免疫組織化學(xué)醫(yī)學(xué)醫(yī)藥資料ppt課件

1、免疫組織化學(xué)的免疫組織化學(xué)的雙重或多重標(biāo)志雙重或多重標(biāo)志要要 求：求： 1.1.掌握掌握IHCIHC多重標(biāo)志染色的根多重標(biāo)志染色的根本原理本原理 和技術(shù)要求和技術(shù)要求 2.2.了解常用方法類(lèi)型及其優(yōu)缺了解常用方法類(lèi)型及其優(yōu)缺陷陷 概概 述述 運(yùn)用運(yùn)用IHC的方法在同一張組織的方法在同一張組織切片上同時(shí)或先后顯示兩種或兩種切片上同時(shí)或先后顯示兩種或兩種以上的抗原成分，即謂雙重或多重以上的抗原成分，即謂雙重或多重免疫標(biāo)志。免疫標(biāo)志。 顯示的程度可以是光鏡，也可顯示的程度可以是光鏡，也可以是電鏡以是電鏡 常用方法類(lèi)型有：常用方法類(lèi)型有： 按標(biāo)志物分：免疫熒光雙重標(biāo)志按標(biāo)志物分：免疫熒光雙重標(biāo)志(FI

2、TC-TRITC)，免疫酶雙重標(biāo)志，免疫酶雙重標(biāo)志(單酶雙單酶雙底物底物-HRP:DAB與與4CN/ H2O2);AP:萘酚萘酚AS-MX/鞏固紅與鞏固藍(lán)；雙酶雙底物鞏固紅與鞏固藍(lán)；雙酶雙底物(HRP與與AP，DAB /H2O2與萘酚與萘酚AS-MX /鞏固紅鞏固紅)；免疫膠體金標(biāo)志；免疫膠體金標(biāo)志(5nm與與15nm)。 按標(biāo)志抗體分：直接、間接法、復(fù)合按標(biāo)志抗體分：直接、間接法、復(fù)合物法等物法等 按抗體制備動(dòng)物來(lái)源分：異種動(dòng)物抗按抗體制備動(dòng)物來(lái)源分：異種動(dòng)物抗體法與同種動(dòng)物抗體法。體法與同種動(dòng)物抗體法。 按有否洗脫去除第一重抗原抗體復(fù)合按有否洗脫去除第一重抗原抗體復(fù)合物分：洗脫法與非洗脫法

3、。物分：洗脫法與非洗脫法。 普通多采用熒光或酶標(biāo)間接法，混合普通多采用熒光或酶標(biāo)間接法，混合試劑，不洗脫，光鏡以雙熒光或雙底物酶試劑，不洗脫，光鏡以雙熒光或雙底物酶標(biāo)志為多，顏色區(qū)別。電鏡以膠體金不同標(biāo)志為多，顏色區(qū)別。電鏡以膠體金不同直徑顆粒直徑顆粒(5nm與與15nm)標(biāo)志為多，顆粒大標(biāo)志為多，顆粒大小區(qū)別。小區(qū)別。 一、根本原理一、根本原理 雙重或多重標(biāo)志是利用免疫學(xué)和細(xì)胞雙重或多重標(biāo)志是利用免疫學(xué)和細(xì)胞化學(xué)原理，在同一張切片上同時(shí)采用或先化學(xué)原理，在同一張切片上同時(shí)采用或先后采用不同顏色的熒光色素或酶促產(chǎn)物，后采用不同顏色的熒光色素或酶促產(chǎn)物，或采用不同直徑大小顆粒膠體金來(lái)原位標(biāo)或采用

