秀麗線蟲綜述PPT學習教案

1、會計學1秀麗線蟲綜述秀麗線蟲綜述第1頁/共25頁第2頁/共25頁第3頁/共25頁第4頁/共25頁第5頁/共25頁第6頁/共25頁第7頁/共25頁顯微注射技術(shù)是線蟲研究領(lǐng)域的常用技術(shù)，對線蟲進行轉(zhuǎn)基因操作的一種高效且相對簡單的方法，主 要用于研究線蟲突變種系的功能恢復(fù)(mutant rescue)、特定基因的過表達或異位表達、標 簽 蛋白的 表達、特 定 蛋白 質(zhì) 結(jié)構(gòu)域的功 能、DNA 或 RNA 調(diào)節(jié)元件的分析及 RNA 干擾等 此外，這項轉(zhuǎn)基因技術(shù)對于特異表型的篩選也是個強有 力 的 工具 ， 并 且 它還 可 用于 將人 工 合 成 mRNAs 或其他分子接引入細胞第8頁/共25頁第9頁

2、/共25頁第10頁/共25頁制劑及破針制劑及破針固定蟲固定蟲將純化的將純化的 DNA 溶解在溶解在 Tris-EDTA(TE)緩沖液中即可接用緩沖液中即可接用于注射。在注射液中加入終于注射。在注射液中加入終濃濃度約度約 10 mg/L 的線蟲基因組的線蟲基因組 DNA，則會有效地提高轉(zhuǎn)基，則會有效地提高轉(zhuǎn)基因效率。因效率。將一小玻片放在加了注射油將一小玻片放在加了注射油的固定墊上，操縱微操使注的固定墊上，操縱微操使注射針與玻片邊緣相撞，若針射針與玻片邊緣相撞，若針頭尖端撞破，可觀察到有液頭尖端撞破，可觀察到有液泡自動滲出泡自動滲出注射時將注射時將線蟲挑至線蟲挑至瓊脂糖固瓊脂糖固定墊上，定墊上，

3、調(diào)整線蟲調(diào)整線蟲使性腺暴使性腺暴露，滴加露，滴加注射油覆注射油覆蓋整個蟲蓋整個蟲體體 固定固定好后的操好后的操作要迅速，作要迅速，否則線蟲否則線蟲容易脫水容易脫水而死而死將瓊脂糖固定墊放將瓊脂糖固定墊放在載物臺上，在載物臺上，40 x物鏡下找到線蟲，物鏡下找到線蟲，使性腺聚焦在正確使性腺聚焦在正確的平面的平面 操作微操操作微操或輕移滑動載物臺，或輕移滑動載物臺，將注射針尖刺入性將注射針尖刺入性腺腺 啟動微量加壓啟動微量加壓器進行注射，能觀器進行注射，能觀察到注射液在性腺察到注射液在性腺中快速流動，注射中快速流動，注射后的性腺被液體充后的性腺被液體充滿滿在體視顯微鏡下，在體視顯微鏡下，滴加恢復(fù)緩

4、沖液至滴加恢復(fù)緩沖液至注射后的線蟲正上注射后的線蟲正上方，由于與油互不方，由于與油互不相溶，緩沖液會滲相溶，緩沖液會滲入油下使線蟲浮入油下使線蟲浮起起 一般等待一般等待 2 5 min，線蟲活力，線蟲活力恢復(fù)，身體開始游恢復(fù)，身體開始游動，即可挑至培養(yǎng)動，即可挑至培養(yǎng)板上，板上，20 常規(guī)常規(guī)培養(yǎng)培養(yǎng)注射注射恢復(fù)恢復(fù)第11頁/共25頁第12頁/共25頁5.8 g Na2HPO4， 3.0 g KH2PO4，0.5 g NaCl， 1.0gNH4Cl加水至 1L，高壓滅菌，用于注射后線蟲的恢復(fù)第13頁/共25頁第14頁/共25頁注射后約 3 天，觀察孵出的 F1 代是否有目的DNA 表達 目前，

5、線蟲外源基因表達的標記通常用：a 熒光蛋白與目的蛋白形成融合蛋白，但熒光蛋白與目的蛋白形成融合蛋白，但需要確定熒光蛋白的連接不影響目的蛋白的功能；需要確定熒光蛋白的連接不影響目的蛋白的功能；b 目的基因與熒光標記基因共注射；目的基因與熒光標記基因共注射；c 目的基因目的基因與具有明顯表型的標記基因共注射，與具有明顯表型的標記基因共注射，我們通常使用易觀察的 pmyo-3:TDimer II作為熒光標記，它在所有體壁肌肉細胞表達，轉(zhuǎn)基因效率高且本身對線蟲的行為 和功能沒有 影響。第15頁/共25頁第16頁/共25頁TMP/UV 整合無需 酌 或 X 射線源，可在普通實 驗室 進 行 誘 變 劑

