絕經(jīng)后退行性脊柱滑脫椎體軟骨終板內(nèi)雌激素受體表達與青年女性的差異

1、絕經(jīng)后退行性脊柱滑脫椎體軟骨終板內(nèi)雌激素受體表達與青年女性的差異【摘要】 目的：探討雌激素受體（ER）在絕經(jīng)后退行性脊柱滑脫（DS）軟骨終板內(nèi)的表達及其意義。方法：用RTPCR方法檢測絕經(jīng)后DS與絕經(jīng)前年輕女性正常腰椎(N)的軟骨終板內(nèi)ER mRNA的表達；Western blot方法檢測絕經(jīng)后DS與N的軟骨終板內(nèi)ER蛋白質(zhì)的表達；用免疫組織化學(xué)法（Envision法）檢測絕經(jīng)后DS與N的軟骨終板內(nèi)ER的分布和表達，測定絕經(jīng)后DS患者血液中雌激素濃度；分析雌激素、ER和DS之間的關(guān)系。結(jié)果：ER mRNA的表達量在絕經(jīng)后DS的軟骨終板中較N明顯下降（P<0.05）；絕經(jīng)后DS的軟

2、骨終板中ER蛋白質(zhì)的表達量較N明顯下降（P<0.05）；免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示ER在絕經(jīng)后DS的軟骨終板中僅少量表達，在N的軟骨終板中表達量較強；絕經(jīng)后DS患者血液中雌激素濃度明顯下降。結(jié)論：女性在絕經(jīng)后體內(nèi)雌激素下降，軟骨終板中ER表達量較N顯著下調(diào)，可能是引起絕經(jīng)后女性DS高發(fā)的原因之一。 【關(guān)鍵詞】 雌激素受體 退行性脊柱滑脫 軟骨終板 脊柱不穩(wěn)是指在脊柱結(jié)構(gòu)喪失維持其自身生理平衡位置的能力，導(dǎo)致脊柱節(jié)段間位移超出其生理限度對于承載的異常反應(yīng)。最常見的為退行性腰椎不穩(wěn)，長期的不穩(wěn)逐漸發(fā)展為退行性脊柱滑脫（degenerative spondylolishesis DS）。DS

3、是一種獨特形式的椎體滑脫，為神經(jīng)孔完整的進展性椎體滑移1。然而，DS的病因還不清楚。在過去幾十年中，大多數(shù)研究僅強調(diào)了關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)形態(tài)的異常22 / 223，但Love等4指出小關(guān)節(jié)角度的增加是小關(guān)節(jié)炎重建的結(jié)果，而不是DS的起始病因。 DS多見于女性，在40歲以前一般不發(fā)病，絕經(jīng)后發(fā)病率顯著升高。這表明雌激素在DS發(fā)病中可能有潛在作用。Richmond等5發(fā)現(xiàn)成人軟骨細胞中有雌激素受體（ER）、ER的mRNA表達和ER蛋白的存在，說明軟骨是雌激素敏感性組織。女性絕經(jīng)后體內(nèi)雌激素水平下降，下調(diào)ER的表達，可能是絕經(jīng)后婦女高發(fā)DS的原因之一。 本研究對成年女性軟骨終板上ER進行檢測,比較絕經(jīng)前后軟

4、骨終板上ER的表達情況，旨在闡明雌激素及其受體在DS中的可能作用。 1 材料與方法 1.1 標本來源 取2006年4月 2006年8月期間東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院骨科因DS行椎間植骨融合椎弓根釘內(nèi)固定術(shù)的絕經(jīng)后患者共18例，術(shù)中用刮勺刮取軟骨終板（不包括骨性終板和軟骨下骨）作為實驗組，同期本校解剖教研室取新鮮女性尸體軟骨終板18例作為對照組。所有標本保存于-80 待提取RNA及蛋白質(zhì)。記錄患者和尸體的體重、年齡和體重指數(shù)。以人群絕經(jīng)前婦女血液中平均雌激素濃度作為對照組，測患者術(shù)前清晨空腹血液中雌激素濃度作為實驗組。 1.2 主要試劑 兔抗人ER抗體（Abcam公司，英國），羊抗兔第二抗體（南京大治

