基因克隆與表達(dá)的載體PPT學(xué)習(xí)教案

1、會計(jì)學(xué)1基因克隆與表達(dá)的載體基因克隆與表達(dá)的載體vectors第1頁/共244頁？vectors 本質(zhì)？本質(zhì)？第2頁/共244頁在基因工程操作中，把能攜帶外源在基因工程操作中，把能攜帶外源DNA進(jìn)入受體進(jìn)入受體細(xì)胞復(fù)制、整合或表達(dá)的工具稱為細(xì)胞復(fù)制、整合或表達(dá)的工具稱為載體載體。載體的本質(zhì)是載體的本質(zhì)是DNA。經(jīng)過人工。經(jīng)過人工構(gòu)建的載體，不但能與外源基構(gòu)建的載體，不但能與外源基因相連，因相連，導(dǎo)入導(dǎo)入受體細(xì)胞，而且受體細(xì)胞，而且還能利用本身的調(diào)控系統(tǒng)使外還能利用本身的調(diào)控系統(tǒng)使外源基因在新的細(xì)胞中源基因在新的細(xì)胞中復(fù)制復(fù)制。第3頁/共244頁1. 運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞運(yùn)送外源基因高效

2、轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞2. 為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力3. 為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件 Within the host cell the vector multiplies, producing numerous identical copies not only of itself but also of the gene that it carries. 第4頁/共244頁 （2）在宿主細(xì)胞內(nèi)能獨(dú)立復(fù)制。）在宿主細(xì)胞內(nèi)能獨(dú)立復(fù)制。 replicate independently in host cell（3）有一段多

3、克隆位點(diǎn)。）有一段多克隆位點(diǎn)。 Multiple cloning sites 外源外源DNA插入其中不影響載體的復(fù)制。插入其中不影響載體的復(fù)制。（4）有選擇性標(biāo)記。）有選擇性標(biāo)記。 selectable marker（5）分子量小，拷貝數(shù)多。）分子量小，拷貝數(shù)多。 Low molecules and multiple copies （6）容易從宿主細(xì)胞中分離純化。）容易從宿主細(xì)胞中分離純化。 Easy isolation and purification from host cells.（1）具有對受體的可轉(zhuǎn)移性。）具有對受體的可轉(zhuǎn)移性。transferable第5頁/共244頁復(fù)制位點(diǎn)復(fù)制位

4、點(diǎn)選擇性標(biāo)記選擇性標(biāo)記克隆位點(diǎn)克隆位點(diǎn)克隆載體克隆載體表達(dá)載體表達(dá)載體表達(dá)調(diào)控元件表達(dá)調(diào)控元件必必須須的的第6頁/共244頁 基因工程中常用的載體有基因工程中常用的載體有4類：類： 質(zhì)粒（質(zhì)粒（plasmid） 單鏈單鏈DNA噬菌體噬菌體M13 噬菌體的衍生物噬菌體的衍生物 柯斯質(zhì)粒（柯斯質(zhì)粒（cosmid） 動物病毒（動物病毒（virus） 第7頁/共244頁一、質(zhì)粒（一、質(zhì)粒（plasmid） 存在存在于多種宿主細(xì)胞中、于多種宿主細(xì)胞中、獨(dú)立獨(dú)立于染色體以外的可于染色體以外的可自主復(fù)自主復(fù)制制的的雙鏈閉合環(huán)狀雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子。分子。存在于細(xì)菌、霉菌、藍(lán)藻、酵母等細(xì)胞中。存在于細(xì)菌、霉

5、菌、藍(lán)藻、酵母等細(xì)胞中。第8頁/共244頁第9頁/共244頁質(zhì)粒的命名規(guī)則質(zhì)粒的命名規(guī)則 天然存在的質(zhì)粒：其符號的第一個字天然存在的質(zhì)粒：其符號的第一個字母要大寫，并不用斜體字，書寫時母要大寫，并不用斜體字，書寫時要用括號括起來，如（要用括號括起來，如（ColE1）。）。 重組質(zhì)粒：通常是用小寫重組質(zhì)粒：通常是用小寫p后加兩個后加兩個大寫字母表示大寫字母表示.第10頁/共244頁構(gòu)建質(zhì)粒的研究人員或構(gòu)建質(zhì)粒的研究人員或完成此項(xiàng)工作的研究機(jī)完成此項(xiàng)工作的研究機(jī)構(gòu)構(gòu)例如：pSC101 plasmid 質(zhì)粒質(zhì)粒質(zhì)粒試驗(yàn)質(zhì)粒試驗(yàn)研究類號研究類號Stanley Cohen第11頁/共244頁（1）分子小

6、：）分子?。?1-200 kb質(zhì)粒質(zhì)粒DNA僅占細(xì)胞染色體組一小部分，一般約僅占細(xì)胞染色體組一小部分，一般約1-3左右。左右。不同質(zhì)粒不同質(zhì)粒DNA的分子量差異相當(dāng)顯著，質(zhì)粒的分子量差異相當(dāng)顯著，質(zhì)粒DNA分子小的不足分子小的不足2 kb，大的可達(dá)，大的可達(dá)100 kb以上，以上，多數(shù)在多數(shù)在10 kb左右左右。最小的僅能編碼。最小的僅能編碼23種中等大小的蛋白質(zhì)，兩者之間相差競達(dá)上百倍。種中等大小的蛋白質(zhì)，兩者之間相差競達(dá)上百倍。第12頁/共244頁（2）編碼基因少：）編碼基因少： 2-3個中等大小的蛋白質(zhì)。個中等大小的蛋白質(zhì)。 （3）環(huán)狀：）環(huán)狀：雙鏈環(huán)狀雙鏈環(huán)狀DNA。如抗生素抗性等，賦

7、予細(xì)菌一些額外的特性。如抗生素抗性等，賦予細(xì)菌一些額外的特性。（非必須）（非必須）第13頁/共244頁 共價(jià)閉合環(huán)狀共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA)呈超螺旋（呈超螺旋（SC）（）（super coil）Covalent close circular DNA第14頁/共244頁 線形線形DNA （ linear ，lDNA）一條鏈上有一至數(shù)個缺口。一條鏈上有一至數(shù)個缺口。第15頁/共244頁同一質(zhì)粒盡管分子量相同，不同的構(gòu)型電泳同一質(zhì)粒盡管分子量相同，不同的構(gòu)型電泳遷移率不同：遷移率不同：scDNA最快、最快、l DNA次之、次之、ocDNA最慢。最慢。SCOCl DNA第16頁/共244頁（

8、1） 嚴(yán)緊型質(zhì)粒（嚴(yán)緊型質(zhì)粒（stringent plasmid）拷貝數(shù)少拷貝數(shù)少，只有，只有1-3個拷貝。個拷貝。（2） 松弛型質(zhì)粒（松弛型質(zhì)粒（relaxed plasmid）拷貝數(shù)多拷貝數(shù)多，一般，一般10個以上。個以上。（非接合型質(zhì)粒分子量小，一般屬松弛型）。（非接合型質(zhì)粒分子量小，一般屬松弛型）。1. 復(fù)制復(fù)制p39質(zhì)粒的拷貝數(shù)質(zhì)粒的拷貝數(shù) ：指在正常生長條件下，每個細(xì)菌細(xì)指在正常生長條件下，每個細(xì)菌細(xì)胞或每條染色體所對應(yīng)的平均質(zhì)粒數(shù)。胞或每條染色體所對應(yīng)的平均質(zhì)粒數(shù)。（接合型質(zhì)粒分子量大，一般屬嚴(yán)緊型）（接合型質(zhì)粒分子量大，一般屬嚴(yán)緊型）第17頁/共244頁 2. 不相容性（不相容