4、不同直徑大小顆粒膠體金來(lái)原位標(biāo)志兩種或兩種以上抗原抗體復(fù)合物，志兩種或兩種以上抗原抗體復(fù)合物，到達(dá)在同一細(xì)胞或亞細(xì)胞程度顯示不到達(dá)在同一細(xì)胞或亞細(xì)胞程度顯示不同抗原成分同抗原成分(定性、定位、定量定性、定位、定量)，分，分析不同抗原成分相互間的功能關(guān)系，析不同抗原成分相互間的功能關(guān)系，操作遵照的原那么與要求同單標(biāo)免疫操作遵照的原那么與要求同單標(biāo)免疫組化方法。組化方法。 為了防止前重免疫標(biāo)志與后重標(biāo)志為了防止前重免疫標(biāo)志與后重標(biāo)志的交叉、重疊，其間可采用酸洗破壞的交叉、重疊，其間可采用酸洗破壞(洗洗脫法脫法)或飽和封鎖或飽和封鎖(非洗脫法非洗脫法)加以抑制。加以抑制。二、光鏡下的多重免疫標(biāo)志染色

5、二、光鏡下的多重免疫標(biāo)志染色一雙重免疫熒光標(biāo)志染色一雙重免疫熒光標(biāo)志染色 采用呈現(xiàn)不同顏色的熒光色素配伍，采用呈現(xiàn)不同顏色的熒光色素配伍，分別標(biāo)志不同的抗體，再經(jīng)過(guò)各自與同一分別標(biāo)志不同的抗體，再經(jīng)過(guò)各自與同一切片上的相應(yīng)抗原特異性結(jié)合而加以區(qū)別切片上的相應(yīng)抗原特異性結(jié)合而加以區(qū)別顯示所建立起來(lái)的雙重或多重免疫組化染顯示所建立起來(lái)的雙重或多重免疫組化染色技術(shù)。色技術(shù)。 常用的熒光素配伍主要為：異硫氰酸常用的熒光素配伍主要為：異硫氰酸熒光素?zé)晒馑?FITC)呈綠色與羅丹明呈綠色與羅丹明(RB200)或或異硫氰酸四甲基羅丹明異硫氰酸四甲基羅丹明TRITC呈紅色。呈紅色。 技術(shù)方法敏感、特異，需選用

6、各自特技術(shù)方法敏感、特異，需選用各自特定的激發(fā)濾光片分別察看或二次曝光顯影，定的激發(fā)濾光片分別察看或二次曝光顯影，樣本不能長(zhǎng)期保管。樣本不能長(zhǎng)期保管。 技術(shù)類(lèi)型：有直接法和間接法之分。技術(shù)類(lèi)型：有直接法和間接法之分。前者特異、快速，后者敏感、多用。前者特異、快速，后者敏感、多用。 所用抗體試劑可為異種動(dòng)物抗體，也所用抗體試劑可為異種動(dòng)物抗體，也可為同種動(dòng)物抗體?？蔀橥N動(dòng)物抗體。 異種動(dòng)物抗體?；旌线\(yùn)用，操作步驟異種動(dòng)物抗體?；旌线\(yùn)用，操作步驟少，脫片率相對(duì)較低。少，脫片率相對(duì)較低。 同種動(dòng)物抗體多分別運(yùn)用，操作步驟同種動(dòng)物抗體多分別運(yùn)用，操作步驟加倍，脫片機(jī)率相對(duì)較高，前后重免疫熒加倍，脫片

7、機(jī)率相對(duì)較高，前后重免疫熒光標(biāo)志交叉重疊時(shí)機(jī)多，需用酸性洗脫或光標(biāo)志交叉重疊時(shí)機(jī)多，需用酸性洗脫或多聚甲醛蒸氣處置。多聚甲醛蒸氣處置。 操作舉例：垂體腺瘤操作舉例：垂體腺瘤-ACTH與與GH雙重免疫熒光標(biāo)志染色間接法雙重免疫熒光標(biāo)志染色間接法 (1)石蠟切片，厚石蠟切片，厚5 m，常規(guī)二甲苯脫，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，入蠟，梯度酒精水化，入PBS(pH7.4, 0.01mol/L)。(2)1人血潔白蛋白人血潔白蛋白HAS孵育孵育10min 亦可用亦可用10正常羊血清代之，不洗。正常羊血清代之，不洗。(3)抗抗ACTH血清血清McAb1:200，孵育，孵育 30min 37，濕盒。，濕盒。