5、生物有限公司），顯色試劑DAB（北京中杉生物有限公司）。TRNzol總RNA提取試劑盒（Takara公司），通用兩步法RTPCR試劑盒（北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司）。 1.3 實驗方法 1.3.1 RTPCR （1）細胞總RNA的提?。河梦⒘刻炱椒Q取100 mg組織，液氮冷凍，在研缽中不斷加入液氮的情況下研磨成粉末狀，轉(zhuǎn)入2 ml玻璃勻漿管在冰浴下制成組織勻漿，加入2 ml TRNzol試劑。按試劑說明書提取細胞內(nèi)的總RNA，紫外分光光度儀（UV755B型，上海精密科學(xué)儀器有限公司）測定其濃度和純度，重復(fù)3次，計算樣本總RNA濃度，A260/A280值在1.8 2.0之間。（2）RN

6、A完整性的鑒定：溴化乙錠凝膠電泳，顯示28 S、18 S及5 S 3條帶，且28 S/18 S為2/1。（3）引物的設(shè)計與合成：在GenBank查到人類ER和actin（內(nèi)參）的編碼序列及合成引物序列。ER擴增產(chǎn)物的長度為888 bp，上游引物為5AAGAGCTGC CAGGCCTGC3，下游引物為5CATCTCCAGCAGCA GGTCA3；actin擴增產(chǎn)物長度為621 bp，上游引物為5ACACTGTGCCCATCTACGAGG3，下游引物為5AGGGGCCGGACTCGTCATACT3。（4）RTPCR及凝膠成像分析：按照兩步法RTPCR試劑盒說明書分別進行反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增，PCR的

7、反應(yīng)條件為變性94 1 min,退火55 1 min,延伸70 1 min,共35個循環(huán),最后1個循環(huán)72 延伸7 min。取5 l的PCR產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳分離，應(yīng)用image MASTER凝膠成像儀照相，而后用Labimage灰度分析軟件分析ER和actin條帶的強度，強度以灰度乘以面積表示。計算ER/actin的值（D值），正常軟骨終板的D值/DS軟骨終板的D值2.0（ND/DD2.0）即為陽性。 1.3.2 Western blot （1）用微量天平稱取50 100 mg組織，加入1 ml裂解液低溫快速勻漿，采用紫外分光光度法測定蛋白濃度。取蛋白100 g經(jīng)10%的SDS

8、PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%的脫脂奶粉PBST溶液室溫下封閉1 h，PBST洗膜后加入5%的脫脂奶粉PBST溶液配制的兔抗人ER抗體（1500）4 過夜，洗膜后與用HRP標記的二抗進行雜交，洗膜后加入DAB進行顯色。（2）結(jié)果于image MASTER凝膠成像儀下掃描，掃描結(jié)果用Labimage灰度分析軟件進行強度分析，強度以灰度與面積的乘積表示。 1.3.3 免疫組織化學(xué)法 （1）終板組織經(jīng)硝酸脫鈣、蠟塊包埋，蠟塊切片（4 m）常規(guī)脫蠟水化，檸檬酸組織抗原修復(fù)液對切片進行高壓抗原修復(fù)，加50 l兔抗人ER抗體（1100），室溫下孵育1 h，加50 l二抗，室溫下孵育10 15

9、 min，加100 l新鮮配制的DAB顯色4 min，自來水沖洗終止顯色，蘇木素復(fù)染，切片用酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封片，對切片拍照。（2）染色陽性表達為棕黃色,無著色為陰性。以不加一抗為對照。 1.3.4 雌激素濃度的測定 采取靜脈血2 ml，EDTA抗凝，離心取血清，采用酶聯(lián)免疫吸附的方法測定。 1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)以x-±s表示，采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進行分析，組間比較采用t檢驗和方差分析，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。 2 結(jié) 果 2.1 所取標本的人群特征 實驗組DS患者的平均年齡為55.5歲（43 68歲），對照組的平均年齡為22.5