9、性（incompatibility） 在沒有選擇壓力的情況下，兩種在沒有選擇壓力的情況下，兩種親緣關(guān)系密切親緣關(guān)系密切的不的不同質(zhì)粒，不能在同一宿主細(xì)胞中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。在同質(zhì)粒，不能在同一宿主細(xì)胞中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。在細(xì)胞的增殖過程中，其中必有一種會被逐漸地排斥細(xì)胞的增殖過程中，其中必有一種會被逐漸地排斥(稀稀釋釋)掉。這樣的兩種質(zhì)粒稱為不相容質(zhì)粒。掉。這樣的兩種質(zhì)粒稱為不相容質(zhì)粒。 前提條件：前提條件：只有在確實(shí)證明第二種質(zhì)粒只有在確實(shí)證明第二種質(zhì)粒B已經(jīng)進(jìn)入已經(jīng)進(jìn)入含有第一種質(zhì)粒含有第一種質(zhì)粒A的寄主細(xì)胞，而它的的寄主細(xì)胞，而它的DNA并不受寄主并不受寄主細(xì)胞限制體系的降解作用，但這兩

10、種質(zhì)粒卻不能長期穩(wěn)細(xì)胞限制體系的降解作用，但這兩種質(zhì)粒卻不能長期穩(wěn)定共存，在這種情況下，我們才能夠說定共存，在這種情況下，我們才能夠說A和和B是不親和是不親和的質(zhì)粒。的質(zhì)粒。第18頁/共244頁在大腸桿菌中的質(zhì)粒，可以分為：在大腸桿菌中的質(zhì)粒，可以分為： 3. 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性（1） 接合型質(zhì)粒接合型質(zhì)粒（2） 非接合型質(zhì)粒非接合型質(zhì)粒能自我轉(zhuǎn)移能自我轉(zhuǎn)移不能自我轉(zhuǎn)移不能自我轉(zhuǎn)移第19頁/共244頁如：如：F質(zhì)粒（性質(zhì)粒、或質(zhì)粒（性質(zhì)粒、或F因子）：因子）：甚至能使寄主染色體上的基因隨其一道轉(zhuǎn)移甚至能使寄主染色體上的基因隨其一道轉(zhuǎn)移到原先不存在該質(zhì)粒的受體菌中。到原先不存在該質(zhì)粒的受體

11、菌中。通過接合作用轉(zhuǎn)移到新宿主內(nèi)，又叫通過接合作用轉(zhuǎn)移到新宿主內(nèi)，又叫自我轉(zhuǎn)移型質(zhì)粒自我轉(zhuǎn)移型質(zhì)粒。分子量大，拷貝數(shù)少，宿主廣，不符合基因工程的安全要求分子量大，拷貝數(shù)少，宿主廣，不符合基因工程的安全要求除了帶有自我除了帶有自我復(fù)制復(fù)制所必需的遺傳信息外所必需的遺傳信息外還帶有一套控制細(xì)菌還帶有一套控制細(xì)菌配對配對和質(zhì)粒和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移接合轉(zhuǎn)移的基因的基因第20頁/共244頁第21頁/共244頁Donor cellRecipient cell Conjugative plasmidPilus 菌毛菌毛Plasmid transfer by conjugation between bacteria

12、l cells.第22頁/共244頁 R質(zhì)粒（抗性質(zhì)粒）質(zhì)粒（抗性質(zhì)粒）帶有一種或數(shù)種帶有一種或數(shù)種抗生素抗性基因抗生素抗性基因，使寄主獲得同樣，使寄主獲得同樣的抗生素抗性性狀（的抗生素抗性性狀（resistance）。）。分子量小，拷貝數(shù)多，符合基因工程的安全要求分子量小，拷貝數(shù)多，符合基因工程的安全要求雖然帶有自我雖然帶有自我復(fù)制復(fù)制所必需的遺傳信息，但失去了控所必需的遺傳信息，但失去了控制細(xì)菌配對和質(zhì)粒制細(xì)菌配對和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移接合轉(zhuǎn)移的基因，因此不能從一的基因，因此不能從一個細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個細(xì)胞。個細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個細(xì)胞。第23頁/共244頁第24頁/共244頁帶有控制帶有控制大腸桿菌素（

13、大腸桿菌素（colicin）合成的基因合成的基因大腸桿菌素對不帶大腸桿菌素對不帶Col質(zhì)粒的大腸桿菌有毒。質(zhì)粒的大腸桿菌有毒。第25頁/共244頁（1）如：分子量大，拷貝數(shù)低）如：分子量大，拷貝數(shù)低1、天然質(zhì)粒的局限性、天然質(zhì)粒的局限性第一個用于基因克隆的天然質(zhì)粒第一個用于基因克隆的天然質(zhì)粒pSC101，分子長，分子長 9.1 kb。有一個有一個EcoR I酶切位點(diǎn)充當(dāng)克隆位點(diǎn)酶切位點(diǎn)充當(dāng)克隆位點(diǎn)，Tetr 作為篩選標(biāo)志。作為篩選標(biāo)志。第26頁/共244頁第27頁/共244頁ColE1質(zhì)粒的篩選標(biāo)志是大腸桿菌素質(zhì)粒的篩選標(biāo)志是大腸桿菌素E1（colicin E1）可以通過插入失活篩選。但細(xì)菌群

14、體容易自可以通過插入失活篩選。但細(xì)菌群體容易自發(fā)突變出抗發(fā)突變出抗colicin E1的細(xì)胞的細(xì)胞.colicin E1能殺死不含能殺死不含ColE1 質(zhì)粒的菌。質(zhì)粒的菌。第28頁/共244頁（1） 具有復(fù)制起始位點(diǎn)（具有復(fù)制起始位點(diǎn)（ORI）（2）具有合適的選擇標(biāo)記基因）具有合適的選擇標(biāo)記基因（3）若干限制性內(nèi)切酶的單一位點(diǎn)（）若干限制性內(nèi)切酶的單一位點(diǎn)（MCS）是篩選的標(biāo)志。理想的載體應(yīng)該有兩種選擇標(biāo)記基因是篩選的標(biāo)志。理想的載體應(yīng)該有兩種選擇標(biāo)記基因用來插入外源用來插入外源DNA片斷，且插入后不影響復(fù)制功片斷，且插入后不影響復(fù)制功能能一般選擇組裝松弛型質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)。一般選擇組裝松弛型

15、質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)。第29頁/共244頁第30頁/共244頁（4）具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)）具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)縮短長度縮短長度“輕裝上陣輕裝上陣”，大于，大于15 kb的質(zhì)的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率明顯下降粒的轉(zhuǎn)化率明顯下降第31頁/共244頁氨芐青霉素抗性（氨芐青霉素抗性（Ampr） 卡那霉素抗性卡那霉素抗性 （Kanr） 四環(huán)素抗性四環(huán)素抗性 （Tetr） 鏈霉素抗性鏈霉素抗性 （Strr） 氯霉素抗性氯霉素抗性 （Cmlr）（1）選擇標(biāo)記）選擇標(biāo)記絕大多數(shù)質(zhì)粒載體都是用抗生素抗性標(biāo)記絕大多數(shù)質(zhì)粒載體都是用抗生素抗性標(biāo)記：第32頁/共244頁i）氨芐青霉素（）氨芐青霉素（Ampicil