8、(4)0.05mol/L TBS(pH7.4,內(nèi)含內(nèi)含1 Triten 100,下同下同)洗，洗，10min3。(5)羊抗鼠羊抗鼠IgG-TRITC 1:100，濕盒，室溫，濕盒，室溫避光反響避光反響1h。(6)0.05mol/L TBS(pH7.4)洗，洗，10min3，(第一重第一重ACTH-TRITC標(biāo)志染色已完成標(biāo)志染色已完成)。(7)切片逐級(jí)酒精脫水，二甲苯透明，空氣切片逐級(jí)酒精脫水，二甲苯透明，空氣枯燥后，置于裝有多聚甲醛粉末的密閉容枯燥后，置于裝有多聚甲醛粉末的密閉容器內(nèi)，放在器內(nèi)，放在80烤箱或溫箱內(nèi)以甲醛蒸氣烤箱或溫箱內(nèi)以甲醛蒸氣固定固定24h，使第一重染色中二抗的抗原，使第

9、一重染色中二抗的抗原結(jié)合部位失活。結(jié)合部位失活。(8)切片以切片以TBS洗，洗，5min4(9)1 HSA或或10正羊血清孵育正羊血清孵育30min，室溫，濕盒，不洗。，室溫，濕盒，不洗。(10)抗抗GH血清血清(McAb) 1:400，孵育，孵育30min，37，濕盒。，濕盒。(11)0.05mol/L TBS(pH7.4)洗，洗，10min3(12)羊抗鼠羊抗鼠IgG-FITC 1:100,濕盒，室溫濕盒，室溫避光反響避光反響1h。(13)0.05mol/L TBS(pH7.4)洗，洗，10min3 (第二重第二重GH-FITC標(biāo)志染色完成標(biāo)志染色完成)。(14)緩沖甘油封片。緩沖甘油封片

10、。(15)熒光顯微鏡下分別以熒光顯微鏡下分別以546nm及及490nm波長(zhǎng)的激發(fā)光察看切片組織內(nèi)波長(zhǎng)的激發(fā)光察看切片組織內(nèi)TRITC及及FITC所標(biāo)示的所標(biāo)示的ACTH及及GH抗原抗原TRITC陽(yáng)性細(xì)胞呈紅色，陽(yáng)性細(xì)胞呈紅色，F(xiàn)ITC陽(yáng)性細(xì)胞呈綠色。陽(yáng)性細(xì)胞呈綠色。(16)用彩色底片對(duì)切片同一部位用用彩色底片對(duì)切片同一部位用546nm及及490nm波長(zhǎng)激發(fā)光分別作兩次波長(zhǎng)激發(fā)光分別作兩次曝光，即可在同一張照片上顯示不同顏曝光，即可在同一張照片上顯示不同顏色標(biāo)示的色標(biāo)示的ACTH與與GH兩種抗原。兩種抗原。TRITC-GAMIgG鼠抗人鼠抗人ACTHIgGFITC-GAMIgG鼠抗人鼠抗人GHI

11、gGT游離游離FabTTTFGH抗原抗原ACTH抗原抗原FFab被滅活被滅活圖圖1 同種動(dòng)物抗體間接法分步固定雙重免疫熒光熒色原理同種動(dòng)物抗體間接法分步固定雙重免疫熒光熒色原理二、多重免疫酶標(biāo)志染色二、多重免疫酶標(biāo)志染色 以酶催化不同底物呈現(xiàn)不同顏色以酶催化不同底物呈現(xiàn)不同顏色產(chǎn)物標(biāo)示同一切片內(nèi)兩種或兩種以上抗原產(chǎn)物標(biāo)示同一切片內(nèi)兩種或兩種以上抗原為實(shí)際根底所建立起來(lái)的多重免疫標(biāo)志染為實(shí)際根底所建立起來(lái)的多重免疫標(biāo)志染色方法。在光鏡下可以同時(shí)察看和對(duì)比，色方法。在光鏡下可以同時(shí)察看和對(duì)比，樣品保管時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，一次曝光即可成樣品保管時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，一次曝光即可成像，故較雙重免疫熒光染色法更為常用

