剝奪異相睡眠導(dǎo)致大鼠海馬中神經(jīng)元性一氧化氮合酶陽性細(xì)胞表達(dá)減少與記憶維持

1、剝奪異相睡眠導(dǎo)致大鼠海馬中神經(jīng)元性一氧化氮合酶陽性細(xì)胞表達(dá)減少與記憶維持 作者：張?？担钜黄?，宋焱峰，劉向文，王德貴Changes of nNOS positive neurons in hippocampus and memory consolidation after paradoxical sleep deprivation in rats【Abstract】 AIM: To study the changes of memory processes and consolidation during paradoxical sleep in rats and to observe th

2、e alteration of neuronal nitric oxide synthase immunoreactivity (nNOSIR) neurons in hippocampus after paradoxical sleep deprivation. METHODS: Aradoxical sleep deprivation was performed using the "lower pot technique" The control groups (CC), tank control groups（TC） and paradoxical sleep de

3、privation groups（PSD） were tested in Morris Water Maze. At the end of the experiment, the animals were sacrificed under chloral hydrate anesthesia (0.4 g/kg) by intraaortic perfusion of a fixative solution. Coronal sections were cut at 25 m thickness on a freezing microtome and up to five series of

4、adjacent sections were collected for nNOS immunohistochemical processing using streptavidinbiotinperoxidase complex technique (SABC technique). RESULTS: The memory consolidation in PSD 24 h, PSD 48 h and PSD 72 h rats declined significantly compared with that in TC 24, 48, 72 h as well as CC 24, 48,

5、 72 h rats (P<0.05), indicating that PSD caused a significant impairment in reference memory. The nNOSexpressing cells in hippocampus of PSD 24, 48, 72 h rats were significantly fewer than those in TC 24, 48, 72 h as well as CC 24, 48, 72 h rats (P<0.05). CONCLUSION: 2 / 16Paradoxical

6、sleep deprivation may cause a disturbance of memory processes and consolidation and paradoxical sleep is associated with memory. The nNOSIR neurons in hippocampus formation decrease in PSD groups compared with those in CC and TC groups. nNOS in hippocampus may play a key role during paradoxical slee

7、p and spatial memory.【Keywords】 sleep; learning & memory; hippocampus;rat; nNOS【摘要】 目的: 揭示記憶是否在異相睡眠中得到加強(qiáng)和鞏固，取消異相睡眠是否導(dǎo)致記憶維持能力下降及其下降的機(jī)制. 神經(jīng)元性一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase, nNOS）是否參與記憶中樞海馬結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)，剝奪異相睡眠（paradoxical sleep deprivation，PSD)是否改變它們?cè)诤ｑR的表達(dá). 方法: 采用小平臺(tái)法建立PSD大鼠動(dòng)物模型. 應(yīng)用Morris水迷宮測(cè)試系統(tǒng)檢

8、測(cè)大鼠空間參考記憶獲得及維持的變化; 海馬的nNOS免疫組化研究：PSD 24，48和72 h后，立即取腦、固定、行冰凍切片（片厚25 m）、SABC法免疫組化染色、光鏡下進(jìn)行觀察分析、攝像. 結(jié)果：PSD可造成大鼠空間參考記憶維持能力的損傷； PSD組大鼠海馬中nNOS免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞在CA1，CA2，CA3，CA4及錐體細(xì)胞層、顆粒層、齒狀回稀疏，數(shù)目較相應(yīng)的大平臺(tái)組（tank control groups, TC group）、正常飼養(yǎng)組（control groups, CC group）明顯減少(P<0.05). 而TC組與CC組相比較無明顯變化. 結(jié)論： PSD可以造成

9、大鼠空間記憶的鞏固障礙，異相睡眠與空間記憶維持有關(guān)； PSD可以造成海馬nNOS陽性細(xì)胞的表達(dá)減少，海馬中的nNOS可能參與了大鼠空間記憶鞏固的過程.【關(guān)鍵詞】 睡眠；記憶；海馬；大鼠； 神經(jīng)元性一氧化氮合酶0引言近年來人們對(duì)睡眠和學(xué)習(xí)記憶之間的關(guān)系進(jìn)行了廣泛的研究，尤其是異相睡眠與學(xué)習(xí)記憶的關(guān)系是近年來神經(jīng)科學(xué)研究的熱點(diǎn)問題. 以往大量研究集中在異相睡眠與記憶獲得的機(jī)制上，而異相睡眠與記憶維持的關(guān)系所見報(bào)道不多. 我們通過Morris水迷宮建立空間記憶獲得模型，用小平臺(tái)技術(shù)（flower pot technique）建立異相睡眠剝奪（paradoxical sleep deprivation