16、lin，Amp）青霉素的衍生物。青霉素的衍生物。通過干擾細(xì)菌細(xì)胞壁合成的末端反應(yīng)，通過干擾細(xì)菌細(xì)胞壁合成的末端反應(yīng)，殺死殺死生長的細(xì)菌生長的細(xì)菌。a）抑菌原理）抑菌原理b）細(xì)菌抗性原理）細(xì)菌抗性原理Ampr基因編碼基因編碼 -內(nèi)酰胺酶內(nèi)酰胺酶，特異地切割，特異地切割氨芐青霉素的氨芐青霉素的 -內(nèi)酰胺環(huán)。內(nèi)酰胺環(huán)。 第33頁/共244頁通過與通過與50S核糖體亞基結(jié)合，干擾細(xì)胞蛋白質(zhì)核糖體亞基結(jié)合，干擾細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成并阻止肽鍵的形成。殺死的合成并阻止肽鍵的形成。殺死生長的細(xì)菌生長的細(xì)菌。b）細(xì)菌抗性原理）細(xì)菌抗性原理Cmlr 編碼編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶乙酰轉(zhuǎn)移酶，特異地使氯霉素乙，特異地使氯霉素乙酰化

17、而失活。?；Щ睢）抑菌原理）抑菌原理第34頁/共244頁通過與通過與30S核糖體亞基結(jié)合，導(dǎo)致核糖體亞基結(jié)合，導(dǎo)致mRNA錯譯。錯譯。通過于通過于30S核糖體亞基結(jié)合，干擾細(xì)胞蛋白質(zhì)核糖體亞基結(jié)合，干擾細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成并阻止肽鍵的形成。殺死的合成并阻止肽鍵的形成。殺死生長的細(xì)菌生長的細(xì)菌。通過與通過與70S核糖體結(jié)合，導(dǎo)致核糖體結(jié)合，導(dǎo)致mRNA發(fā)生錯讀發(fā)生錯讀。第35頁/共244頁第36頁/共244頁第37頁/共244頁使受體菌發(fā)生遺傳性狀的改變的基因。使受體菌發(fā)生遺傳性狀的改變的基因。第38頁/共244頁第39頁/共244頁當(dāng)帶有當(dāng)帶有抗生素抗性基因抗生素抗性基因的的載體載體進(jìn)入受體

18、菌后，進(jìn)入受體菌后，受體菌才能生長。受體菌才能生長。不帶有不帶有抗生素抗性基因抗生素抗性基因的受體菌不能在含有抗的受體菌不能在含有抗生素的培養(yǎng)基（選擇培養(yǎng)基）中生長。生素的培養(yǎng)基（選擇培養(yǎng)基）中生長?；罨钏浪揽剐曰蚩剐曰蚩股乜股氐?0頁/共244頁（1）高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體）高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體ColE1、pMB1派生質(zhì)粒具有高拷貝數(shù)的特點(diǎn)。派生質(zhì)粒具有高拷貝數(shù)的特點(diǎn)。 而且在沒有菌體蛋白質(zhì)合成的條件下（蛋白質(zhì)合而且在沒有菌體蛋白質(zhì)合成的條件下（蛋白質(zhì)合成抑制劑，氯霉素等存在下）仍能復(fù)制，達(dá)到每個細(xì)成抑制劑，氯霉素等存在下）仍能復(fù)制，達(dá)到每個細(xì)胞的拷貝數(shù)胞的拷貝數(shù)1000-3000個！質(zhì)粒

19、個！質(zhì)粒DNA含量可達(dá)細(xì)胞含量可達(dá)細(xì)胞DNA總量的總量的40-50。適合大量增殖克隆基因、或需要表達(dá)大量的適合大量增殖克隆基因、或需要表達(dá)大量的基因產(chǎn)物。基因產(chǎn)物。第41頁/共244頁P(yáng)lasmid amplification第42頁/共244頁 但有特殊用途但有特殊用途:由由pSC101派生來的載體，分子量小，拷貝數(shù)低。派生來的載體，分子量小，拷貝數(shù)低。當(dāng)有些被克隆的基因的表達(dá)產(chǎn)物過多時會嚴(yán)重地當(dāng)有些被克隆的基因的表達(dá)產(chǎn)物過多時會嚴(yán)重地影響寄主菌的正常代謝活動，導(dǎo)致寄主菌死亡時影響寄主菌的正常代謝活動，導(dǎo)致寄主菌死亡時，就需要低拷貝的載體。，就需要低拷貝的載體。pLG338、pLG339、p

20、HSG415等等不適合大量擴(kuò)增不適合大量擴(kuò)增DNA用。用。第43頁/共244頁這是一類這是一類溫度敏感型復(fù)制控制溫度敏感型復(fù)制控制質(zhì)粒。質(zhì)粒。溫度低（低于溫度低（低于37 oC），拷貝數(shù)很少；），拷貝數(shù)很少； 溫度增加（溫度增加（40 oC）時，拷貝數(shù)會很快增加到）時，拷貝數(shù)會很快增加到1000個以上。個以上。如如pBEU1、pBEU2。runaway plasmid vectors1979年年B. E. Uhlin等構(gòu)建。等構(gòu)建。第44頁/共244頁載體的克隆位點(diǎn)位于其某一個選擇性標(biāo)記基載體的克隆位點(diǎn)位于其某一個選擇性標(biāo)記基因內(nèi)部。因內(nèi)部。如如pDF41、pDF42、pBR329。抗生素抗性

21、抗生素抗性外源外源DNA無抗生素抗性無抗生素抗性第45頁/共244頁如如pUR2、pTR262等。等。只有帶有選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化菌細(xì)胞，才能只有帶有選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化菌細(xì)胞，才能在選擇培養(yǎng)基上生長。在選擇培養(yǎng)基上生長。直接選擇轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞。直接選擇轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞。目前通用的絕大部分質(zhì)粒載體都是正選擇載體。目前通用的絕大部分質(zhì)粒載體都是正選擇載體。Direct selection vectors第46頁/共244頁主要用來使外源基因表達(dá)出蛋白質(zhì)產(chǎn)物。主要用來使外源基因表達(dá)出蛋白質(zhì)產(chǎn)物。如果在大腸桿菌里表達(dá)，必須把所克隆的基因如果在大腸桿菌里表達(dá)，必須把所克隆的基因置于大腸桿菌的轉(zhuǎn)錄置于大腸桿菌的轉(zhuǎn)

22、錄-翻譯信號控制之下。翻譯信號控制之下。注意啟動子的性質(zhì)，終止子、起始密碼注意啟動子的性質(zhì)，終止子、起始密碼、終止密碼的閱讀正確。、終止密碼的閱讀正確。第47頁/共244頁復(fù)制起始點(diǎn)復(fù)制起始點(diǎn)ORI 選擇標(biāo)記選擇標(biāo)記 多克隆位點(diǎn)多克隆位點(diǎn)MCS2）大腸桿菌操縱子元件）大腸桿菌操縱子元件阻遏基因阻遏基因 I 操縱基因操縱基因O 啟動基因啟動基因P 核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列（核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列（SD） 轉(zhuǎn)錄終止信號區(qū)。轉(zhuǎn)錄終止信號區(qū)。1）普通克隆載體元件）普通克隆載體元件第48頁/共244頁 質(zhì)粒載體的選擇質(zhì)粒載體的選擇理想質(zhì)粒載體應(yīng)具備的條件理想質(zhì)粒載體應(yīng)具備的條件* *第49頁/共244頁1. pS

