哮喘豚鼠模型肺和骨髓中CCR3及CD34的表達及意義

1、哮喘豚鼠模型肺和骨髓中CCR3及CD34的表達及意義 作者：陳德忠, 付國昊, 朱述陽, 呂麗麗 趙傳云【摘要】 目的: 觀察哮喘豚鼠肺和骨髓組織CCR3及EOS不同時相表達的變化, 探討哮喘發(fā)病的可能機制。方法: 用卵白蛋白(OVA)和生理鹽水致敏法制備豚鼠哮喘和對照模型, 分為正常對照組（N）及哮喘組（A、 B、 C、 D、 E）, 每組8只, 于激發(fā)后30 min, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h處死, 瑞氏染色計數(shù)骨髓涂片和外周血涂片中EOS比例, 免疫組織化學技術(shù)檢測骨髓中CCR3及CD34蛋白的表達; 制備豚鼠肺組織病理標本, 蘇木精伊紅染色, 免疫組化檢測肺組織中CC

2、R3和CD34的表達。結(jié)果: (1)哮喘組骨髓和外周CCR3與CD34及EOS表達明顯增加; (2)OVA激發(fā)后, 骨髓和外周CCR3、 CD34及EOS表達: 30 min變化不明顯（肺內(nèi)CD34表達增加）, 6 h（肺內(nèi)CD34表達下降）、 12 h達到峰值, 24 h開始下降, 48 h恢復(fù)正常水平; (3)骨髓的變化早于外周, CCR3的表達高峰早于CD34表達與EOS的增多高峰, 且CCR3、 CD34和EOS互呈線性相關(guān)（肺組織內(nèi)除外）。結(jié)論: 哮喘豚鼠肺組織和骨髓之間存在骨髓CD34祖細胞、 EOS細胞到循環(huán)再到肺組織的通路, 骨髓和肺組織CCR3表達增強, 為CD34細胞、 E

3、OS從骨髓快速募集到肺組織提供了可能。 【關(guān)鍵詞】 支氣管哮喘; CCR3; CD34; 骨髓; 豚鼠2 / 17 哮喘是多種細胞（如嗜酸粒細胞、 肥大細胞、 淋巴細胞、 中性粒細胞和氣道上皮細胞等）和細胞組分參與的氣道炎癥性疾患, 哮喘氣道炎癥的特征性改變?yōu)槭人崃＜毎‥OS）的浸潤和活化。氣道黏膜下的 EOS主要來源于骨髓CD34+干細胞在某些細胞因子(如eotaxin, IL5)的誘導下分化成熟為EOS, 釋放入外周血, 在多種趨化信號的引導下向肺內(nèi)定向募集。這一現(xiàn)象意味著從骨髓循環(huán)氣道, 存在著調(diào)控EOS及其祖細胞定向遷移的信號通路。趨化因子eotaxin對EOS有高度的特異性, 其受

4、體3(CCR3)在EOS膜上大量存在, 且與eotaxin 有高度親和性, eotaxin是強有力的EOS趨化劑, eotaxin和CCR3 在哮喘發(fā)病機制中起重要作用。本實驗我們探討哮喘發(fā)作時骨髓和氣道之間的調(diào)控EOS定向遷移信號通路; 通過研究CCR3及CD34的表達, 分析CCR3及CD34的改變對EOS在骨髓增殖分化及其在肺組織趨化和浸潤的調(diào)節(jié)作用, 為臨床開發(fā)治療哮喘新方法提供理論依據(jù)。 1 材料和方法 1.1 材料 雄性豚鼠48只, 體質(zhì)量(250±50)g, 由徐州醫(yī)學院動物中心提供。隨機分為對照組（N）、 哮喘組(根據(jù)處死時間分為A、 B、 C、 D、 E組), 每組

