Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)—蛋白研究的多功能平臺(tái)

1、1會(huì)計(jì)學(xué)Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)紅外激光成像系統(tǒng)蛋白研究蛋白研究的多功能平臺(tái)的多功能平臺(tái)抗原抗原一抗結(jié)合一抗結(jié)合紅外熒光標(biāo)記的二抗紅外熒光標(biāo)記的二抗 Infrared dye (IRD800, Alexa680)l準(zhǔn)確定量準(zhǔn)確定量Wide linear dynamic rangel操作簡(jiǎn)便操作簡(jiǎn)便,直接檢測(cè)直接檢測(cè)No film, darkroom, or messy substratesl靈敏度高靈敏度高Equal to or better than chemiluminescencel多色檢測(cè)多色檢測(cè)Normalization increases quantification acc

2、uracyOdyssey系統(tǒng)的特點(diǎn)系統(tǒng)的特點(diǎn)TIMETIMECHEMILUMINESCENCE 動(dòng)態(tài)信號(hào)信號(hào)隨時(shí)間變化 信號(hào)不與目標(biāo)蛋白濃度成比例關(guān)系ODYSSEY 靜態(tài)信號(hào)信號(hào)不隨時(shí)間變化 信號(hào)和目標(biāo)蛋白濃度成比例關(guān)系High concentration / signalMedium concentration / signalLow concentration / signalSaturationBackground0,00,0INTENSITY實(shí)驗(yàn)步驟Odyssey:膜+一抗孵育+熒光標(biāo)記抗體孵育+Odyssey掃描成像ECL:膜+一抗孵育+酶聯(lián)二抗孵育+底物顯色+ UVP掃描成像實(shí)驗(yàn)?zāi)?/p>

3、的 檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染外源基因的表達(dá)狀況紅外熒光定量紅外熒光定量Western DEMOMarker S1 S2 S3 S4Marker S1 S2 S3 S4Odyssey結(jié)果 ECL結(jié)果 信號(hào)強(qiáng)度 51 20 10 4信號(hào)強(qiáng)度 302 62 30 19（Odyssey軟件分析結(jié)果） 結(jié)論Odyssey和ECL的相對(duì)靈敏度相差不大Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)具有更好的線性關(guān)系和更精確的定量結(jié)果 Odyssey掃描圖能同時(shí)看到Marker 和目標(biāo)蛋白，ECL看不到 Marker10:4:2:1 稀釋 膜上抗原一抗結(jié)合紅外標(biāo)記的二抗 Odyssey直接掃描直接掃描Infrared dye (IR

4、D800, Alexa680) 不需要底物不需要底物不需要底片不需要底片/暗室暗室信號(hào)持久信號(hào)持久ECLOdyssey1跑膠跑膠2轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜3封閉封閉4結(jié)合一抗、洗滌結(jié)合一抗、洗滌5結(jié)合酶標(biāo)記二抗、洗滌結(jié)合紅外染料標(biāo)記二抗、洗滌，成像6發(fā)光試劑盒7暗房曝光成像紅外熒光優(yōu)點(diǎn)紅外熒光優(yōu)點(diǎn)低背景低背景NIR DyesBiomoleculesPorphyrinsVisible FluorophoresPAHs1000 nm800600400200All othersequencers400-650 nmLI-COR700 - 800 nm硝酸纖維, 聚偏氟乙?。≒VDF）,生物分子和尼龍等物質(zhì)在可見(jiàn)熒光

5、范圍內(nèi)有很高的自身熒光。 紅外熒光紅外熒光 vs 可見(jiàn)熒可見(jiàn)熒光光膜背景信號(hào)膜背景信號(hào)紅外紅外背景低、背景低、SN更高更高紅外熒光紅外熒光 VS 化學(xué)發(fā)光化學(xué)發(fā)光定量線性范圍定量線性范圍Odyssey成像呈現(xiàn)一個(gè)很好的線性（定量準(zhǔn)確）成像呈現(xiàn)一個(gè)很好的線性（定量準(zhǔn)確）ECLODYSSEY紅外熒光紅外熒光 VS 化學(xué)發(fā)光化學(xué)發(fā)光線性寬的成像效果線性寬的成像效果Odyssey曝光秒曝光秒曝光分鐘曝光分鐘曝光分鐘曝光分鐘曝光分鐘曝光分鐘800 nm700 nmOverlay 兩套獨(dú)立激發(fā)檢測(cè)系統(tǒng) 700通道：680nm激發(fā) 720nm檢測(cè) 800通道：780nm激發(fā) 820nm檢測(cè)Target pr