23、C101第一個成功地用于克隆實(shí)驗(yàn)的大腸桿菌質(zhì)粒載體。第一個成功地用于克隆實(shí)驗(yàn)的大腸桿菌質(zhì)粒載體。（1）類型）類型天然質(zhì)粒，屬低拷貝型。天然質(zhì)粒，屬低拷貝型。（2）長度）長度9.09 kb（3）選擇標(biāo)記）選擇標(biāo)記四環(huán)素抗性四環(huán)素抗性Tetr第50頁/共244頁6個克隆位點(diǎn)：個克隆位點(diǎn)： EcoR I、Xho I、Pvu I、Hind III、BamH I、Sal I 主要使用主要使用EcoR I。（其中（其中Hind III、BamH I、Sal I 3個位于、個位于、Tetr內(nèi)部）內(nèi)部）第51頁/共244頁（1）類型）類型天然質(zhì)粒，屬高拷貝型。天然質(zhì)粒，屬高拷貝型。（2）長度）長度6.3 kb

24、。（3）選擇標(biāo)記）選擇標(biāo)記特點(diǎn)是在培養(yǎng)基中加入氯霉素抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)特點(diǎn)是在培養(yǎng)基中加入氯霉素抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成后，質(zhì)粒仍然能復(fù)制達(dá)到每個細(xì)胞合成后，質(zhì)粒仍然能復(fù)制達(dá)到每個細(xì)胞1000-3000拷貝之多！拷貝之多！大腸桿菌素（大腸桿菌素（colicin）E1和對和對E1免疫免疫的基因（的基因（immE1）第52頁/共244頁 colicin E1基因的結(jié)構(gòu)基因的結(jié)構(gòu)ceaimmkil結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因免疫基因免疫基因溶菌基因溶菌基因 殺死不含有殺死不含有ColE1細(xì)菌的原因細(xì)菌的原因cea + kil基因產(chǎn)物基因產(chǎn)物 不被其他細(xì)菌的不被其他細(xì)菌的colicin E1所殺死的原因所殺死的原因imm基

25、因基因第53頁/共244頁EcoR I位于位于E1內(nèi)部，插入外源內(nèi)部，插入外源DNA會導(dǎo)致會導(dǎo)致E1失活，使受體菌不能合成失活，使受體菌不能合成E1（ColE1-），但），但仍然表現(xiàn)出對仍然表現(xiàn)出對E1免疫型（免疫型（ImmE1+）。）。EcoR IColicin E1外源外源DNA無無Colicin第54頁/共244頁 用對外源用對外源colicin E1的免疫性和自身不能合成的免疫性和自身不能合成colicin E1作選擇，操作非常繁雜。作選擇，操作非常繁雜。 對對colicin E1敏感的細(xì)菌群體中自發(fā)突變產(chǎn)生敏感的細(xì)菌群體中自發(fā)突變產(chǎn)生抗抗colicin E1的頻率很高！的頻率很高！C

26、olE1抗抗 colicinE1殺殺ColE1-仍抗仍抗 colicinE1不殺不殺ColE1-插入片斷插入片斷ColE1第55頁/共244頁復(fù)制位點(diǎn)復(fù)制位點(diǎn)選擇性標(biāo)記選擇性標(biāo)記克隆位點(diǎn)克隆位點(diǎn)克隆載體克隆載體表達(dá)載體表達(dá)載體表達(dá)調(diào)控元件表達(dá)調(diào)控元件必必須須的的第56頁/共244頁嚴(yán)緊型：嚴(yán)緊型：松弛型：松弛型：拷貝數(shù)拷貝數(shù)是否轉(zhuǎn)移是否轉(zhuǎn)移接合型：接合型：非接合型：非接合型： 1-3個拷貝個拷貝10個以上個以上F質(zhì)粒，不安全質(zhì)粒，不安全 R 質(zhì)粒，安全質(zhì)粒，安全 Col質(zhì)粒質(zhì)粒第57頁/共244頁不相容性不相容性 在沒有選擇壓力的情況下，兩種在沒有選擇壓力的情況下，兩種親緣關(guān)系密切親緣關(guān)系密切

27、的不的不同質(zhì)粒，不能在同一宿主細(xì)胞中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。在同質(zhì)粒，不能在同一宿主細(xì)胞中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。在細(xì)胞的增殖過程中，其中必有一種會被逐漸地排斥（稀細(xì)胞的增殖過程中，其中必有一種會被逐漸地排斥（稀釋）掉。這樣的兩種質(zhì)粒稱為不相容質(zhì)粒。釋）掉。這樣的兩種質(zhì)粒稱為不相容質(zhì)粒。 如果在其寄主細(xì)胞中存在著一種接合型的質(zhì)粒，非如果在其寄主細(xì)胞中存在著一種接合型的質(zhì)粒，非接合型質(zhì)粒也可以被轉(zhuǎn)移。這種由共存的接合型質(zhì)粒引接合型質(zhì)粒也可以被轉(zhuǎn)移。這種由共存的接合型質(zhì)粒引發(fā)的非接合型質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移過程，叫做質(zhì)粒的遷移作用。發(fā)的非接合型質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移過程，叫做質(zhì)粒的遷移作用。質(zhì)粒的遷移作用質(zhì)粒的遷移作用第58頁/共2

28、44頁（1）高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體：）高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體： ColE1、pMB1溫度低（低于溫度低（低于37 oC），拷貝數(shù)很少；），拷貝數(shù)很少； 溫度增加（溫度增加（40 oC）時，拷貝數(shù)會很快增加到）時，拷貝數(shù)會很快增加到1000個以上。個以上。第59頁/共244頁（4） 插入失活型質(zhì)粒載體插入失活型質(zhì)粒載體抗生素抗性抗生素抗性外源外源DNA無抗生素抗性無抗生素抗性第60頁/共244頁第61頁/共244頁1. pSC101第62頁/共244頁2. ColE1（1）天然質(zhì)粒，高拷貝，可氯霉素?cái)U(kuò)）天然質(zhì)粒，高拷貝，可氯霉素?cái)U(kuò)增增（2）長度）長度6.3 kb。（3）選擇標(biāo)記：大腸桿菌素）選擇標(biāo)記：大

29、腸桿菌素E1 對對E1免疫的基因免疫的基因第63頁/共244頁pSP2124質(zhì)粒的質(zhì)粒的Ampr基因基因（1）元件來源）元件來源分子克隆之父分子克隆之父Boyer的兩個博士后的兩個博士后Bolivar和和Rodriguez構(gòu)建構(gòu)建 復(fù)制起點(diǎn)復(fù)制起點(diǎn) ori來源于質(zhì)粒來源于質(zhì)粒pMB1系列，系列，高拷貝高拷貝型復(fù)制起點(diǎn)型復(fù)制起點(diǎn) Ampr基因基因 Tetr基因基因pSC101的的Tetr 基因。基因。第64頁/共244頁（2）長度）長度4363bp（3）選擇標(biāo)記）選擇標(biāo)記氨芐青霉素和四環(huán)素抗性。氨芐青霉素和四環(huán)素抗性。（4）克隆位點(diǎn)）克隆位點(diǎn)其中其中9個會導(dǎo)致個會導(dǎo)致Tetr基因失活（如基因失活

30、（如BamH I、Sal I）；）；3個會導(dǎo)致個會導(dǎo)致Ampr基因失活（基因失活（Sca I、PvuI、Pst I）。）。24個克隆位點(diǎn)。個克隆位點(diǎn)。第65頁/共244頁第66頁/共244頁 雙抗生素抗性選擇標(biāo)記雙抗生素抗性選擇標(biāo)記 沒有獲得載體的寄主細(xì)胞沒有獲得載體的寄主細(xì)胞 在在Amp或或Tet中中都都死亡。死亡。獲得載體的寄主細(xì)胞獲得載體的寄主細(xì)胞 在在Amp或或Tet其中之一其中之一中死亡。中死亡。插入失活，分兩次先后選擇：插入失活，分兩次先后選擇：第67頁/共244頁外源基因外源基因BamH IAmp中存活中存活但在但在Tet中死亡中死亡外源基因外源基因Pst ITet中存活中存活但