10、，PSD)模型1. 應(yīng)用空間記憶獲得后PSD的方法，觀察PSD后大鼠的記憶維持能力的改變，及其神經(jīng)元性一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase, nNOS)在學(xué)習(xí)記憶中樞海馬表達(dá)的變化. 旨在探討異相睡眠與記憶維持的關(guān)系及其可能機(jī)制.1材料和方法1.1材料健康雄性Wistar大鼠45只，體質(zhì)量（308±20）g ，由甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供. 連續(xù)學(xué)習(xí)訓(xùn)練4 d結(jié)束后，立即用隨機(jī)數(shù)字表法將所有大鼠隨機(jī)分為3組(24 h組, 48 h組和72 h組),每組15只. 每組再分為：PSD組，大平臺(tái)（tank control groups, TC）組；正常飼養(yǎng)組

11、（control groups, CC group）. 每小組5只. nNOS多克隆抗體（Ab1參考效價(jià)1200），SABC試劑盒，DAB顯色試劑盒，PBS緩沖液等均購自武漢博士德公司.1.2方法1.2.1Morris水迷宮空間記憶動(dòng)物模型的建立水迷宮的組成：一直徑為150 cm的圓形水池，直徑10 cm、高15 cm的平臺(tái)，以及水迷宮測(cè)試系統(tǒng). 為了增強(qiáng)迷宮與大鼠的色彩對(duì)比，水池內(nèi)壁及平臺(tái)均漆成黑色. 實(shí)驗(yàn)時(shí)，平臺(tái)隱藏在水下（低于水面2 cm），水溫保持在（20±2）. 水迷宮測(cè)試系統(tǒng)購自北京Genheart公司，由數(shù)碼攝錄機(jī)、A/D轉(zhuǎn)換卡及與其相連的計(jì)算機(jī)、相關(guān)軟件等組成; PS

12、D箱的制作：大小30 cm×30 cm×30 cm ，中央放置一直徑為6.5 cm，高8 cm的平臺(tái). 剝奪箱內(nèi)注有水，水面低于平臺(tái)2 cm，水溫保持在（20±2）左右. 大鼠可以在平臺(tái)上自由攝取食物和水，但當(dāng)進(jìn)入異相睡眠時(shí)，由于骨骼肌的松弛使大鼠掉入水中而驚醒，造成PSD. TC組與PSD組的環(huán)境相同，只是平臺(tái)直徑為20 cm. CC組飼養(yǎng)在干燥鼠籠內(nèi)； 水迷宮空間學(xué)習(xí)記憶的訓(xùn)練：訓(xùn)練開始前，大鼠單個(gè)飼養(yǎng)以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境1 wk. 每日逐一給予適當(dāng)抓摸以消除其恐懼感. 訓(xùn)練在每日8:0013:00間進(jìn)行. 預(yù)先將迷宮任意分為4個(gè)象限. 平臺(tái)放入上述4個(gè)象限中隨機(jī)

13、選擇的1個(gè)象限中（在訓(xùn)練的4 d中位置一直保持不變），測(cè)量水溫和水面距平臺(tái)的高度達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求后，于池邊任意取一入水點(diǎn)，大鼠面向池壁入水，計(jì)算機(jī)自動(dòng)跟蹤計(jì)時(shí). 允許在120 s內(nèi)找到平臺(tái)，找到后在平臺(tái)上保持15 s. 若在120 s內(nèi)找不到，則將大鼠引導(dǎo)到平臺(tái)上并保持15 s. 每只大鼠在同一入水點(diǎn)連續(xù)訓(xùn)練2次，以第1次訓(xùn)練（trial 1）成績衡量空間記憶的獲得水平，第2次（trial 2）成績衡量空間工作記憶水平. 全部動(dòng)物按照上述方法完成第1個(gè)入水點(diǎn)的訓(xùn)練后繼續(xù)進(jìn)行第2、第3及第4個(gè)入水點(diǎn)的訓(xùn)練. 每次訓(xùn)練結(jié)束后擦干大鼠身體，放入各自的鼠籠內(nèi)并適當(dāng)給予保暖. 連續(xù)4 d訓(xùn)練期間，迷宮周圍的

