自由基的檢測

1、自由基檢測方法自由基檢測方法文趙寶洪1,高洪1收稿日期：20070430 作者簡介：趙寶洪(1982 -),男，云南紅河州人，碩士研究生，主要從事獸醫(yī)分子病理學(xué)與比較病理學(xué)研究(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明650201 ; 2.海關(guān)總署緝私局瑞麗緝毒犬基地,云南瑞麗 678600)摘 要：自由基是含有未成對電子的原子、 分子或原子團(tuán)，它是線粒體在電子傳 遞的過程中產(chǎn)生的，正常情況下，機(jī)體的自由基活除系統(tǒng)可使自由基的產(chǎn)生與消 除保持在極低的動態(tài)平衡水平上，對機(jī)體是有利的，但當(dāng)體內(nèi)蓄積過量自由基時， 它能損傷細(xì)胞，導(dǎo)致動物組織或細(xì)胞的氧化，損害細(xì)胞膜上的脂類和蛋白質(zhì)等， 從而使細(xì)胞膜

2、黏度增加，流動性下降，抗氧化酶喪失活性，造成膜內(nèi)外離子交換 紊亂等，致使細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載，黃喋吟氧化酶活性升高，乂進(jìn)一步加速自由基 的產(chǎn)生。為提高自由基對動物機(jī)體損傷的診斷效率， 近年來自由基檢測方法在病 理學(xué)、生物學(xué)中發(fā)展迅速，并得到了廣泛應(yīng)用。關(guān)鍵詞：自由基；檢測方法；概述自由基(free radicals, FRs)化學(xué)反應(yīng)性極強(qiáng)，極不穩(wěn)定，半衰期短，其化學(xué) 反應(yīng)性的特點是連鎖反應(yīng)，一經(jīng)啟動即可連續(xù)發(fā)生。從生物學(xué)角度講，通常所說 的FRs主要是指活性氧(active oxygen),即氧的某些代謝產(chǎn)物和一些反應(yīng)的含氧 產(chǎn)物。由丁 FRs具有活潑的化學(xué)反應(yīng)特性，因而在生物體內(nèi)具有重要的生理

3、及 病理功能，具有重要的生物學(xué)意義14。自1900年，Gomberg M首次證實三苯甲 基自由基以來，自由基參與生命過程中許多重要的生化反應(yīng)逐步為人們所認(rèn)識， 特別是隨著現(xiàn)代檢測分析技術(shù)的日新月異，自由基在生物和病理學(xué)領(lǐng)域的作用研 究迅速發(fā)展。而尋求簡便、快速、準(zhǔn)確、高效的自由基檢測方法成為研究自由基 生物學(xué)作用的關(guān)鍵5。與醫(yī)學(xué)密切相關(guān)的自由基是氧自由基(oxygen free radical, OFR),包括超氧 陰離子和羥自由基，大量研究結(jié)果表明自由基與許多疾病的發(fā)生有著密切的聯(lián) 系，特別是與生物膜損傷的關(guān)系更是目前研究的熱點69。自由基已日益受到人們的重視，現(xiàn)將自由基的檢測方法介紹如下。

4、1自由基相關(guān)酶的測定機(jī)體內(nèi)活除自由基的酶系統(tǒng)主要有超氧化物歧化酶(Superoxide dimutase*通訊作者SOD)、過氧化氫酶(catalase , CAT)及谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione Peroxidase GSH Px)等酶類組成。在正常情況下，機(jī)體代謝過程中產(chǎn)生的超氧陰 離子自由基被細(xì)胞的SOD歧化為H2O2,后者再由細(xì)胞漿的CAT和GSHPx催 化降解為水和氧。1.1超氧化物歧化酶的測定SOD屆于金屆酶， 分CuZnSOD、MnSOD、FeSOD 3種。由于SOD的底 物超氧陰離子自由基壽命極短，目前除了應(yīng)用脈沖射解技術(shù)或快速冰凍結(jié)合電子自旋共振(electro

5、n spin resonance ESR)波譜直接獲得SOD與超氧陰離子自由 基反應(yīng)的動力學(xué)信息外，一般都采用間接的活力測定法來測定 SOD。下面介紹幾種重要的測定方法。1.1.1鄰苯三酚自氧化法國外多使用經(jīng)典的鄰苯三酚自氧化法(簡稱Marklund法)，Marklund法是采用420 nm處光吸收測定。酶活力定義為：在一定條件下1mL的反應(yīng)液中，每分鐘控制鄰苯三酚在 420 nm波長的自氧化速率達(dá)50%的酶 量定為1個活力單位。顧孔書等對鄰笨三酚自氧化法的測定結(jié)果影響因素進(jìn)行了 探討，結(jié)果鄰苯三酚自氧化法受到溶液的酸堿性、溫度、存放時間及鄰苯三酚的濃度的影響。1.1.2業(yè)硝酸鹽形成法 通過黃