5、8只。雞卵白蛋白(ovalbumin, OVA, 美國Sigma公司)、 CCR3、 CD34多克隆抗體及SABC免疫組化試劑盒(武漢Boster公司)、 奧林巴斯圖像采集系統(tǒng)、 德國百瑞霧化器和自制霧化箱。 1.2 方法 1.2.1 哮喘模型的建立 哮喘組于第1天腹腔注射抗原混懸液1 mL (OVA 100 mg、 氫氧化鋁200 mg), 2周后將豚鼠放于自制霧化吸入箱內(nèi), 噴射霧化吸入10 g/L OVA 20 min, 連續(xù)5 d1。對照組于第1天腹腔注射1 mL生理鹽水, 2周后噴射霧化吸入生理鹽水20 min, 連續(xù)5 d。最后1次霧化吸入后, 哮喘組A、 B、 C、 D、 E分別

6、于30 min, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h處死動物, 對照組12 h處死, 取材并作相應(yīng)測定。 1.2.2 骨髓和外周血EOS計數(shù) 于末次激發(fā)后, 斷頸處死豚鼠, 取頸動脈血制作血涂片。取兩側(cè)股骨, 去掉兩端骨骺, 剖開骨干髓腔, 以含肝素1667 kat/L的生理鹽水溶液將骨髓細胞沖洗出, 4, 1 000 r/min離心5 min后沉渣, 涂于多聚賴氨酸處理的玻片上, 干燥后以40 g/L多聚甲醛固定30 min, -20保存?zhèn)溆?。骨髓和外周血涂片用瑞氏染? 隨機計數(shù)200個白細胞, 并計算其中EOS百分比。 1.2.3 骨髓細胞CCR3、 CD34表達的檢測 采用SA

7、BC免疫組織化學法檢測骨髓中CCR3、 CD34的表達。以兔抗大鼠CCR3 IgG為一抗, 以生物素化的羊抗兔IgG為二抗。取骨髓沉渣涂片, 按SABC免疫組化試劑盒說明書處理。在光鏡下觀察結(jié)果, 胞膜為棕黃色者為陽性細胞, 在光鏡(×400)下隨機選取5個視野, 計數(shù)陽性細胞數(shù)占白細胞總數(shù)的比例。 1.2.4 肺組織EOS計數(shù)及CCR3、 CD34表達的檢測 無菌操作下切取部分肺組織, 40 g/L多聚甲醛固定, 常規(guī)石蠟包埋、 切片, 分別進行HE染色、 CCR3、 CD34免疫組化染色(嚴格按武漢Boster公司SABC試劑盒說明書操作) 。肺組織切片HE染色后, 每張切片計數(shù)

8、200個細胞, 計算其中EOS百分比。免疫組化計數(shù)方法: 光鏡下觀察胞膜著棕黃色為陽性細胞。每例選擇1張染色較好的切片, 顯微鏡下隨機選取5個高倍視野(×400), 計數(shù), 取每視野的均數(shù)。 1.2.5 統(tǒng)計學分析 計量數(shù)據(jù)均采用x±s表示, 用 Stata7.0軟件對數(shù)據(jù)進行t檢驗和相關(guān)分析, P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 2 結(jié)果 2.1 哮喘豚鼠氣道病理學改變 肺組織HE染色光鏡下可見: 與對照組相比哮喘組大、 中、 小支氣管收縮, 黏膜水腫, 平滑肌增厚, 上皮細胞腫脹, 部分上皮細胞變性、 壞死脫落, 杯狀細胞增生, 支氣管管腔狹窄甚至閉塞, 黏

9、液栓形成; 支氣管周圍血管擴張、 充血, 黏膜、 黏膜下層及肺泡區(qū)有大量的炎癥細胞浸潤, 主要為EOS、 淋巴細胞、 單核細胞; 肺泡間隔增厚。激發(fā)后30 min上述改變不明顯, 6 h, 12 h肺組織病變最明顯, 24 h, 48 h逐漸恢復(fù)到正常肺組織表現(xiàn)(圖1)。 2.2 外周血涂片、 骨髓細胞涂片及肺組織EOS計數(shù) 哮喘（豚鼠）激發(fā)后30 min, 與對照組相比變化不大, 且外周血EOS百分比稍有下降, 但無統(tǒng)計學意義; 6、 12 h升高明顯(P<0.01); 24 h開始下降(P<0.05); 48 h基本恢復(fù)到正常水平。哮喘組不同時間點之間EOS也存