14、參照物（包括燈光、周圍的器物等）必須保持不變. 其中所有的PSD組、CC組及TC組在4 d訓(xùn)練結(jié)束后立即分別放入睡眠剝奪箱、大平臺(tái)水箱和普通鼠籠,室溫控制在（22±2），避免噪音，保持24 h光暗周期，每日7:0019:00開燈照明. 24，48和72 h后，分別將24, 48和72 h組大鼠再次任意選取兩個(gè)入水點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)連續(xù)兩次尋找平臺(tái)，其結(jié)果用來衡量記憶的變化. 此時(shí)水下平臺(tái)所處的位置與訓(xùn)練時(shí)相同.1.2.2主要觀察指標(biāo)大鼠在迷宮中的游泳軌跡（track）；潛伏期（latency, L）,大鼠從入水到找到平臺(tái)的時(shí)間；距離(distance, D)，大鼠從入水到找到平臺(tái)的游泳距離；

15、速度(velocity, V)；平臺(tái)所在象限軌跡（時(shí)間）的分布(percentage of track or time in correct quarter, PQ)；記憶得分(memory score, MS).1.2.3nNOS免疫組化取腦連續(xù)冠狀冰凍切片（LEICA RM2135），片厚25 m,切片入0.1 mol/L PBS液中，隔5取1撈片，4冰箱保存?zhèn)溆? 共4套分別采用SABC（streptavidinBiotinperoxidaseComplex）法進(jìn)行nNOS的免疫組化染色. nNOS陽性細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色. 每片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，記數(shù)陽性細(xì)胞數(shù).統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有數(shù)據(jù)以x

16、±s表示，連續(xù)4 d各點(diǎn)第1, 2次探索距離、記憶得分采用重復(fù)測(cè)量方差分析，其余數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，均數(shù)兩兩比較行LSDt檢驗(yàn)，方差不齊各組間的比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)，P<0.05為有顯著性差異.2結(jié)果2.1大鼠Morris水迷宮空間學(xué)習(xí)記憶能力的測(cè)試隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加，大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力逐漸增強(qiáng),連續(xù)4 d各點(diǎn)第1，2次探索距離、記憶得分有差異（Tab 1）；PSD 24，48和72 h后各入水點(diǎn)搜索平臺(tái)的結(jié)果也有差異（Tab 2）.表1連續(xù)4 d各點(diǎn)第1，2次探索距離、記憶得分的結(jié)果（略）表2剝奪異相睡眠24，48和72 h后探索距離、記憶得分的結(jié)果（略）2.2海

17、馬的nNOS免疫組化nNOS陽性細(xì)胞均為神經(jīng)元，胞質(zhì)和突起濃染，大部分集中于錐體細(xì)胞層和顆粒細(xì)胞層內(nèi)或邊緣，胞體多為錐形或梭形 . PSD組大鼠海馬各亞區(qū)及齒狀回陽性細(xì)胞分布稀疏，數(shù)目較TC和CC組明顯減少(P<0.05). 而TC組與CC組相比較無明顯變化(Tab 3, Fig 1).表3PSD組大鼠海馬各亞區(qū)及齒狀回陽性細(xì)胞分布（略）3討論Morris水迷宮是英國心理學(xué)家Morris于20世紀(jì)80年代初設(shè)計(jì)并應(yīng)用于學(xué)習(xí)記憶腦機(jī)制的研究2. 此后，該迷宮系統(tǒng)被廣泛運(yùn)用在神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究中，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物主要是大鼠2.我們參考Youngblood等3的設(shè)計(jì)方法，用每個(gè)入水

