常用免疫學檢驗技術的基本原理

1、精品文檔常用免疫學檢驗技術的基本原理免疫學檢測即是根據(jù)抗原、抗體反應的原理，利用已知的抗原檢測未知的抗體或利用已知的抗體檢測未知的抗原。由于外源性和內源性抗原均可通過不同的抗原遞呈途徑誘導生物機體的免疫應答，在生物體內產(chǎn)生特異性和非特異性 T 細胞的克隆擴增，并分泌特異性的免疫球蛋白（抗體）。由于抗體抗原的結合具有特異性和專一性的特點，這種檢測可以定性、定位和定量地檢測某一特異的蛋白（抗原或抗體）。免疫學檢測技術的用途非常廣泛，它們可用于各種疾病的診斷、療效評價及發(fā)病機制的研究。最初的免疫檢測方法是將抗原或抗體的一方或雙方在某種介質中進行擴散，通過觀察抗原抗體相遇時產(chǎn)生的沉淀反應，檢測抗原或抗

2、體，最終達到診斷的目的。這種擴散可以是蛋白的自然擴散，例如環(huán)狀沉淀試驗、單向免疫擴散試驗、雙向免疫擴散實驗。單向免疫擴散試驗就是在凝膠中混入抗體，制成含有抗體的凝膠板，而將抗原加入凝膠板預先打好的小孔內，讓抗原從小孔向四周的凝膠自然擴散，當一定濃度的抗原和凝膠中的抗體相遇時便能形成免疫復合物，出現(xiàn)以小孔為中心的圓形沉淀圈，沉淀圈的直徑與加入的抗原濃度成正比。利用蛋白在不同酸堿度下帶不同電荷的特性，可以利用人為的電場將抗原、抗體擴散，例如免疫電泳試驗和雙向免疫電泳。免疫電泳首先將抗原加入凝膠中電泳，將抗原各成分依次分散開。然后沿電泳方向平行挖一直線形槽，于槽內加入含有針對各種抗原的混合抗體，讓各

3、抗原成分與相應抗體進行自然擴散，形成沉淀線。然后利用標準的抗原抗體沉淀線進行抗原蛋白（或抗體）的鑒別。上述的方法都是利用肉眼觀察抗原抗體反應產(chǎn)生的沉淀，因此靈敏度有很大的局限。比濁法引入沉淀檢測產(chǎn)生的免疫比濁法就是利用濁度計測量液體中抗原抗體反應產(chǎn)生的濁度，根據(jù)標準曲線來計算抗原（或抗體）的含量。該方法不但大大提高了檢測的靈敏度，且可對抗原、抗體進行定量的檢測。免疫印跡法則首先通過電泳分離標準的已知抗原，然后將電泳分離的蛋白質轉移到硝酸纖維膜上，浸于待測血清中。如果血清中含有與一種或幾種抗原相對應的抗體的話，則在該抗原印跡部位形成免疫復合物沉淀。在洗去未結合的抗原和抗體后，在膜上加標記的抗人免

4、疫球蛋白的抗體，此抗體可以和病毒抗原與人抗體形成的免疫復合物發(fā)生反應，最后加入顯色底物（可以是普通顯色劑，化學發(fā)光劑或放射性同位素等）進行顯色。由于利用了第二種抗體進行了信號放大，并且可以利用高靈敏的顯色方式，靈敏度也得到了很大的提高。目前該方法已經(jīng)利用凝集反應檢測抗原抗體反應也是較傳統(tǒng)的手段之一。利用帶有抗原的乳膠顆粒等不溶性的顆粒抗原與相應抗體結合形成凝集團塊，通過凝集現(xiàn)象，就可以達到檢測的目的。無論是直接凝集法還是間接凝集法都可對抗原或抗體進行檢測。還可以利用二抗對信號進行放大，從而提高檢測的靈敏度。1 歡迎下載精品文檔利用補體介導的反應（例如溶血反應），檢測抗原抗體反應也是過去常用的方