31、在但在Amp中死亡中死亡第68頁/共244頁氯霉素?cái)U(kuò)增之后，每個細(xì)胞可達(dá)氯霉素?cái)U(kuò)增之后，每個細(xì)胞可達(dá)10003000 copy，達(dá)細(xì)胞，達(dá)細(xì)胞DNA總量的總量的4050 安全安全失去了轉(zhuǎn)移蛋白基因失去了轉(zhuǎn)移蛋白基因mob（mobilization）。不能通過接合轉(zhuǎn)移。不能通過接合轉(zhuǎn)移。 分子小，克隆能力大分子小，克隆能力大4361bp，載體越小越好。，載體越小越好。 10kb的的DNA在純化過程中容易斷裂。在純化過程中容易斷裂。第69頁/共244頁保留了轉(zhuǎn)移蛋白（保留了轉(zhuǎn)移蛋白（bom）的）的作用位點(diǎn)作用位點(diǎn)。 部分質(zhì)粒雖不含部分質(zhì)粒雖不含tra基因，但含有基因，但含有bom位點(diǎn)（位點(diǎn)（ori

32、T），當(dāng)宿主細(xì)胞內(nèi)同時含有），當(dāng)宿主細(xì)胞內(nèi)同時含有mob基因的輔助質(zhì)基因的輔助質(zhì)粒時，粒時， mob基因的產(chǎn)物可打開非接合質(zhì)粒的基因的產(chǎn)物可打開非接合質(zhì)粒的oriT位位點(diǎn)，借助于接合質(zhì)粒點(diǎn)，借助于接合質(zhì)粒tra基因的產(chǎn)物，使非接合質(zhì)?；虻漠a(chǎn)物，使非接合質(zhì)粒被動遷移到受體細(xì)胞中，發(fā)生遷移作用。被動遷移到受體細(xì)胞中，發(fā)生遷移作用。第70頁/共244頁University of California的的J. Messing和和J. Vieria于于1978年，在年，在pBR322的基礎(chǔ)上改造而的基礎(chǔ)上改造而成。屬于正選擇載體。成。屬于正選擇載體。pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11

33、、pUC18、pUC19第71頁/共244頁 復(fù)制起點(diǎn)復(fù)制起點(diǎn)pBR322的的 ori但其上失去了克隆位點(diǎn)。但其上失去了克隆位點(diǎn)。 Ampr 基因基因 lacZ的啟動子的啟動子大腸桿菌大腸桿菌 lacZ基因基因大腸桿菌大腸桿菌lacZ的的 -肽鏈序列，肽鏈序列， 是是lacZ 的的5末端片斷，用于藍(lán)白斑篩選。末端片斷，用于藍(lán)白斑篩選。pBR322的的Ampr基因基因第72頁/共244頁（2）長度）長度約約2686bp（3）克隆位點(diǎn)）克隆位點(diǎn)10個連續(xù)的單一限制酶切位點(diǎn)，個連續(xù)的單一限制酶切位點(diǎn)，位于位于lacZ基因的基因的5端。端。第73頁/共244頁第74頁/共244頁AAGCTTGCATG

34、CCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCGGGGTACCGAGCTCGAATTC53EcoRISacIKpnISmaIXmaIBamHIXbaISalIAccIHincIIPstISphIHindpUC19lacZGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT53EcoRI SacIKpnISmaIXmaIBamHIXbaISalIAccIHincIIPstISphIHindpUC18lacZ第75頁/共244頁Ampicillin 抗性抗性和和 lacZ的的 肽互補(bǔ)肽互補(bǔ)（藍(lán)白斑）相結(jié)合。（藍(lán)白斑）相結(jié)合。 X-

35、gal -半乳糖苷酶顯色底物半乳糖苷酶顯色底物（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl- -D-galactoside）（5-溴溴-4氯氯-3-吲哚葡萄糖苷）吲哚葡萄糖苷）第76頁/共244頁 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶能把無色的化合物能把無色的化合物X-gal分解成分解成半乳糖和一個半乳糖和一個深藍(lán)色深藍(lán)色的物質(zhì)的物質(zhì)5-溴溴-4-氯靛藍(lán)。氯靛藍(lán)。X-gal半乳糖半乳糖5-溴溴-4-氯靛藍(lán)氯靛藍(lán) -半乳糖苷酶半乳糖苷酶第77頁/共244頁1） -肽（肽（ lacZ ）：）： -半乳糖苷酶半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片斷（端的一段氨基酸片斷（11-41氨基酸）。氨基酸）。lacZ只有在

36、只有在4聚體的狀態(tài)下才有功能聚體的狀態(tài)下才有功能.C端大部分端大部分N端的端的11-41aaC端大部分端大部分N端的端的11-41aaC端大部分端大部分N端的端的11-41aaC端大部分端大部分N端的端的11-41aa4聚體聚體第78頁/共244頁受體菌基因組的受體菌基因組的 -半乳糖苷酶基因的氨基端半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失有缺失（缺失 肽），不能形成肽），不能形成4聚體的活聚體的活性酶，不能分解性酶，不能分解X-gal 受體菌株：受體菌株：JM系列系列、TG1、TG2、XL1-blue、XS127、XS101、KK2186、MV1184、DH5a第79頁/共244頁pUC質(zhì)粒載體上

37、的質(zhì)粒載體上的lacZ 編碼編碼 肽與受體菌缺肽與受體菌缺失突變的失突變的 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶“互補(bǔ)互補(bǔ)”，形成，形成4聚體聚體，從而能分解，從而能分解X-gal，產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)。，產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)。C端大部分端大部分N端的端的11-41aapUC lacZ 受體菌受體菌lacZ第80頁/共244頁pUC載體上載體上LacZ的的5端有一段多克隆位點(diǎn)（端有一段多克隆位點(diǎn)（MCS）區(qū)，本身雖不干擾）區(qū)，本身雖不干擾LacZ的合成，但插入外源基的合成，但插入外源基因就會阻止因就會阻止LacZ的合成。不能互補(bǔ)。的合成。不能互補(bǔ)。 lacZ 5 3 肽移碼突變肽移碼突變lacZ 5 3 肽肽不互補(bǔ)不互補(bǔ)互

38、補(bǔ)互補(bǔ)MCS外源外源DNA第81頁/共244頁IPTG是乳糖的類似物。能誘導(dǎo)是乳糖的類似物。能誘導(dǎo)lac操縱子的操縱子的啟動轉(zhuǎn)錄，使受體菌基因組中的啟動轉(zhuǎn)錄，使受體菌基因組中的lacZ 的的C端端部分部分和載體的和載體的lacZ 肽肽都表達(dá)。從而互補(bǔ)。都表達(dá)。從而互補(bǔ)。但載體但載體MCS上插入外源上插入外源DNA后，仍然不能后，仍然不能產(chǎn)生產(chǎn)生 肽！肽！IPTG第82頁/共244頁通過看培養(yǎng)皿上的菌斑的顏色就能直接知道是否有通過看培養(yǎng)皿上的菌斑的顏色就能直接知道是否有DNA插入。插入。MCS無插入時，互補(bǔ)，藍(lán)菌斑。無插入時，互補(bǔ)，藍(lán)菌斑。 MCS有插入時，不互補(bǔ)，白菌斑。有插入時，不互補(bǔ)，白菌

39、斑。第83頁/共244頁第84頁/共244頁第85頁/共244頁 更小的分子量，更高的拷貝更小的分子量，更高的拷貝pUC18為為2686bp，500700拷貝。拷貝。 選擇方便選擇方便X-gal顯色、抗生素雙重直接選擇。顯色、抗生素雙重直接選擇。 克隆便利克隆便利具有多克隆位點(diǎn)（具有多克隆位點(diǎn)（MCS），使有兩個不同粘性），使有兩個不同粘性末端的外源末端的外源DNA方便地插入。方便地插入。 測序方便測序方便M13通用引物通用引物第86頁/共244頁pGEM-T vector第87頁/共244頁AATTT vectorPCR productT4 DNA ligaseAA第88頁/共244頁1.