6、喋吟及黃喋吟氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基，后者氧化羥胺形成業(yè)硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫紅色，用可見光 分光光度計測其吸光度。當(dāng)被測樣品中含 SOD時，則對超氧陰離子自由基有專 一性的抑制作用，使形成的業(yè)硝鹽減少，比色時測定管的吸光度低于對照管吸光 度，通過公式計算可求出被測樣品中的 SOD活力。1.1.3極譜氧電極法 極譜氧電極法利用了系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基過程中 消耗。2, 一定量的SOD乂會使超氧陰離子自由基歧化產(chǎn)生 。2,從而使耗氧量 減少的特性，使用極譜氧電極儀精確測出耗氧量而推算出酶活力。SOD活力單位定義為：25 C, pH 8.4,使每分鐘產(chǎn)生1 L O2的SOD量定

7、為1個酶活力 單位。張繼全等在極譜氧電極法測定超氧化物歧化酶活性的改進(jìn)一文中，對此方法進(jìn)行了如下修改：室溫測定；酶活性用標(biāo)準(zhǔn)SOD標(biāo)定；反應(yīng)在磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行；增大鄰苯三酚的用量，從而克服了易在電極薄膜表面產(chǎn)生氣泡 的問題，測定靈敏度及線性范圍增大。1.2過氧化氫酶的測定CAT的作用是降解細(xì)胞內(nèi)的H2O2。測定CAT的方法有滴定法、極譜氧電 極法等。高鋌酸鉀滴定法，其原理是定量的細(xì)菌同定量的H2O2發(fā)生反應(yīng)，定時加酸終止反應(yīng)，爾后用高鋌酸鉀滴定剩余 H2O2量，從而求得細(xì)菌H2O2BB的量。 唐明忠等在滴定法定量測定細(xì)胞菌過氧化氫酶及在腸桿菌科的應(yīng)用一文中，采用高鋌酸鉀滴定法定量測細(xì)胞過氧化

8、氫酶，結(jié)果測得沙富菌屆、變形桿菌屆、摩根菌屆、耶爾森菌屆、哈夫尼業(yè)菌屆和產(chǎn)氣桿菌的過氧化氫酶活性較高，普羅菲登菌屆、一些沙門菌屆、部分腸桿菌屆和部分克雷伯菌屆的活性居中， 埃希菌屆、 志賀菌屆的活性較低。1.3谷胱甘肽過氧化物酶的測定GSH Px是一種含硒酶，主要分布在細(xì)胞的胞液及線粒體基質(zhì)中， 測定GSH- Px活力常用的方法是Hafeman法及其改良法，可以直接測定酶促反應(yīng)中GSH的減少量，以此來計算GSHPx的活力單位，還可用偶聯(lián)法測 GSH Px活力,但該 法對試劑要求較嚴(yán)，難以推廣。2化學(xué)發(fā)光測定早在100多年之前,Dubois(1885)已提出生物發(fā)光是由熒光素酶與熒光素的 化學(xué)反

9、應(yīng)引起的。Harvey經(jīng)過40多年的研究，于1952年發(fā)表了生物發(fā)光”專著 隨著生物發(fā)光研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)機(jī)體的器官、組織、細(xì)胞乃至大分子物質(zhì)都 在發(fā)光，不過其發(fā)光強(qiáng)度很弱，稱之為超弱發(fā)光或低水平的化學(xué)發(fā)光?；瘜W(xué)發(fā)光的原理是從一個化學(xué)反應(yīng)(一般是氧化反應(yīng))中獲得能量，使反應(yīng)物 或產(chǎn)物分子的電子激發(fā)，形成電子激發(fā)態(tài)，當(dāng)返回基態(tài)時，以發(fā)射光子的形式釋 放能量，這一過程稱為化學(xué)發(fā)光(chemiluminescence CL)。因其不需外來光源激 發(fā)便能發(fā)光，特稱為化學(xué)冷光，可以用發(fā)光檢測裝置定量測定。魯米諾(luminol,3- 氨基苯二甲酰脫)及其衍生物，如異魯水諾，是常用的化學(xué)發(fā)光劑，在有氧化

