(gòu)種。GFP蛋白非常穩(wěn)定。其光譜性質(zhì)一般不受變性溶液的影響。4.利用GFP的熒光特性對某一蛋白質(zhì)的N端或C端進(jìn)行標(biāo)記，然后借助熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡便可以對標(biāo)記的蛋白質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞活體觀察。標(biāo)記過程是利用常規(guī)的DNA重組技術(shù)將GFP基因與目的蛋白基因的編碼區(qū)連接形成一個(gè)單一的融合基因表達(dá)載體，然后將這一重組表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞，使融合蛋白得到瞬時(shí)或穩(wěn)定表達(dá)，通過檢測這些GFP的熒光來測定這些蛋白質(zhì)的位置。1、 實(shí)驗(yàn)材料及作用：大腸桿菌菌液，水稻懸浮細(xì)胞原生質(zhì)體，轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，各種試劑1.酶解液：去除水稻細(xì)胞的細(xì)胞壁，使其成為原生質(zhì)體。2.

13、Solution I：含有葡萄糖，Tris，EDTA。 其中葡萄糖可以增加粘度，防止DNA受機(jī)械作用而斷裂 Tris起緩沖作用，穩(wěn)定pH EDTA是鰲合金屬離子，抑制DNase，防止DNA降解3.Solution II：含有SDS，NaOH（pH12.6） 其中SDS是離子型表面活性劑，去污劑 NaOH（pH12.6）：使核酸變性4.Solution III：含有KAc：（pH4.8），可中與復(fù)性，使質(zhì)粒DNA復(fù)性，但染色體由于分子量大，復(fù)性所需時(shí)間長，所以在10min左右內(nèi)質(zhì)粒復(fù)性，為可溶狀態(tài)，而染色體則為沉淀；K與SDS、蛋白質(zhì)與膜形成溶解度小的復(fù)合物。5.Buffer GPS ：是OME

14、GA Bio-Tek公司研發(fā)的硅膠柱平衡緩沖液。HiBind DNA 結(jié)合柱子（硅膠柱）經(jīng)Buffer GPS預(yù)處理后，可大大減少柱子中硅膠膜的疏水基團(tuán)，提高核酸的結(jié)合能力。柱子在長期放置過程中，會(huì)同空氣中的電荷/塵埃等發(fā)生反應(yīng)而影響其核酸的結(jié)合能力。Buffer GPS對長期放置的柱子，甚至已經(jīng)變壞的柱子都有著非常顯著的效果，可大大提高其結(jié)合效率。6.Wash buffer: 主要成分是乙醇，用來清洗柱子。7.Elution Buffer：洗脫質(zhì)粒。8.PEG solution：PEG(聚乙二醇)為高分子聚合物。細(xì)胞粘合及擾亂細(xì)胞膜磷脂雙分子層作用?？墒笵NA與膜形成分子橋，促使相互間接觸與

15、粘連?？筛淖兗?xì)胞膜結(jié)構(gòu)，是磷脂分子發(fā)生疏散，進(jìn)而使其結(jié)構(gòu)發(fā)生重排。最佳PH8.0-8.2之間。引起膜表面電荷紊亂，干擾細(xì)胞識別，有利于細(xì)胞膜間融合與外緣DNA進(jìn)入原生質(zhì)體。9.W5:洗液,洗去各種酶解液.10.Incubation buffer:孵育buffer。使細(xì)胞在更好的環(huán)境中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)四 核酸(DNA and RNA)的細(xì)胞核定位觀察1.Unna染色法原理：核酸是酸性的，它們對于堿性染料具有親與力，但是DNA與 RNA對甲基綠-派洛寧混合染料的親與力不同，而使這兩種染料對兩類核酸具有了選擇性。DNA被甲基綠染成綠色，RNA被派洛寧染成紅色，這樣就能使細(xì)胞中兩種核酸分布顯示出來?！緦?shí)驗(yàn)材

16、料及作用】實(shí)驗(yàn)材料：洋蔥鱗莖表皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)試劑：（1） Carnoy固定液：無水乙醇：冰乙酸（3：1） ：固定液的重要特性是能迅速穿透細(xì)胞，將其固定并維持染色體結(jié)構(gòu)的完整性，還要能夠增強(qiáng)染色體的嗜堿性，達(dá)到優(yōu)良染色效果。單純的固定液一般難以達(dá)到這些要求，因此在實(shí)驗(yàn)中使用兩種混合的固定液。由于Carnoy首先使用的甲醇與冰乙酸混合液而稱其為卡諾氏固定液。Carnoy固定液（甲醇冰乙酸=31）每次使用前需臨時(shí)配制，長時(shí)間放置影響固定效果，固定時(shí)間15min至24h，冰箱、室溫均可。必要時(shí)可改變甲醇與冰乙酸的比例，冰乙酸比例增加，利于細(xì)胞膨脹、染色體鋪展，但易導(dǎo)致細(xì)胞破裂、染色體散失。（2） 95%乙