40、喪失遷移功能的質(zhì)粒載體喪失遷移功能的質(zhì)粒載體pBR327在在pBR322的基礎(chǔ)上去掉了的基礎(chǔ)上去掉了1089bp的片段的片段（2）比）比pBR322有更高的拷貝，平均每個細(xì)胞中含有更高的拷貝，平均每個細(xì)胞中含有有30-45個拷貝。個拷貝。（1）刪除）刪除bom識別位點(diǎn)，即便在共存的識別位點(diǎn)，即便在共存的F質(zhì)粒提供質(zhì)粒提供轉(zhuǎn)移裝置的條件下，也不可能發(fā)生遷移作用。保證轉(zhuǎn)移裝置的條件下，也不可能發(fā)生遷移作用。保證了基因工程的安全性。了基因工程的安全性。第89頁/共244頁2. 能在體外轉(zhuǎn)錄克隆基因的質(zhì)粒載體能在體外轉(zhuǎn)錄克隆基因的質(zhì)粒載體pGEM-3Z由由pUC派生而來，主要區(qū)別是在派生而來，主要區(qū)別

41、是在MCS的兩側(cè)的兩側(cè)分別加了一個噬菌體分別加了一個噬菌體啟動子啟動子T7和和SP6。T7啟動子啟動子SP6啟動子啟動子MCSlacZ Amprori可被可被T7和和SP6的的RNA聚合酶識別轉(zhuǎn)錄。聚合酶識別轉(zhuǎn)錄。第90頁/共244頁 如果加入純化的如果加入純化的T7或或SP6 RNA聚合酶，在試聚合酶，在試管里就可以體外轉(zhuǎn)錄管里就可以體外轉(zhuǎn)錄mRNA 外源基因正接反接都可以轉(zhuǎn)錄。外源基因正接反接都可以轉(zhuǎn)錄。pGEM-4Z與與pGEM-3Z相同，只是相同，只是T7啟動子和啟動子和SP6啟啟動子的動子的位置互換位置互換。 MCS與與pUC18的完全一樣。的完全一樣。第91頁/共244頁（1）穿梭

42、質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)）穿梭質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)人工構(gòu)建的、具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇標(biāo)記、可以人工構(gòu)建的、具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇標(biāo)記、可以在兩種不同類群的寄主中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。在兩種不同類群的寄主中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。（shuttle plasmid vectors）第92頁/共244頁Yeast復(fù)制起點(diǎn)復(fù)制起點(diǎn)復(fù)制起點(diǎn)復(fù)制起點(diǎn)選擇標(biāo)記選擇標(biāo)記Yeast選擇標(biāo)記選擇標(biāo)記MCS大腸桿菌大腸桿菌 枯草桿菌穿梭載體枯草桿菌穿梭載體 大腸桿菌大腸桿菌 釀酒酵母穿梭載體釀酒酵母穿梭載體 大腸桿菌大腸桿菌 動物細(xì)胞穿梭載體動物細(xì)胞穿梭載體第93頁/共244頁第94頁/共244頁 也能利用其它細(xì)胞系統(tǒng)（酵母

43、、枯草桿菌、也能利用其它細(xì)胞系統(tǒng)（酵母、枯草桿菌、哺乳動物細(xì)胞等）進(jìn)行基因表達(dá)。哺乳動物細(xì)胞等）進(jìn)行基因表達(dá)。 可以自如地在兩種不同寄主細(xì)胞之間來可以自如地在兩種不同寄主細(xì)胞之間來回轉(zhuǎn)移基因。回轉(zhuǎn)移基因。構(gòu)建、克隆構(gòu)建、克隆表達(dá)表達(dá)Animal cell 利用大腸桿菌進(jìn)行基因克隆利用大腸桿菌進(jìn)行基因克隆第95頁/共244頁1. 質(zhì)粒穩(wěn)定遺傳必須的兩個條件：質(zhì)粒穩(wěn)定遺傳必須的兩個條件：（1）每個世代、每個質(zhì)粒至少要復(fù)制一次）每個世代、每個質(zhì)粒至少要復(fù)制一次（2）在細(xì)胞分裂時，復(fù)制過的質(zhì)粒必須分配）在細(xì)胞分裂時，復(fù)制過的質(zhì)粒必須分配到兩個子細(xì)胞中。到兩個子細(xì)胞中。第96頁/共244頁有主動分配和隨

44、機(jī)分配兩種假說。有主動分配和隨機(jī)分配兩種假說。（1）主動分配）主動分配天然質(zhì)粒。天然質(zhì)粒。具有一個具有一個控制質(zhì)粒拷貝分配控制質(zhì)?？截惙峙涞墓δ軈^(qū)（的功能區(qū)（Par），能以主動分配的方式確保質(zhì)粒能正確分配，能以主動分配的方式確保質(zhì)粒能正確分配到兩個子細(xì)胞中。到兩個子細(xì)胞中。第97頁/共244頁人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體缺失了缺失了par區(qū)區(qū)，只能以，只能以隨機(jī)分配方式分到子細(xì)胞中。隨機(jī)分配方式分到子細(xì)胞中。人工質(zhì)粒人工質(zhì)粒（一般情況下也能保證質(zhì)粒的穩(wěn)定遺傳）（一般情況下也能保證質(zhì)粒的穩(wěn)定遺傳）但在一定條件下會出現(xiàn)質(zhì)粒丟失的現(xiàn)象但在一定條件下會出現(xiàn)質(zhì)粒丟失的現(xiàn)象。第98頁/共244頁在

45、寄主菌細(xì)胞分裂的過程中，有一個細(xì)胞沒有獲在寄主菌細(xì)胞分裂的過程中，有一個細(xì)胞沒有獲得質(zhì)?？截悾⒆罱K繁殖成無質(zhì)粒的優(yōu)勢群體。得質(zhì)?？截悾⒆罱K繁殖成無質(zhì)粒的優(yōu)勢群體。（segregation instability）第99頁/共244頁（structural instability）寄主基因組的插入序列插入質(zhì)粒、質(zhì)粒間的同源寄主基因組的插入序列插入質(zhì)粒、質(zhì)粒間的同源重組等都會使質(zhì)粒發(fā)生插入或缺失。重組等都會使質(zhì)粒發(fā)生插入或缺失。ISdimer重組重組第100頁/共244頁（1）新陳代謝負(fù)荷：）新陳代謝負(fù)荷：使寄主細(xì)胞生長減緩：使寄主細(xì)胞生長減緩：質(zhì)粒載體使寄主的世代時間延長約質(zhì)粒載體使寄主的世