10、歲（18 27歲）；實驗組和對照組人群的體重為（61.1±0.822） kg和（59.7±1.095） kg，P=0.052，兩組之間無顯著差異；實驗組和對照組人群的BMI（體重指數(shù)）為（23.4±0.482） kg·m-2 和（22.9±0.260） kg·m-2，P=0.09，兩組之間無顯著差異。 2.2 ER mRNA在腰椎軟骨終板中的表達 通過RTPCR檢測發(fā)現(xiàn)ER mRNA的表達量在DS軟骨終板中明顯低于正常腰椎（圖1A），經(jīng)灰度分析發(fā)現(xiàn)條帶強度在DS軟骨終板中為0.413±0.032，在正常腰椎軟骨終板中為0.8

11、42±0.018，且ND/DD的均值為2.04（圖1B），兩組之間的差異有顯著性（P<0.05）。 2.3 ER蛋白質(zhì)在腰椎軟骨終板中的表達 通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)ER蛋白質(zhì)的表達量在DS軟骨終板中顯著低于正常腰椎，經(jīng)灰度分析發(fā)現(xiàn)條帶強度在DS軟骨終板中為0.402±0.006，在正常腰椎軟骨終板中為0.475±0.020，兩組之間的差異有顯著性（P<0.05），并且此結(jié)果與RTPCR結(jié)果基本一致。見圖2。 2.4 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 免疫組織化學(xué)檢測可見ER為胞內(nèi)受體；正常女性腰椎軟骨終板中膠原纖維排列緊密，DS軟骨終

12、板中膠原纖維排列紊亂，細胞數(shù)減少；女性DS軟骨終板中ER和正常腰椎軟骨終板相比明顯減少。見圖 3。 2.5 血液中雌激素濃度檢測結(jié)果 人群絕經(jīng)前女性血液中雌激素的濃度6卵泡期為37 330 pmol·L-1，排卵期為367 1 835 pmol·L-1，黃體期為184 881 pmol·L-1；實驗組女性患者血液平均雌激素濃度為56 pmol·L-1，同絕經(jīng)前相比明顯降低。 3 討 論 腰椎的穩(wěn)定是其運動節(jié)段的內(nèi)源性穩(wěn)定因素與外力負荷相互作用時的平衡狀態(tài),即一種“穩(wěn)態(tài)”，而不穩(wěn)則是這種“穩(wěn)態(tài)”被破壞后出現(xiàn)的失穩(wěn)狀態(tài)，當(dāng)這種失穩(wěn)狀態(tài)引發(fā)出各種臨床癥狀時即出

13、現(xiàn)了不穩(wěn)癥。腰椎的運動節(jié)段包括1個椎體間關(guān)節(jié)和2個關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)，正常情況下這3個關(guān)節(jié)維持著機械性平衡,但如果其中1個出現(xiàn)異常,則最終將破壞這種平衡而使運動節(jié)段失去穩(wěn)定性。過去認為關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)的退變、損傷、角度的增加是引起腰椎失穩(wěn)的主要原因，但Love等4指出小關(guān)節(jié)角度的增加是小關(guān)節(jié)炎重建的結(jié)果，而不是DS的起始?。徊⑶以缭?989年國內(nèi)學(xué)者就已指出，腰椎間盤的退變可引起椎間盤高度下降,關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)囊松弛而重疊加大,黃韌帶回縮變厚,從而導(dǎo)致腰椎內(nèi)在力學(xué)因素的改變,出現(xiàn)腰椎負重力線的重新分布,使相鄰節(jié)段的椎體不穩(wěn)7。 Imada等8通過病例對照研究發(fā)現(xiàn)卵巢切除后病人DS的發(fā)病率是非切除病人的3倍，他們認