12、。像，故較雙重免疫熒光染色法更為常用。 常用標(biāo)志酶與底物的配伍常用標(biāo)志酶與底物的配伍 單酶雙底物單酶雙底物-HRP-DAB(棕色棕色):4CN(藍(lán)色藍(lán)色) AEC(紅色紅色):4CN(藍(lán)色藍(lán)色) AP-萘酚萘酚AS-MX-鞏固紅鞏固紅(fast red 紅色紅色)-鞏固藍(lán)鞏固藍(lán)(fast blue 藍(lán)色藍(lán)色)雙酶雙底物雙酶雙底物-HRP(DAB):AP(萘酚萘酚AS.MX-鞏固藍(lán)鞏固藍(lán)) HRP(4CN):AP(萘酚萘酚AS.MX-鞏固紅鞏固紅)直接法、間接法、橋法均可運(yùn)用，靈敏度以橋直接法、間接法、橋法均可運(yùn)用，靈敏度以橋法中的復(fù)合物法最高，特異性那么以直接法最正法中的復(fù)合物法最高，特異性那

13、么以直接法最正確確 操作方法類(lèi)同單酶標(biāo)志，有直接法、操作方法類(lèi)同單酶標(biāo)志，有直接法、間接法、復(fù)合物法之分。間接法、復(fù)合物法之分。 間接法與復(fù)合物法較常采用。間接法與復(fù)合物法較常采用。 操作舉例操作舉例 淋巴瘤輕鏈淋巴瘤輕鏈、的雙重的雙重酶標(biāo)志雙酶雙底物酶標(biāo)志雙酶雙底物(1)石蠟切片常規(guī)脫蠟進(jìn)水假設(shè)用含汞固石蠟切片常規(guī)脫蠟進(jìn)水假設(shè)用含汞固定液固定的組織那么需用定液固定的組織那么需用0.5%碘的乙醇溶碘的乙醇溶液脫汞液脫汞5min，乙醇濃度為，乙醇濃度為70，經(jīng)自來(lái)水，經(jīng)自來(lái)水洗后，以洗后，以2.5%硫代硫到鈉浸洗硫代硫到鈉浸洗1min，水，水洗洗)；(2)0.3% H2O2甲醇液浸泡切片甲醇液浸

14、泡切片30min,自來(lái)自來(lái)水洗，蒸餾水洗水洗，蒸餾水洗,入入PBS(0.01mol/L pH7.2);(3)滴加正羊血清滴加正羊血清1:10，濕盒，室溫，濕盒，室溫，10min，不洗；，不洗；(4)加一抗加一抗(抗人抗人 PcAb與抗人與抗人McAb的混的混合液合液)1:200，濕盒，濕盒，37，45min或更長(zhǎng)；或更長(zhǎng)；(5)PBS液，液，5min3(6)加二抗加二抗(GARGGAMG混合液混合液1:200)，溫盒，溫盒，37，30min；(7)PBS洗，洗，5min3;(8)加酶抗酶抗體復(fù)合物加酶抗酶抗體復(fù)合物(兔兔PAP鼠鼠APAAP 混合液混合液1:100)，濕盒，濕盒，37，30mi

15、n；(9)PBS洗，洗，5min3；(10)過(guò)氧化物酶顯色反響：以過(guò)氧化物酶顯色反響：以DAB H2O2液顯色液顯色710min(鏡下控制顯色程度鏡下控制顯色程度)，PBS洗，洗，5min3；(11)堿性磷酸酶顯色反響：以萘酚堿性磷酸酶顯色反響：以萘酚AS.MX及鞏固藍(lán)及鞏固藍(lán)(fast blue)顯色顯色1015min(鏡下控鏡下控制顯色程度制顯色程度)，PBS洗、自來(lái)水洗；洗、自來(lái)水洗；(12)緩沖甘油封片，光鏡下察看緩沖甘油封片，光鏡下察看注：假設(shè)為同種動(dòng)物抗血清，可分別進(jìn)注：假設(shè)為同種動(dòng)物抗血清，可分別進(jìn)展標(biāo)志染色，其間應(yīng)經(jīng)多聚甲醛蒸氣處展標(biāo)志染色，其間應(yīng)經(jīng)多聚甲醛蒸氣處置置4h或用或