46、代時間延長約15%。減緩的程度與質(zhì)粒的分子量成正比。減緩的程度與質(zhì)粒的分子量成正比。復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯負(fù)荷復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯負(fù)荷丟失質(zhì)粒的細(xì)胞反而會成為優(yōu)勢群體！丟失質(zhì)粒的細(xì)胞反而會成為優(yōu)勢群體！第101頁/共244頁不同細(xì)胞個體之間的質(zhì)粒載體拷貝數(shù)的差不同細(xì)胞個體之間的質(zhì)粒載體拷貝數(shù)的差異程度，稱差度。異程度，稱差度。低拷貝數(shù)的質(zhì)粒的差度小，遺傳穩(wěn)定。低拷貝數(shù)的質(zhì)粒的差度小，遺傳穩(wěn)定。差度（差度（variance）：）：是產(chǎn)生無質(zhì)粒細(xì)胞的重要原因。是產(chǎn)生無質(zhì)粒細(xì)胞的重要原因。高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體差度大，擁有少量拷貝數(shù)的高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體差度大，擁有少量拷貝數(shù)的菌體多，發(fā)生丟失的可能性大。菌體多，發(fā)

47、生丟失的可能性大。第102頁/共244頁質(zhì)粒載體之間發(fā)生重組會形成二聚體、三聚體，甚至四聚質(zhì)粒載體之間發(fā)生重組會形成二聚體、三聚體，甚至四聚體等所謂的質(zhì)粒寡聚體，其穩(wěn)定性比單體差。體等所謂的質(zhì)粒寡聚體，其穩(wěn)定性比單體差。含有大分子量插入片斷的質(zhì)粒載體普遍能形成質(zhì)粒寡聚體含有大分子量插入片斷的質(zhì)粒載體普遍能形成質(zhì)粒寡聚體。野生型野生型中，質(zhì)粒在寄主的中，質(zhì)粒在寄主的重組酶重組酶作用下會發(fā)生作用下會發(fā)生重組形成重組形成二聚體質(zhì)粒二聚體質(zhì)粒。二聚體災(zāi)難（二聚體災(zāi)難（dimer catastrophe）：）：重組的質(zhì)粒二聚體一旦形成，便會以高出質(zhì)粒單體分子兩重組的質(zhì)粒二聚體一旦形成，便會以高出質(zhì)粒單體

48、分子兩倍的速度進(jìn)行復(fù)制，從而導(dǎo)致出現(xiàn)質(zhì)粒寡聚體的克隆增殖倍的速度進(jìn)行復(fù)制，從而導(dǎo)致出現(xiàn)質(zhì)粒寡聚體的克隆增殖第103頁/共244頁第104頁/共244頁（1）喪失遷移功能的質(zhì)粒載體：）喪失遷移功能的質(zhì)粒載體： pBR327第105頁/共244頁（1）主動分配：）主動分配： 天然質(zhì)粒天然質(zhì)粒第106頁/共244頁（1）新陳代謝負(fù)荷）新陳代謝負(fù)荷差度（差度（variance）：）：二聚體災(zāi)難（二聚體災(zāi)難（dimer catastrophe）：）：低拷貝數(shù)的質(zhì)粒的差度小，遺傳穩(wěn)定。高拷貝數(shù)的低拷貝數(shù)的質(zhì)粒的差度小，遺傳穩(wěn)定。高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體差度大，發(fā)生丟失的可能性大。質(zhì)粒載體差度大，發(fā)生丟失的可能性

49、大。第107頁/共244頁噬菌體或病毒是一類非細(xì)胞微生物，能噬菌體或病毒是一類非細(xì)胞微生物，能高效率高特異高效率高特異性性地地侵染侵染宿主細(xì)胞，然后或宿主細(xì)胞，然后或自主復(fù)制繁殖自主復(fù)制繁殖，或，或整合整合入宿入宿主基因組中潛伏起來，而且在一定的條件下上述主基因組中潛伏起來，而且在一定的條件下上述兩種狀兩種狀態(tài)態(tài)還會還會相互轉(zhuǎn)化相互轉(zhuǎn)化。上述特性使得噬菌體或病毒的上述特性使得噬菌體或病毒的DNA能被開發(fā)成為基因能被開發(fā)成為基因工程的有用載體，因?yàn)椋汗こ痰挠杏幂d體，因?yàn)椋?.高效率的感染性能使外源基因高效導(dǎo)入受體細(xì)胞高效率的感染性能使外源基因高效導(dǎo)入受體細(xì)胞2.自主復(fù)制繁殖性能使外源基因在受體細(xì)

50、胞中高效擴(kuò)自主復(fù)制繁殖性能使外源基因在受體細(xì)胞中高效擴(kuò)增增第108頁/共244頁分為兩種：分為兩種：1. 溶菌周期：溶菌周期：感染細(xì)菌后，立即在菌體內(nèi)復(fù)制和合成蛋白感染細(xì)菌后，立即在菌體內(nèi)復(fù)制和合成蛋白質(zhì)外殼，重新組裝成噬菌體顆粒，并導(dǎo)致細(xì)質(zhì)外殼，重新組裝成噬菌體顆粒，并導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞解體，釋放出大量子代噬菌體。菌細(xì)胞解體，釋放出大量子代噬菌體。烈性噬菌體（烈性噬菌體（virulent phage)第109頁/共244頁第110頁/共244頁感染細(xì)菌后，將自己的感染細(xì)菌后，將自己的DNA整合到細(xì)菌的染整合到細(xì)菌的染色體色體DNA中。形成這一過程稱為中。形成這一過程稱為溶源化溶源化。整合到細(xì)菌染色

51、體的噬菌體整合到細(xì)菌染色體的噬菌體DNA稱為稱為原噬菌原噬菌體體，隨細(xì)菌的染色體復(fù)制而復(fù)制。，隨細(xì)菌的染色體復(fù)制而復(fù)制。溫和噬菌體（溫和噬菌體（temperate phage)原噬菌體（原噬菌體（prophage)：第111頁/共244頁第112頁/共244頁雙鏈?zhǔn)删w載體雙鏈?zhǔn)删w載體噬菌體噬菌體單鏈?zhǔn)删w載體單鏈?zhǔn)删w載體M13 cosmid克隆載體克隆載體第113頁/共244頁（1）長度為）長度為48 502 bp； （2）雙鏈線性）雙鏈線性DNA； （3）兩端）兩端5末端帶有末端帶有cos位點(diǎn)，可以環(huán)化。位點(diǎn)，可以環(huán)化。 DNA兩端各有兩端各有12bp的粘性末端，粘性末端形的粘性末端，

52、粘性末端形成的雙鏈區(qū)域稱為成的雙鏈區(qū)域稱為cos位點(diǎn)。位點(diǎn)。1. DNA分子的特點(diǎn)分子的特點(diǎn)cos位點(diǎn)（位點(diǎn)（cohensive-end site）：）：第114頁/共244頁 DNA進(jìn)入菌體后，形成雙鏈環(huán)狀進(jìn)入菌體后，形成雙鏈環(huán)狀DNA復(fù)制型（復(fù)制型（RF DNA）第115頁/共244頁 DNA上有至少上有至少61個基因，有一半是必需的，與個基因，有一半是必需的，與自身的活動有關(guān)，功能相近的成簇排列。自身的活動有關(guān)，功能相近的成簇排列。 噬菌體生長的噬菌體生長的非必需基因，非必需基因，約占約占1/3，位于尾部合，位于尾部合成至阻遏之間的區(qū)段（成至阻遏之間的區(qū)段（J-N基因），為可替換區(qū)?；?/p>