6、oteinAnti-rabbit 800 channelNormalizer targetAnti-mouse 700 channel* Two-color detection requires primary antibodies from different hostsAnti-ERKAnti-phospho ERKResults OverlaidNon-StimulatedEGF-StimulatedNon-StimulatedEGF-StimulatedNon-StimulatedEGF-Stimulated700 nm channel800 nm channel700 and 800

7、 nm觀察EGF刺激后A431細(xì)胞中ERK1 and ERK2 (p44/42 MAP kinases)的磷酸化情況, 一抗分別是兔抗ERK抗體和小鼠抗磷酸化ERK抗體,二抗用 抗兔的IRDye800 標(biāo)記的抗體 (green),和抗鼠的 Alexa680 標(biāo)記的抗體 (red)ERK:胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶 EGF:表皮生長(zhǎng)因子Binding of T7 RNAP to two DNA fragments containing the T7 promoter sequence, labeled with either IRDye 700 (red) or IRDye 800 (green).700

8、 and 800 Overlay700 nm Channel800 nm ChannelDNA-Protein ComplexUnbound DNA IRDye 800Unbound DNA IRDye 700細(xì)胞培養(yǎng) Culture cells to confluency in 96-well or 384-well plates處理細(xì)胞 Treat cells (inhibitor, stimulator, etc)固定細(xì)胞 Fix cells (3.7%formaldehyde, methanol or Prefer)透化細(xì)胞 Permeabilize cells (0.1%Triton

9、-X 100)Incubate with IRDye secondary antibodies(e.g.: IRDye 680 and IRDye 800CW)Incubate with 2 primary antibodiesIncubate with 1 primary antibodyIncubate with IRDye secondary antibody anda DNA stain (e.g.: To-Pro-3)Odyssey系統(tǒng)掃描 Scan plate directly and analyze on the LI-COR Infrared Imaging Systems.I

10、n-Cell Western 工作流程工作流程隨著藥物濃度的增加，蛋白質(zhì)的活性形式出現(xiàn)了變化。這樣的技術(shù)平臺(tái)對(duì)于藥物的篩選和高通量信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的分析也是最佳選擇。ERK:胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶 EGF:表皮生長(zhǎng)因子 m nmInhibitor - - 3 1.5 750 375 180 90 45 22 11 5.5EGF - + + + + + + + + + + +700/800 nm 800 nm (Total ERK) 700 nm phosphorylated ERK Odyssey的擴(kuò)展應(yīng)用的擴(kuò)展應(yīng)用活體熒光檢測(cè) 考馬斯亮藍(lán)凝膠分析組織切片成像GFPRFPIRDye活體成像關(guān)鍵：l 增加

11、光信號(hào)的穿透性l 提高檢測(cè)的靈敏度700-900 nm，,組織的光吸收系數(shù)最低，能穿透幾厘米Moose Imaging Signal/BackgroundBackgroundHigh S/BLow S/B試劑試劑一張一張10 x10cm western blot10 x10cm western blot的費(fèi)用的費(fèi)用 Odyssey紅外熒光化學(xué)發(fā)光1 color2 color1 colorStrip and Reprobe二抗二抗（Odyssey所用紅外二抗推薦稀釋濃度 Odyssey 1:15000；化學(xué)發(fā)光1:5000)48918化學(xué)發(fā)光底物試劑化學(xué)發(fā)光底物試劑(0.1ml/cm2) 004892X X光片及洗片試劑光片及洗片試劑(1 Films/blot) 002.44.8蛋白蛋白MarkersMarkers（推薦用量Odyssey 2uL;化學(xué)發(fā)光10uL）221010總計(jì)總計(jì)61069.4124.8 抗原抗原一抗結(jié)合一抗結(jié)合紅外熒光標(biāo)記的二抗