16、用pH2.2的甘氨酸的甘氨酸-鹽酸溶液處鹽酸溶液處置置2h，以防止彼此的交叉反響。，以防止彼此的交叉反響。PPPAAA 圖圖2 雙酶雙底物雙酶雙底物(復(fù)合物法復(fù)合物法)雙重酶標(biāo)染色原理雙重酶標(biāo)染色原理兔兔PAPGAR IgG兔抗兔抗KAg鼠鼠APAAPGAM. IgG鼠抗人鼠抗人其它雙重標(biāo)志法其它雙重標(biāo)志法 1. 1.免疫熒光法與免疫酶法結(jié)合運(yùn)用免疫熒光法與免疫酶法結(jié)合運(yùn)用( (先酶先酶標(biāo)標(biāo) 后熒光后熒光) ) 2. 2.免疫熒光法與免疫金銀法結(jié)合運(yùn)用免疫熒光法與免疫金銀法結(jié)合運(yùn)用( (先先 免疫金銀標(biāo)志后熒光標(biāo)志免疫金銀標(biāo)志后熒光標(biāo)志) )3.免疫酶法與免疫金法結(jié)合運(yùn)用免疫酶法與免疫金法結(jié)合

17、運(yùn)用(20nm,紅紅 色不宜用銀液放大，吸附干擾色不宜用銀液放大，吸附干擾)4.免疫金銀法與免疫酶法結(jié)合運(yùn)用免疫金銀法與免疫酶法結(jié)合運(yùn)用(對(duì)比明對(duì)比明 顯顯)三、電鏡下的雙重及多重免疫標(biāo)志三、電鏡下的雙重及多重免疫標(biāo)志 電鏡下的雙重免疫標(biāo)志染色不是靠電鏡下的雙重免疫標(biāo)志染色不是靠顏色區(qū)分，而是靠標(biāo)志物的不同電子密顏色區(qū)分，而是靠標(biāo)志物的不同電子密度或顆粒的不同大小來(lái)區(qū)別不同抗原，度或顆粒的不同大小來(lái)區(qū)別不同抗原，有別于光鏡下的雙重免疫標(biāo)志方法。有別于光鏡下的雙重免疫標(biāo)志方法。 常用的方法多為雙重免疫金標(biāo)志常用的方法多為雙重免疫金標(biāo)志 優(yōu)點(diǎn)：高電子密度，分辨率高，抗原定優(yōu)點(diǎn)：高電子密度，分辨率高

18、，抗原定 位準(zhǔn)確，顆粒大小可人工控制，位準(zhǔn)確，顆粒大小可人工控制， 標(biāo)志試劑易制備。標(biāo)志試劑易制備。 缺陷：試劑質(zhì)量要求高，非特異吸附干擾缺陷：試劑質(zhì)量要求高，非特異吸附干擾 大大(背景背景) 類(lèi)型有直接法、間接法異種動(dòng)物抗類(lèi)型有直接法、間接法異種動(dòng)物抗體或同種動(dòng)物抗體體或同種動(dòng)物抗體-雙面染色，分步固雙面染色，分步固定。標(biāo)志用的膠體金顆粒，直徑多采用定。標(biāo)志用的膠體金顆粒，直徑多采用5nm, 15nm組合，標(biāo)志不同類(lèi)別抗體組合，標(biāo)志不同類(lèi)別抗體(特異特異性一抗性一抗-直接法，間接抗體直接法，間接抗體-間接法間接法)。 運(yùn)用直接法進(jìn)展多標(biāo)，簡(jiǎn)便、快速、運(yùn)用直接法進(jìn)展多標(biāo)，簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、效果