53、），為可替換區(qū)。第116頁/共244頁第117頁/共244頁（1） 噬菌體是一種溫和噬菌體。噬菌體是一種溫和噬菌體。對大腸桿菌具有很高的感對大腸桿菌具有很高的感染能力，以原噬菌體的形式長期潛伏在溶原細(xì)胞中染能力，以原噬菌體的形式長期潛伏在溶原細(xì)胞中，容易保存。并且在一定條件下又可轉(zhuǎn)入溶菌生長，容易保存。并且在一定條件下又可轉(zhuǎn)入溶菌生長途徑，進(jìn)行大量增殖。途徑，進(jìn)行大量增殖。（2）能承載比較大的外源）能承載比較大的外源DNA片斷。片斷。野生型野生型 噬菌體頭部容噬菌體頭部容許包裝許包裝 DNA分子大小分子大小75%105%的的DNA片斷，約片斷，約36.451kb.而且而且 DNA上約有上約有2

54、0kb的區(qū)域?qū)Φ膮^(qū)域?qū)?噬菌體噬菌體的生長不是絕對需要的，可以缺失或被外源的生長不是絕對需要的，可以缺失或被外源DNA取取代。代。（3） DNA分子上分子上有多種限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。有多種限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。第118頁/共244頁（1）基因組太大（）基因組太大（48 502bp）；）；（2）酶切點(diǎn)太多，它有）酶切點(diǎn)太多，它有5個個BamH位點(diǎn)，位點(diǎn)，6個個Bg位點(diǎn)，位點(diǎn)，5個個EcoR位點(diǎn)。位點(diǎn)。（3 3）野生型只能接納一定長度的）野生型只能接納一定長度的DNA。相當(dāng)于。相當(dāng)于噬菌體的噬菌體的75-105%，那么能接納，那么能接納DNADNA最大為最大為： 49kb 噬菌體的缺陷：噬菌體的缺陷：第

55、119頁/共244頁 去除非必需區(qū)，建立克隆或替換位點(diǎn)去除非必需區(qū)，建立克隆或替換位點(diǎn) 非必需區(qū)內(nèi)插入選擇標(biāo)記基因非必需區(qū)內(nèi)插入選擇標(biāo)記基因 突變某些基因，使它成為安全載體突變某些基因，使它成為安全載體 刪除刪除 DNA必須區(qū)段上常用的限制酶切點(diǎn)必須區(qū)段上常用的限制酶切點(diǎn) 本身有本身有5個個 EcoR I 和和7 個個Hind III切點(diǎn)！切點(diǎn)！（1）構(gòu)建過程）構(gòu)建過程第120頁/共244頁兩種類型：兩種類型：插入型插入型: :噬菌體非必需區(qū)兩側(cè)有一對限制噬菌體非必需區(qū)兩側(cè)有一對限制性酶切位點(diǎn)，可被外源性酶切位點(diǎn)，可被外源DNADNA置換的載置換的載體，稱為置換型載體。體，稱為置換型載體。只含

56、一個限制性位點(diǎn)可供插入外源只含一個限制性位點(diǎn)可供插入外源DNADNA的載體，這類的載體，這類噬菌體載體稱插噬菌體載體稱插入型載體。入型載體。第121頁/共244頁 插入型載體（插入型載體（insertion vectors)只具有一個可供外源只具有一個可供外源DNA插入的克隆位點(diǎn)，也有一些有兩個插入的克隆位點(diǎn)，也有一些有兩個位點(diǎn)，但彼此靠近。廣泛用于位點(diǎn)，但彼此靠近。廣泛用于cDNA及小片段及小片段DNA的克隆。的克隆。插入位點(diǎn)位于合成活性阻遏物區(qū)域（插入位點(diǎn)位于合成活性阻遏物區(qū)域（cI基因基因）內(nèi)）內(nèi)cI基因表達(dá)，使基因表達(dá)，使 噬菌體進(jìn)入溶源狀態(tài)。噬菌體進(jìn)入溶源狀態(tài)。EcoR I gt10

57、（43 340 bp）第122頁/共244頁插入插入導(dǎo)致導(dǎo)致cI基因失活，基因失活，載體載體DNA不能進(jìn)入溶源期不能進(jìn)入溶源期，受體菌全部裂解，形成，受體菌全部裂解，形成清晰的噬菌斑。清晰的噬菌斑。 沒有外源沒有外源DNA插入的插入的 載體感染受體菌形成載體感染受體菌形成混濁噬混濁噬菌斑菌斑。如如 NM1149載體的兩個克隆位點(diǎn)（載體的兩個克隆位點(diǎn)（EcoR I 和和Hind III）都是位于）都是位于cI基因內(nèi)部。基因內(nèi)部。第123頁/共244頁 gt10基因組中引入了基因組中引入了LacZ序列。序列。感染感染LacZ突變的大腸桿菌，經(jīng)突變的大腸桿菌，經(jīng)IPTG的誘導(dǎo)，利的誘導(dǎo)，利用用X-g

58、al的顯色反應(yīng)的顯色反應(yīng)作選擇標(biāo)記。作選擇標(biāo)記。EcoR ICharon16A第124頁/共244頁可可克隆較大的克隆較大的DNA片段（片段（923kb），構(gòu)建基因組文庫），構(gòu)建基因組文庫兩個兩個MCS，反向重復(fù)位于非必需區(qū)兩端，反向重復(fù)位于非必需區(qū)兩端用酶切后，可以將中間的區(qū)段切下來，與用同樣酶切用酶切后，可以將中間的區(qū)段切下來，與用同樣酶切成的外源成的外源DNA片斷置換。片斷置換。選擇標(biāo)記選擇標(biāo)記：可取代片斷中如果包含：可取代片斷中如果包含LacZ，可用，可用Xgal顯色顯色作篩選標(biāo)記。作篩選標(biāo)記。 可置換區(qū)可置換區(qū)MCSMCS左左 臂臂右右 臂臂包 裝 蛋包 裝 蛋白白溶 源 循溶 源

59、循環(huán)環(huán)裂 解 生裂 解 生長長第125頁/共244頁 EMBL4的可置換片斷內(nèi)部還有的可置換片斷內(nèi)部還有Sal I酶切位點(diǎn)。酶切位點(diǎn)。以便于進(jìn)一步消化中間片斷，防止自我連接。以便于進(jìn)一步消化中間片斷，防止自我連接。左臂左臂可置換區(qū)可置換區(qū)右臂右臂EcoR I BamH I Sal ISal I BamH I EcoR ISal I Sal I EMBL4第126頁/共244頁Charon40的可置換片斷是由的可置換片斷是由DNA短片重復(fù)構(gòu)成，短片重復(fù)構(gòu)成，片斷之間有片斷之間有Hae I 切點(diǎn)切點(diǎn)。在克隆的時候，可以用在克隆的時候，可以用Hae I 酶進(jìn)一步將可置換片斷切成酶進(jìn)一步將可置換片斷切

60、成小片斷，以防止重新與載體連接。小片斷，以防止重新與載體連接。左臂左臂可置換區(qū)可置換區(qū)右臂右臂MCSMCSCharon40Hae I第127頁/共244頁置換型載體置換型載體第128頁/共244頁 DNA象質(zhì)粒載體那樣直接轉(zhuǎn)化細(xì)菌時效率遠(yuǎn)象質(zhì)粒載體那樣直接轉(zhuǎn)化細(xì)菌時效率遠(yuǎn)比質(zhì)粒低。比質(zhì)粒低。必須利用噬菌體外殼的作用必須利用噬菌體外殼的作用 轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)在試管中與在試管中與 噬菌體的噬菌體的頭部頭部和和尾部尾部蛋白人工裝蛋白人工裝配成噬菌體顆粒，才能高效地感染細(xì)菌，把重配成噬菌體顆粒，才能高效地感染細(xì)菌，把重組組DNA注入受體菌中。注入受體菌中。（1）體外包裝：）體外包裝：第129頁/共244頁第1