6、TMP (Trioxsalen 或 4,5憶 ,8-Trimethylpsoralen, 三甲基補骨脂素)，劇毒，避光，對其操作都需避光進行 TMP/UV 的處理可使線蟲 DNA 發(fā)生隨機斷裂，從而使染色體外的 DNA片段整合至染色體上 TMP/UV 整合法的流程為：a 用 M9 緩沖液將同步好的 L4 齡線蟲從培養(yǎng)板中清洗下來，加 TMP(溶于 DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配，存于-80 )使其終濃度為 50 mg/L b 室溫下輕柔振蕩15 min，將線蟲轉(zhuǎn)至未鋪菌的 9 cm 培養(yǎng)板上紫外線照射，照射能量為 35 000 滋J/cm2，換算成瞬時功率即 350 滋W/cm2, 100s c 照射完畢

7、后，在培養(yǎng)板上加大腸桿菌 OP50，室避光培養(yǎng) 5h，使線蟲活力恢復(fù) d 挑取 15 25 只狀態(tài)較好的 P0 代個體，每板 1 只，等待大腸桿菌被吃完，挑 100300 只 F2 代，每板 1 只，觀察 F4 代是否全部表達注射 DNA 根據(jù)我們的經(jīng)驗，如果經(jīng)紫外線照射后，后代出現(xiàn)很多具有短粗、致死表型的線蟲，甚至 1/4 沒有后代，則預(yù)示整合成功 整合成功的標準是 F4 代全部表達目的基因，若沒有，一般沒必繼續(xù)篩選，可認為該克隆的整合不成功第17頁/共25頁細胞程序性死亡的遺傳調(diào)控機制 現(xiàn)階段研究已發(fā)現(xiàn)了十幾個控制細胞凋亡的基因，這些凋亡基因之間通過遺傳相互作用組成一條線性的調(diào)控途徑控制細

8、胞程序性死亡，包括凋亡的激活階段、凋亡的起始 、凋亡細胞的清除及凋亡細胞內(nèi)部的 DNA 降解第18頁/共25頁線蟲PCA關(guān)鍵階段EGL-1：促凋亡蛋白，屬BCl2蛋白家族，與哺乳動物BAD、BIK/NBK及HRK同源CED-9:抗凋亡蛋白,與人體bcl-2同源CED-4:促凋亡蛋白,同源體為Apaf-1CED-3:凋亡蛋白,與ICE(caspase家族)同源第19頁/共25頁低氧應(yīng)答模式生物低氧能夠引起秀麗線蟲發(fā)生相應(yīng)的生理和行為學變化，并可保護機體免受缺氧損傷。秀麗線蟲的低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)的恒定性調(diào)控通路和人類的相應(yīng)通路之間具有高度保守性，因此秀麗線蟲也已成為研究低氧應(yīng)答調(diào)控通路進化

9、保守性的重要工具之一。闡明秀麗線蟲的低氧應(yīng)答機制將為了解人類低氧相關(guān)疾病的發(fā)病機制提供有價值的線索。第20頁/共25頁相關(guān)機制低氧環(huán)境秀麗線蟲的非HIF一1介導(dǎo)的低氧應(yīng)答通路秀麗線蟲的氧感知神經(jīng)回路胰島素胰島素樣受體DAF-2通路熱休克蛋白及其它秀麗線蟲中低氧誘導(dǎo)因子HIF1介導(dǎo)的低氧應(yīng)答第21頁/共25頁m i R N A 作用機制的研究首個時序調(diào)控的miRNA 基因 lin-4發(fā)現(xiàn)于線蟲，轉(zhuǎn)錄后形成兩種長度的RNA，較小的一個與基因lin-14的mRNA互補配對阻礙其翻譯，隨后又發(fā)現(xiàn)了類似作用的let-7.通過研究miRNA在線蟲細胞內(nèi)對于靶基因翻譯表達的阻礙作用，為疾病治療提供新手段，特別是探究其對RNA病毒侵染的抑制作用第22頁/共25頁其他方面 衰老和壽命控制機制衰老和壽命控制機制DAF-16 蛋白可以轉(zhuǎn)運到細胞核中激活靶基因轉(zhuǎn)錄時 線蟲的壽命就可延長 反之則縮短 藥物篩選藥物篩選基于秀麗線蟲與人在多種生命活動調(diào)控機制上的相似性 可以用秀麗線蟲為動物模型進行藥物篩選 RNAI機