18、點(diǎn)的第一次訓(xùn)練成績來衡量空間參考記憶的獲得和保持水平，用第二次訓(xùn)練成績來衡量空間工作記A: TC; B: PSD 24 h; C: PSD 48 h; D: PSD 72 h.憶的水平. 大鼠的每個(gè)入水點(diǎn)第一次探索時(shí)，由于時(shí)間和空間的改變，不能與上一次探索之間形成順序性關(guān)系，大鼠只能依照環(huán)境的參照來確定水下平臺(tái)的位置. 其記憶屬性為參考記憶. 大鼠的每個(gè)入水點(diǎn)第二次探索時(shí)，與第一次探索在空間和時(shí)間上都存在連續(xù)性，大鼠可以根據(jù)剛剛獲得的信息找到水下平臺(tái)，其記憶屬性為工作記憶.實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，全部大鼠通過訓(xùn)練后建立了不同程度的空間記憶. 從PSD組大鼠在同一時(shí)段其第一次探索游泳潛伏期、距離均大于其相

19、應(yīng)的TC組和CC組，記憶得分（MS）小于TC，CC組大鼠，其差異有顯著性（P<0.05）. 由于Morris水迷宮各個(gè)不同入水點(diǎn)的第一次成績反映空間參考記憶的獲得和維持水平，說明PSD可造成大鼠空間參考記憶獲得和維持能力的損傷. TC，CC組大鼠之間其參數(shù)統(tǒng)計(jì)沒有明顯差異，說明水環(huán)境對(duì)學(xué)習(xí)記憶的影響不大. 但Youngblood等3認(rèn)為，水環(huán)境的應(yīng)激可以造成大鼠出現(xiàn)窘迫狀態(tài)，從而導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力下降. 宋國平等4認(rèn)為，水環(huán)境應(yīng)激可以促使腎上腺素、乙酰膽鹼、血管緊張素的釋放，提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性，提高學(xué)習(xí)記憶的能力. 在實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)PSD組大鼠從PSD開始后出現(xiàn)自主活動(dòng)明顯

20、增多，對(duì)外界刺激敏感，易激惹. TC組與PSD組同處于水環(huán)境中，雖然也出現(xiàn)自主活動(dòng)增多，但程度輕. 上述結(jié)果表明，PSD和TC組大鼠都對(duì)水環(huán)境有應(yīng)激反應(yīng)，但程度不同. 而實(shí)驗(yàn)中除了平臺(tái)大小不同外，兩組的其他條件相同. 有大量研究表明，海馬與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān). 海馬直接參與信息的儲(chǔ)存后回憶，與長期記憶的形成有關(guān)， 因此，PSD組學(xué)習(xí)記憶能力的下降主要是PSD所至.nNOS調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的NO的釋放，長時(shí)程增強(qiáng)（long term potentiation, LTP)的表達(dá)與NO的產(chǎn)生呈現(xiàn)正相關(guān)4. Vincent等5在研究中發(fā)現(xiàn)，NO可以調(diào)節(jié)Ach的釋放，NO釋放增多，Ach分泌也增多. 應(yīng)

21、用NOS抑制劑灌注腦組織可以使Ach基礎(chǔ)釋放量減少40%，而Ach與學(xué)習(xí)記憶及睡眠的周期密切相關(guān). 另外，NO還參與突觸重塑的調(diào)節(jié)，NO的減少可使突觸重塑能力下降. LTP是神經(jīng)可塑性和突觸傳遞的一種表現(xiàn)形式，被認(rèn)為是學(xué)習(xí)記憶的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ). 而突觸重塑是LTP的基礎(chǔ)4,6. 實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，PSD后PSD組與TC，CC組相比較，PSD組大鼠海馬中nNOS陽性神經(jīng)元表達(dá)稀少，數(shù)量明顯低于TC和CC組. 因而可以推測(cè)：PSD可以造成海馬nNOS的表達(dá)減少，從而導(dǎo)致NO的產(chǎn)生減少，這可能是導(dǎo)致PSD造成大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力下降的原因之一.【參考文獻(xiàn)】1 Mendelson WB, Guthrie RD， Frederick G, et al. The flower pot technique of rapid eye movement (REM) sleep deprivation J. Pharmacol Biochem Behav, 1974; 2（2）:553-556.2 Morris RGM, Garrud P, Ra