19、佳，尤多用于細(xì)胞外表抗原的準(zhǔn)確、效果佳，尤多用于細(xì)胞外表抗原的雙重或多重標(biāo)志。雙重或多重標(biāo)志。缺陷：敏感性較低，金標(biāo)抗體純度要求高。缺陷：敏感性較低，金標(biāo)抗體純度要求高。 金標(biāo)抗體雙重抗原標(biāo)志常用間接法顯示，金標(biāo)抗體雙重抗原標(biāo)志常用間接法顯示，且多采用異種動(dòng)物抗體混合同步操作。且多采用異種動(dòng)物抗體混合同步操作。優(yōu)點(diǎn)：敏感性提高，操作步驟減少優(yōu)點(diǎn)：敏感性提高，操作步驟減少缺陷：標(biāo)志二抗質(zhì)量要求高，背景染色深。缺陷：標(biāo)志二抗質(zhì)量要求高，背景染色深。 可經(jīng)過(guò)采用固相吸附或過(guò)量二抗封鎖，可經(jīng)過(guò)采用固相吸附或過(guò)量二抗封鎖，或用多聚甲醛蒸氣處置，使二抗的游離抗原或用多聚甲醛蒸氣處置，使二抗的游離抗原結(jié)合部

20、位結(jié)合部位Fab段滅活加以抑制。段滅活加以抑制。 舉例：垂體組織生長(zhǎng)激素舉例：垂體組織生長(zhǎng)激素(GH)和促腎和促腎上腺皮質(zhì)激素上腺皮質(zhì)激素(ACTH)雙重免疫電鏡染色雙重免疫電鏡染色(間接法間接法)-分步固定。分步固定。 (1)取新穎垂體腺瘤組織取新穎垂體腺瘤組織1mm3，蒸餾水，蒸餾水洗，不經(jīng)餓酸固定，常規(guī)酒精脫水，用洗，不經(jīng)餓酸固定，常規(guī)酒精脫水，用Lowicryl k4M包埋，超薄切片厚包埋，超薄切片厚40nm，置無(wú)支持膜的鎳網(wǎng)上；置無(wú)支持膜的鎳網(wǎng)上； (2)以以0.05mol/L TBS(pH7.4含含1Triton X-100，下同，下同)，浸洗，浸洗5min； (3)參與參與1HS

21、A 5min；不洗；不洗； (4)以兔抗以兔抗ACTH血清血清(1:200)孵育，孵育，4，20h，室溫下，室溫下2h，TBS洗，用上述一抗反洗，用上述一抗反復(fù)孵育復(fù)孵育1次，次，TBS放射沖洗，然后浸洗放射沖洗，然后浸洗10min，3次，次，TBS (pH8.2)浸洗浸洗5min； (5)0.02mol/L TBS (pH8.2)浸洗浸洗5min； (6)1 HSA孵育孵育5min，不洗；再以，不洗；再以5nm膠體金標(biāo)志的羊抗兔，膠體金標(biāo)志的羊抗兔，IgG孵育孵育10min；0.02mol/L TBS (pH8.2)放射沖洗，放射沖洗，0.05mol/L TBS (pH7.4)沖洗及浸洗，時(shí)間沖洗及浸洗，時(shí)間同前；同前； (7)蒸餾水浸洗后，空氣中枯燥；蒸餾水浸洗后，空氣中枯燥； (8)置盛有多聚甲醛粉末的密閉容器內(nèi)，置盛有多聚甲醛粉末的密閉容器內(nèi)，80溫箱中以多聚甲醛蒸氣處置溫箱中以多聚甲醛蒸氣處置1h，冷，冷卻取出，入蒸餾水，換洗卻取出，入蒸餾水，換洗2次。次。 (9)再按再按(4)-(8)步驟作第二重抗原染色，步驟作第二重抗原染色，這次一抗用鼠