10、劑， 如氧、H2O2、陰離子自由基以及其他過氧化物存在下，化學(xué)發(fā)光劑可以被氧化， 產(chǎn)生電子激發(fā)態(tài)的中間產(chǎn)物，當(dāng)其返回基態(tài)時，即產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。Allen R C等(1972)首先發(fā)現(xiàn)了吞噬細(xì)胞在其吞噬活動中產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象，自此開創(chuàng)了 化學(xué)發(fā)光分析技術(shù)在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)研究中的新局面。國外學(xué)者Kato T等早在1981 年就進(jìn)行了全血化學(xué)發(fā)光分析法的研究，發(fā)現(xiàn)血液粒細(xì)胞在全血化學(xué)發(fā)光中居首 要地位，其次是血小板，井證實環(huán)氧酶不參與粒細(xì)胞產(chǎn)生的CL,而參與血小板產(chǎn)生的CL。隨后，Heherer M等應(yīng)用該方法對急性炎癥患者和惡性腫瘤患者的 全血進(jìn)行了化學(xué)發(fā)光的分析，結(jié)果表明，這兩組患者的比CL(即每

11、103個粒細(xì)胞 的CL活性)均較正常人顯著升高，其中急性炎癥患者的總CL活性高于惡性腫瘤 組。Okuda M等用魯米諾溶液灌注離體的大鼠心臟和肝臟，以檢查缺血再灌注期問心和肝的魯米諾增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的變化，結(jié)果表明，注入魯米諾并不影響器官生理參數(shù)，但缺血會即刻引起化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度下降， 爾后增高，再灌注后使化 學(xué)發(fā)光強(qiáng)度進(jìn)一步增強(qiáng)，然后逐漸下降。SOD能抑制心臟缺血再灌注期化學(xué)發(fā) 光強(qiáng)度的增高，而CAT則不能。對于肝臟，SOD既能抑制缺血期化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度 的增高，也能抑制再灌注期化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的增強(qiáng)，使肝臟的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度連續(xù)保持在低水平狀態(tài)，而CAT只能抑制再灌注期化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的增高1314。3熒光

12、分光光度法測定自由基的中間產(chǎn)物不飽和脂肪酸是自由基的易攻目標(biāo)之一，氧自由基作用于脂質(zhì)的不飽和脂肪 酸，生成過氧化脂質(zhì).后者在酸性條件(最適pH 4.0),加熱分解成丙二醛 (malondialdehyde, MDA)，作為脂質(zhì)過氧化的次級產(chǎn)物，MDA再與硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid, TBA)縮合，生成紅色產(chǎn)物，然后進(jìn)行比色，以此來估測樣 品中過氧化脂質(zhì)的含量，進(jìn)而了解體內(nèi)如某組織，細(xì)胞或血活脂質(zhì)過氧化狀況。以上方法稱為硫代巴比妥酸法，因為硫代巴比酸具有熒光，故在比色基礎(chǔ)上發(fā)展 成為熒光法，靈敏度提高了 10倍以上，所需樣品量減少，激發(fā)波長為 515 nm, 熒光波長為

13、553 nm。此法主要用于檢測脂質(zhì)自由基。4電子自旋共振技術(shù)與自旋捕捉法由丁自由基具有生物半衰期極短、在生物體內(nèi)的濃度很低等特點，故要直接 檢測它們非常困難。目前只有電子自旋共振(ESR)技術(shù)能直接檢測到自由基，該 技術(shù)是最常用、最有效的檢測方法，該方法的原理比較復(fù)雜，簡要地說，因為自 由基具有1個或1個以上不成對的電子，ESR法就是依賴丁樣品中存在的未配對 電子，其基本概念可用1個未配對的電子來描述，即1個帶電而且自旋的電子猶 如一個小磁鐵，具有一個磁偶極矩，根據(jù)量子力學(xué)理論，未配對電子在外磁場只 可能有與外磁矩平行與反平'行的兩種不同取向的磁矩，其相應(yīng)能量一個為高能 級，一個為低能

14、級，當(dāng)外加一個特定的高額磁場時，低能級的未配對電子則從高頻磁場吸收能量躍遷至高能級，這就產(chǎn)生電子能與輻射能場共振， 將這種能量吸 收變?yōu)殡娦盘栠M(jìn)行放大檢測，則得到ESR信號，獲得的譜圖稱為ESR波譜。測定健康的和患子宮癌的子宮頸和子宮內(nèi)膜樣品的ESR波譜表明，正常子宮和內(nèi)膜的冰凍粉末樣品均產(chǎn)生很強(qiáng)的 ESR信號，而子宮癌樣品的相應(yīng)信號則很弱， 甚至不能檢出。自從1954年美、法學(xué)者將ESR技術(shù)首次引入生物學(xué)研究領(lǐng)域以 來，ESR分析方法在生命科學(xué)研究中得到了廣泛應(yīng)用，尤其是在氧自由基檢測方面多見報道。肖華山等人應(yīng)用ESR和自旋捕捉劑相結(jié)合直接測定了過硫酸胺 N, N, N', N四甲基