14、為這是由于卵巢切除造成體內(nèi)雌激素水平急劇下降而使椎旁韌帶系統(tǒng)的彈性喪失造成的，而忽略了椎間盤在這其中的作用。Yves等9通過研究雌激素替代和非替代治療的絕經(jīng)后婦女椎間盤高度發(fā)現(xiàn)，替代治療組能夠顯著維持椎間盤的高度。這些研究表明雌激素有維持椎間盤高度、防止椎間盤退變的作用。椎間盤是由軟骨終板、纖維環(huán)和髓核構(gòu)成，由于椎間盤是全身最大的無血管組織，其營養(yǎng)來源主要依賴于軟骨終板的滲透作用，因此椎間盤功能的維持依賴于軟骨終板的功能。軟骨終板是由軟骨細胞及其分泌的基質(zhì)型膠原、蛋白多糖和水組成。 Richmond等5通過RTPCR和免疫組化的方法證明了成人軟骨細胞中ER、ER的mRNA表達和ER蛋白的存在，

15、表明軟骨是雌激素敏感組織。在本研究中通過RTPCR和Western blot發(fā)現(xiàn)在軟骨終板中存在ER，表明腰椎軟骨終板也是雌激素敏感性組織，并且還發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后DS患者軟骨終板中ER較正常腰椎顯著下降。近年來的研究表明，雌激素通過一系列的機制作用于軟骨細胞，影響軟骨組織的基質(zhì)成分，從而影響其功能。萬榮等1011通過在培養(yǎng)的軟骨細胞中加入不同濃度的17雌二醇發(fā)現(xiàn)，雌二醇影響軟骨細胞膠原表型和蛋白多糖的分泌，不同濃度對軟骨細胞分泌功能的影響不同,生理濃度的雌二醇可以促進軟骨細胞分泌蛋白多糖和型膠原的分泌。另有學(xué)者通過卵巢切除術(shù)建立雌激素缺乏（絕經(jīng)）動物模型和17雌二醇替代治療的研究發(fā)現(xiàn)，卵巢切除術(shù)后

16、關(guān)節(jié)軟骨的損傷較對照組明顯加重，關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨的厚度和硬度增加，雌激素替代治療可以緩解軟骨的損傷1213。雌二醇可以緩和母羊卵巢切除術(shù)后關(guān)節(jié)軟骨中蛋白多糖含量和骨密度的下降14。不僅如此，Lee 等15發(fā)現(xiàn)通過在培養(yǎng)的軟骨細胞中加入17雌二醇，可以降低軟骨細胞MMP1的合成，維持MMPs和TIMPs之間的平衡，發(fā)揮對軟骨細胞的保護作用。采用同樣的方法，Horst等16發(fā)現(xiàn)雌激素可以保護軟骨細胞免受氧化應(yīng)激的損害作用。同時雌激素可以通過調(diào)節(jié)胰島素樣生長因子水平增加蛋白多糖和膠原的合成,減少細胞因子介導(dǎo)的軟骨基質(zhì)的降解5。上述研究表明雌激素可以促進終板軟骨細胞合成、分泌蛋白多糖和型膠原，從而維

17、持終板軟骨的基質(zhì)成分，對終板軟骨發(fā)揮保護性作用。 通過檢測血液中雌激素濃度發(fā)現(xiàn)，女性在絕經(jīng)后體內(nèi)雌激素水平顯著下降，由于ER本身處于不斷合成和分解之中，受其配體雌激素的調(diào)節(jié)，雌激素水平的下降引起軟骨細胞上ER數(shù)量和親和力下調(diào)。而劉斌等17通過對椎體終板軟骨細胞的提取和培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，軟骨終板中的軟骨細胞和關(guān)節(jié)軟骨細胞的表型和功能相似。由于體內(nèi)雌激素水平下降、軟骨細胞上ER的下調(diào)，軟骨終板基質(zhì)分泌下降、降解增加導(dǎo)致軟骨終板的退變，影響葡萄糖、氧等營養(yǎng)物質(zhì)軟骨終板的滲透和椎間盤代謝廢物的排除，導(dǎo)致髓核內(nèi)低氧、低葡萄糖、低pH值、高酸的微環(huán)境，髓核細胞功能改變，基質(zhì)分泌功能下降，導(dǎo)致椎間盤的退變。軟骨終板