17、醇與70%乙醇與H2O：濃度由高到低，緩慢使細(xì)胞復(fù)水，防止一次復(fù)水效果不好。（3） 5%的三氯乙酸（TCA）：蛋白質(zhì)沉淀劑與顯微樣品固定劑。（4） Unna染液:DNA與 RNA對甲基綠-派洛寧混合染料的親與力不同，而使這兩種染料對兩類核酸具有了選擇性。DNA被甲基綠染成綠色，RNA被派洛寧染成紅色，這樣就能使細(xì)胞中兩種核酸分布顯示出來。（5） 丙酮：分色劑。能夠使強(qiáng)染色褪色，達(dá)到分色的目的。實(shí)驗(yàn)五、離心技術(shù)與細(xì)胞器的分離1.離心技術(shù)（centrifugal technique）是根據(jù)顆粒在受到外向的離心力后而沉淀一種分離技術(shù)。2.差速離心法 （differential velocity ce

18、ntrifugation）采用逐漸增加離心速度或低速與高速交替進(jìn)行離心，使沉降速度不同的顆粒在不同的分離速度及不同的離心時(shí)間下分批分離的方法，稱為差速離心法。常用于從組織勻漿中分離各種細(xì)胞器。3.等密度梯度離心(isodensity / isopycnic centrifugation）原理：當(dāng)不同顆粒存在浮力密度差時(shí)，在離心力場下，在密度梯度介質(zhì)中，顆?；蛳蛳鲁两?，或向上浮起，一直移動(dòng)到與它們各自的密度恰好相等的位置，在這里顆粒沒有重量，不管離心多長時(shí)間，它們再也不移動(dòng)了，形成一系列密度區(qū)。從而使不同浮力密度的物質(zhì)得到分離。 等密度梯度離心一般常用CsCl、蔗糖、甘油等做介質(zhì)。此法一般應(yīng)用于

19、物質(zhì)的大小相近，而密度差異較大時(shí)。常用來分離提取核酸、亞細(xì)胞器與質(zhì)粒。 4.細(xì)胞與細(xì)胞器在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)足夠大的離心力或足夠長的時(shí)間沉降或漂浮到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在那里達(dá)到平衡，從而將不同密度的細(xì)胞或細(xì)胞器分離。通過離心后的分層情況可以發(fā)現(xiàn)，30% percoll CSK buffer的等密度梯度層中是細(xì)胞核，60%percoll CSK buffer的等密度梯度層中是葉綠體，而且由于重力原因，葉綠體大部分存在與密度梯度層的最底端。實(shí)驗(yàn)六 細(xì)胞骨架的顯微觀察適當(dāng)濃度的Triton X-100可使膜蛋白溶解下來并保持活性，胞質(zhì)中可溶性成分隨之流失，而細(xì)胞骨架成分在該試劑作用下能相對穩(wěn)定存在，保留下來。M緩沖液 與磷酸緩沖液維持適宜的細(xì)胞滲透壓、離子濃度及酸堿度pH，起到緩沖調(diào)節(jié)與平衡作用；EDTA可螯合大部分金屬離子；EGTA專一性螯合Ca2，主要是高濃度的Ca2可使骨架解聚，因此加入EGTA來降低Ca2的濃度 ，維持細(xì)胞骨架的聚合狀態(tài)；戊二醇是良好的固定劑，對細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)有活躍的親與力，能迅速殺死細(xì)胞，并很好的保存它原有細(xì)微結(jié)構(gòu)與某些酶的活性；考馬斯亮藍(lán)非專一性結(jié)合蛋白質(zhì)，使蛋白著色（藍(lán)色）?！緦?shí)驗(yàn)材料及作用】 1. 洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞，人口腔上皮細(xì)胞 2.M緩沖液與磷酸緩沖液：維持適宜的細(xì)胞滲透壓、離子濃度及酸堿度pH，起到緩沖調(diào)節(jié)與平衡