15、二胺(APTEMED)體系產(chǎn)生的氧自由基，經(jīng)計算機(jī)波譜模擬和計 算渡譜參數(shù)證實該體系產(chǎn)生的氧自由基是超氧陰離子自由基和羥自由基。陳越等15應(yīng)用ESR技術(shù)觀察了 Ge132對機(jī)體免疫器官氧自由基含量的影響，證實了 Ge- 132 能降低健康雛雞胸腺、法氏囊和脾臟中氧自由基含量，Ge132是體內(nèi)氧自由基的活除劑。丁玲范等16在低溫下應(yīng)用ESR技術(shù)直接檢測了大劑量維生素 D2 致大鼠心肌損傷時肌中氧自由基含量變化，并觀察到L甲硫氨酸對受損心肌具有保護(hù)作用。廖維靖等17等首次報道了用ESR技術(shù)檢測到坐骨神經(jīng)受損時氧自 由基含量升高。馬杰等以家兔為模型，通過ESR波譜儀觀察到實驗動物發(fā)生遲發(fā)性腦血管痙攣

16、時腦脊髓液中氧自由基含量增高，并且腦脊髓液氧自由基的ESR檢測結(jié)果與腦脊髓液丙二醛(MDA)含量測定結(jié)果之間有高度相關(guān)性(r = 0.88, P<0 01)。5熒光法Paritam K D等18應(yīng)用熒光法顯示了潮藻 chatlonellaanttiqua產(chǎn)生的O &需 要熒光探針 3,7dihydro64(2(N(5fluroresceinyl)thioureido)ethory)phenyl2- methylimidazo(1,2a)pyrazin3one(FCLA)作為超氧陰離子自由基和氧自由基的特異 性檢測試劑，在20 C與潮藻共同孵育10 min之后，將之涂丁載玻片上，加

17、蓋玻片，在氧氣激光掃描顯微鏡下現(xiàn)察發(fā)熒光 的部位，即超氧陰離子自由基的產(chǎn)生部位。 FCLA在532 nm處有一吸收帶，氯 氣激光，488 nm作為激發(fā)光。這一過程可被 SOD完全抑制。6分析羥化產(chǎn)物法羥自由基(hydroxy radical, OH)能與許多有機(jī)化合物，尤其芳香族化合物發(fā) 生羥化反應(yīng)，通過測定反應(yīng)體系的羥化產(chǎn)物生成量，間接檢測OH含量19。例如， 在OH作用下，苯甲酸被羥化為水楊酸(羥基苯甲酸)，后者產(chǎn)量可通過分光光度 法、熒光法等測得，從而間接得到 OH含量，該法被認(rèn)為是檢測OH比較專一的 方法。賈之慎等應(yīng)用比色法通過測得 OH與水楊酸反應(yīng)生成的羥基化產(chǎn)物 2,3二 羥基苯甲

18、酸含量（510nm）,間接測得反應(yīng)體系的OH生成量，并認(rèn)為該方法使用 簡便，易為一般實驗室采用。周建政等2021應(yīng)用高效液相色譜電化學(xué)聯(lián)合法檢 測反應(yīng)體系產(chǎn)生的OH，即利用水楊酸捕獲OH，通過測得生成物二羥基苯甲酸 間接測定OH的含量。方法簡便，靈敏度高，專一性好。7氣相色譜法自由基的檢測中，氣相色譜法主要用丁測定 OH含量。OH與甲硫基丙醛反 應(yīng)產(chǎn)生乙烯，或與二甲基業(yè)碉反應(yīng)產(chǎn)生甲烷，因此可以將甲硫基丙醛或二甲基業(yè) 碉加入到一定的反應(yīng)體系。應(yīng)用氣相色譜儀檢測所生成的乙烯或甲烷， 判斷該反 應(yīng)體系有無OH生成以及測定OH的相對含量，但是，甲硫基丙醛也能與其他自 由基如超氧陰離子自由基反應(yīng)產(chǎn)生乙烯， 二甲基業(yè)碉與OH作用生成的甲烷量也 降低，因此，許多學(xué)者注意到氣相色譜法測定 OH的專一性問題。Richmon