18、和椎間盤的退變使其不能正常發(fā)揮其傳遞負荷、吸收震蕩的功能，腰椎的負重力線發(fā)生改變，關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)負重增加，關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)損傷、退變、角度增加，從而發(fā)生腰椎不穩(wěn)，長期的不穩(wěn)逐漸進展為DS。所以，女性在絕經(jīng)后體內(nèi)雌激素水平的下降及軟骨細胞上ER的下調(diào)可能是DS發(fā)生的原因之一。 體重和BMI是引起退行性腰椎不穩(wěn)的常見影響因素，而在本研究中所選取的實驗組和對照組在體重和BMI之間無顯著差異，排除了實驗組由于與對照組體重和BMI的不同而引起的DS。本研究發(fā)現(xiàn)，在腰椎軟骨終板中存在ER，并且絕經(jīng)后退行性腰椎不穩(wěn)患者體內(nèi)雌激素濃度較絕經(jīng)前人群明顯下降，軟骨終板中ER mRNA和蛋白的表達量較青年女性腰椎軟骨終板內(nèi)顯

19、著下調(diào)，表明雌激素及其受體可能是退行性腰椎不穩(wěn)的發(fā)生發(fā)展原因之一。這為我們進一步研究雌激素及其受體在退行性腰椎不穩(wěn)中的作用提供了一定的理論基礎(chǔ)?！緟⒖嘉墨I】 1HA K Y,CHANG C H,KIM K W,et al.Expression of estrogen receptor of the facet joints in degenerative spondylistheisJ.Spine,2005,30(5):562566.2BODEN S D,RIEW K D,YAMAGUCHI K,et al.Orientation of the lumbar facet joints:asso

20、ciation with degenerative disc diseaseJ.J Bone Joint Surg Am,1996,78:403411.3SATO K,WAKAMATSU E,YOSHIZUMI A,et al.The configuration of the laminas and facet joints in degenerative spondylolisthesis: a clinicoradiologic studyJ.Spine,1989,14:12651271.4LOVE T W,FAGAN A B,FRASER R D.Degenerative spondyl

21、olisthesis,developmental or acquired?J.J Bone Joint Surg Br,1999,81:670674.5RICHMOND R S,CARLSON C S,REGIATER T C,et al.Functional estrogen receptors in adult articular cartilage:estrogen replacement therapy increases chondrocyte synthesis of proteoglycans and insulinlike growth factor binding prote

22、inJ.Arth Rheum,2000,43(9):20812209.6樂杰.婦產(chǎn)科學(xué)M.5版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2002:489.7韓德韜.椎間盤、椎間孔和椎管間生物力學(xué)相互關(guān)系的實驗研究J.中華外科雜志,1989,27:581.8IMADA K,MATSUI H,TSUJI H.Oophorectomy predisposes to degenerative spondylolisthesisJ.J Bone Joint Surg Br,1995,77:126130.9YVES M B,MARK P B,RAYMOND G,et al.Intervertebral disc heigh

23、t in treated and untreated overweight postmenopausal womenJ.Human Repr,2005,20(12):35663570.10萬榮,楊慶銘,鄧廉夫.雌激素對軟骨細胞膠原表型表達的影響J.中國運動醫(yī)學(xué)雜志,2005,24:187191.11萬榮,楊慶銘,鄧廉夫.雌激素對軟骨細胞蛋白多糖表達的影響J.中國運動醫(yī)學(xué)雜志,2002,21:475478.12RASANEN,MESSNER K.Articular cartilage compressive stiffness following oophorectomy or treatment with 17betaestradiol in young postpubertal rabbitsJ.Acta Obstet Gyn Scan,1999,78(5):357362.13HAM K D,LOESER R F,LINDGREN B R,et al.Ef