5、法?？贵w與細胞表面抗原相遇，形成紅細胞 - 抗體復合物即可使加入反應中的補體活化，導致細胞的溶解，此方法可用于紅細胞的各種抗原或相應抗體的檢測，此外利用補體反應的競爭效應，也可對抗原抗體反應進行定量的檢測利用帶有標記（熒光素、同位素、膠體金或酶）的抗體（抗原）檢測抗原抗體反應是目前應用最廣泛、最靈敏的方法，使用放射性同位素標記法可使檢測的靈敏度達到 pg 級。由于帶標記的抗體能準確而可靠地反映出抗原的位置和數(shù)量，且利用二抗可對信號進行放大，因此該方法可用于抗原定性、定量或定位檢測。以下是幾種常用的免疫學技術：1免疫熒光技術免疫熒光技術是利用熒光素標記的抗體（或抗原）檢測組織、細胞或血清中的相應

6、抗原（或抗體）的方法。由于熒光抗體具有安全、靈敏的特點，因此已廣泛應用在免疫熒光檢測和流式細胞計數(shù)領域。根據(jù)熒光素標記的方式不同，可分為直標熒光抗體和間標熒光抗體。間標熒光抗體中一抗并不直接連接熒光素，而是先將一抗結合到蛋白，然后帶有熒光素的二抗再結合至一抗。通過二抗的結合，能將信號進行放大，因此能在一定程度上提高檢測的靈敏度，但是隨之帶來的高背景也降低了檢測的特異性。近年來，隨著熒光素和熒光檢測技術的不斷進步，熒光檢測的靈敏度已經(jīng)接近同位素檢測的水平，直接標記的熒光抗體逐漸取代間接標記抗體。這些標記了熒光素的抗體直接結合至抗原，大大提高了檢測的特異性，使檢測的結果更加準確可靠。熒光檢測技術的

7、發(fā)展，使得免疫熒光技術在傳染病診斷上有廣泛的用途，如在細菌、病毒、螺旋體感染的疾病，檢查 IgM 抗體，做為近期接觸抗原的標志。利用單克隆熒光直接標記抗體鑒定淋巴細胞的亞類。通過流式細胞儀，針對細胞表面不同抗原，可以同時使用多種不同的熒光抗體，對同一細胞進行多標記染色。2放射免疫檢測放射免疫檢測技術是目前靈敏度最高的檢測技術，利用放射性同素標記抗原（或抗體），與相應抗體（或抗原）結合后，通過測定抗原抗體結合物的放射性檢測結果。放射性同位素具有 pg 級的靈敏度，且利用反復曝光的方法可對痕量物質進行定量檢測。但放射性同位素對人體的損傷也限制了該方法的使用。733酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）酶聯(lián)

8、免疫檢測是目前應用最廣泛的免疫檢測方法。該方法是將二抗標記上酶，抗原抗體反應的特異性與酶催化底物的作用結合起來，根據(jù)酶作用底物后的顯色顏色變化來判斷試驗結果，其敏感度可達 ng 水平。常見用于標記的酶有辣根過氧化物酶 (HRP)、堿性磷酸酶（ AP）等。由于酶聯(lián)免疫法無需特殊的儀器，檢測簡單，因此被廣泛應用于疾病檢測。常用的方法有間接法、夾心法以及BAS ELISA。間接法是先將待測的蛋白抱被在孔板內，然后依次加入一抗、標記了酶的二抗和底物顯色，通過儀器（例如酶標儀）定量檢測抗原。這種方法操作簡單但由于高背景而特異性較差。目前已逐漸被夾心法取代。夾心法利用二種一抗對目標抗原進行捕獲和固定，在確保靈敏度的同時大大提高了反應的特異性。近年來，抗原的定量檢測技術也不斷推陳出新。近年來，在夾心法 ELISA 的基礎上，開發(fā)了多抗原檢測試劑盒，能同時檢測微量液相樣本中多個抗原含量。這項技術的應用大大縮短了診斷的時間，提高診斷的可靠性和及時性。2 歡迎下載精品文檔4免疫金膠體技術膠體金技術經(jīng)過30 多年的發(fā)展到現(xiàn)在已日趨成熟，該