10、在著變化: 6 h較30 min, EOS升高明顯(P<0.01); 12 h較6 h, 肺組織EOS變化不大(P>0.05), 骨髓和外周血升高(P<0.05); 24 h較12 h, 48 h較24 h, EOS呈下降趨勢(P<0.01); 6、 12 h時EOS增多最明顯, 與氣道病理學改變相一致, 24 h開始下降, 48 h回到正常水平。 骨髓變化先于肺和外周血, 且持續(xù)時間短(圖2)。 2.3 肺組織和骨髓中CCR3和CD34蛋白的表達 哮喘組肺組織和骨髓中CCR3和CD34蛋白陽性細胞呈棕黃色, 主要定位于細胞膜。肺組織中,

11、 氣道黏膜、 黏膜下層及血管周圍、 肺泡區(qū)有大量呈棕黃色的陽性細胞, 氣道黏膜上皮細胞、 血管內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞也有CCR3及CD34蛋白表達, 對照組在上述部位僅少量表達。骨髓細胞中, 呈棕黃色CCR3 蛋白陽性細胞大量表達于各階段Eos細胞表面; 而CD34大量表達于未成熟的EOS祖細胞表面.不同時間點CD34的表達趨勢和EOS的變化一致: 與正常組相比, 激發(fā)后30 min, 肺組織內(nèi)表達升高（P<0.05）, 骨髓內(nèi)略有下降, 不明顯（P>0.05）; 6 h時, 肺內(nèi)表達下降, 骨髓內(nèi)開始升高（P<0.01）; 12 h時, 肺組織和骨髓內(nèi)

12、CD34表達達到高峰（P<0.01）; 24、 48 h逐漸下降, 恢復(fù)到正常水平。但是CCR3的表達則稍有不同: 與對照組相比骨髓及肺組織中CCR3 30min時開始升高（P<0.05）; 6、 12 h達到高峰（P<0.01）; 24 h開始下降（P<0.05）; 48 h基本恢復(fù)到正常水平; 骨髓先升高, 肺組織隨著變化, 但持續(xù)時間長于骨髓。表1 肺組織和骨髓中CCR3/CD34蛋白的表達 2.4 肺組織和骨髓EOS表達與CCR3蛋白表達的關(guān)系 EOS表達與CCR3蛋白的表達存在著線性關(guān)系: 肺組織, r=0.93, P&

13、lt;0.01; 骨髓, r=0.95, P<0.01; 總, r=0.94, P<0.01。EOS表達與CD34蛋白的表達存在著線性關(guān)系: 肺組織, r=0.27, P>0.05; 骨髓, r=0.71, P<0.01; 總, r=0.38, P<0.01。CCR3蛋白表達與CD34蛋白的表達存在著線性關(guān)系: 肺組織, r=0.28, P>0.05; 骨髓, r=0.6291, P<0.01; 總, r=0.37, P<0.01。 3 討論 CCR3主要由單一肽鏈組成的7 個螺旋跨

14、膜結(jié)構(gòu), 屬于G 蛋白藕聯(lián)受體家族。CCR3 主要表達于EOS上, 介導其遷移及脫顆粒反應(yīng), , 在嗜堿性粒細胞、 CD4+T細胞和樹突細胞表面僅少量表達。Lamkhioued等2研究報道, CCR3固有表達于骨髓CD34+造血細胞表面。另有文獻3報道, 支氣管上皮細胞也表達CCR3, 而且與支氣管上皮細胞表達的表皮生長因子受體存在交叉干擾。Shannon 等4研究發(fā)現(xiàn)eotaxin及eotaxin2通過與CCR3的結(jié)合可以誘導部分CCR3內(nèi)陷和EOS的變形, 有助于EOS的活化和遷移。Joubert等5發(fā)現(xiàn)eotaxin 作用于氣道平滑肌細胞CCR3可誘導平滑肌細胞遷移和增殖, 使細胞內(nèi)Ca

15、2+增高。Adachi 等6發(fā)現(xiàn)支氣管上皮細胞表達CCR3可激活和誘導有絲分裂原激活蛋白（MAP）活化和細胞因子的產(chǎn)生?？梢奀CR3無論在氣道炎癥還是重塑方面都起到了重要作用。本實驗發(fā)現(xiàn)哮喘時不但肺組織EOS浸潤明顯, CCR3表達增加, 而且黏膜上皮細胞, 平滑肌細胞上CCR3也有明顯表達, 平滑肌增厚, 和既往研究一致。 以往研究表明, 在過敏性哮喘患者的骨髓中, 成熟和非成熟的EOS CCR3表達水平顯著升高7。Lamkhioued等2研究證實, CCR3可表達于骨髓CD34+造血細胞表面, 在體內(nèi)外eotaxin與CCR3結(jié)合后均表現(xiàn)出明顯的趨化活性, 促使骨髓中CD34+細胞產(chǎn)生增多

16、, 只有CCR3-骨髓干細胞轉(zhuǎn)化為CCR3的細胞后, 才可以募集到肺。并且單獨或與IL5協(xié)同作用可以使骨髓CD34+祖細胞定向分化為EOS, 并向外釋放、 募集8, 分化過程中CD34轉(zhuǎn)為CD34-成熟EOS。本實驗發(fā)現(xiàn): 一方面, 哮喘組骨髓CCR3及CD34表達明顯高于對照組, 與EOS之間互呈線性相關(guān)（肺內(nèi)除外）, 并且CCR3的表達高峰在6 h, 早于CD34+陽性細胞和EOS增加、 釋放的高峰時間12 h, 說明在某些因子的作用下, 骨髓祖細胞表達CCR3, 進一步使CD34祖細胞、 EOS分化、 釋放增多, 利于炎癥的發(fā)展。另一方面, 哮喘激發(fā)后速發(fā)相炎癥反應(yīng), 肺內(nèi)CD34陽性細

17、胞, EOS增加, 而骨髓內(nèi)CD34陽性細胞減少, 血液內(nèi)EOS減少, 隨著時間發(fā)展, 遲發(fā)相炎癥反應(yīng)出現(xiàn), 兩者逐漸增加?？紤]與早期炎癥細胞的快速募集大于骨髓產(chǎn)生的速度有關(guān)。但是肺內(nèi)CD34陽性細胞升高后有一下降過程, 后又升高, 考慮為快速募集后的原位造血, 使之消耗, 后來自骨髓的補給使其升高, 同時造成了肺內(nèi)CCR3及CD34表達與EOS無明顯的線性關(guān)系。證明在骨髓到外周血再到肺組織存在著密切的細胞信號環(huán)路聯(lián)系。 近年研究的重點傾向于骨髓、 肺組織、 循環(huán)之間的細胞信號通路關(guān)系, 以便更好地為治療哮喘開闊思路。如果能切斷這方面的環(huán)路, 如通過抑制CCR3的表達, 或者給于其拮抗劑抑制C

18、D34表面抗原的表達, 不但切斷EOS遷移, 而且切斷了CD34造血干細胞的分化、 遷移, 將對哮喘的治療有很重要的意義。【參考文獻】 1 Daudurand RJ, Wang CG, Laberge S, et al. In vitro allergic bronchoconstriction in the brown norway ratJ. Am J Respir Crit Care Med, 1994, 149(6): 1499-1505.2 Lamkhioued B, Abdelilah SG, Hamid Q, et al. The CCR3 receptor is involve

19、d ineosinophil differentiation and is upregulated by Th2 cytokines in CD34+progenitor cellsJ. J Immunol, 2003, 170(1): 537-547.3 Tesuya AD, Chang2Hao C, Akira KA, et al. Activation of epidermal growth factor receptor via CCR3 in bronchial epithelial cellsJ. Biochem Biophs Res Commu, 2004, 320: 292-296.4 Bryan SA, Jose PJ, Topping JR, et al. Responses of leukocytes to chemokines inwhole blood and their antagonism by novel CCchemokine receptor 3 antagonistsJ. Am J Respir Crit Care Med, 2002, 165(12): 1602-1609.5 Joubert P, LajoieKadoch S, Labonte I, et al. CCR3 expression and function inasth