人骨肉瘤差異表達(dá)基因的篩選

1、人骨肉瘤差異表達(dá)基因的篩選 作者：李丁蘇海川陳軍閻小君范清宇 【關(guān)鍵詞】 骨肉瘤 關(guān)鍵詞: 骨肉瘤;差異表達(dá)基因;PCR技術(shù);克隆;序列分析 摘 要:目的 研究人骨肉瘤組織與正常骨組織之間的差異表達(dá)基因，探討骨肉瘤的基因改變，為建立骨肉瘤的基因診斷方法打下基礎(chǔ). 方法 采用mRNA差異展示技術(shù)，應(yīng)用3條錨定引物和8條隨機(jī)引物從人骨肉瘤組織與正常骨組織中分離出差異表達(dá)基因，對其進(jìn)行克隆、測序，用打點雜交技術(shù)證實其是否為差異表達(dá)基因，將篩選出的差異表達(dá)基因在GenBank檢索進(jìn)行序列同源性分析. 結(jié)果 篩選及克隆出6條差異條帶，為ZOL03，ZOL51，1C82，1C74，2A21及2G12，RN

2、A打點雜交證實它們在骨肉瘤中表達(dá)，在正常骨組織中不表達(dá).6條差異片段經(jīng)序列測定，在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列相似性分析，證實ZOL03，ZOL51同源性極低;1C82，1C74，2A21，2G12同源性較低，此6條片段為新基因序列，ORF finder分析未發(fā)現(xiàn)具有開放讀框，均屬于非編碼區(qū)序列.其中ZOL03和ZOL51兩個序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中登錄，接受號為BI894276和BI936370. 結(jié)論 分離并克隆了人骨肉瘤組織與正常骨組織之間的6條差異表達(dá)基因，同源性差，均確認(rèn)為新基因，可能是骨肉瘤差異表達(dá)相關(guān)基因. Keywords:osteosarcoma;differentia

3、l expressed gene;PCR;cloning;sequence analysis 2 / 15 Abstract:AIM To explore differentially expressed genes between human osteosarcoma tissue and normal bone tissue and to discuss the alteration of genes in osteosarcoma.METHODS By way of mRNA differential display PCR，us-ing3anchor primers and8stoch

4、astic primers，differentially expressed genes between human osteosarcoma tissue and nor-mal bone tissue were isolated，cloned and sequenced.Then the genes were approved with technique of dotblot，searched and analyzed against GenBank.RESULTS Six genes were screened and cloned.RNA dotblot approved that

5、they were expressed in osteosarcoma tissue and non-expressed or lowly expressed in normal bone tissue.Sequencing and searching in GenBank for comparability found that the6sequences were partially similar to sequences in GenBank.6sequences were new genes and2of them were accepted by GenBank，the ac-ce

6、pted numbers were BI894276and BI936370.CONCLUSION 6new differentially expressed genes between human osteosarcoma and normal bone tissues were isolated and cloned with low comparability.They are probably correlative differential expressed genes of human osteosarcoma. 0 引言 骨肉瘤是骨科最常見的高度惡性腫瘤.只有找到骨肉瘤特異性基

7、因（差異表達(dá)基因）才有可能建立高度敏感且準(zhǔn)確的基因診斷方法.因此，能否找到與骨肉瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的差異表達(dá)基因已成為制約研究骨肉瘤治療及早期診斷的關(guān)鍵因素.我們采用差異展示PCR（DD-PCR）技術(shù)研究人骨肉瘤組織與正常骨組織之間的差異表達(dá)基因，探討骨肉瘤的基因改變，為建立骨肉瘤的基因診斷方法打下基礎(chǔ). 1 材料和方法 1.1 材料 唐都醫(yī)院全軍骨腫瘤研究所確診、未經(jīng)任何治療且無法保肢的骨肉瘤患者之截肢標(biāo)本，選取骨肉瘤組織及相同肢體來源的正常骨組織.差示PCR引物采用GenHunter公司Liang和Pardee1996-04提供的第三代序列，由上海生物工程公司合成，5端引物為8條，3端引物

8、為3條，其序列為:H-AP1 :5-AAGCTTGATTGCC-3;H-AP2 :5-AAGCTTCGACTGT-3;H-AP3 :5-AAGCTTT-GCTCAG-3;H-AP4 :5-AAGCTTCTCAACG-3;H-AP5 :5-AAGCTTAGTAGGC-3;H-AP6 :5-AAGCTTGCACCAT-3;H-AP7 :5-AAGCTTAA-CGAGG-3;H-AP 8 :5-AAGCTTTTACCGC-3;H-T11 G:5-AAGCTTTTTTTTTTTG-3;H-T11 A:5-AAGCTTTTTTTTTTTA-3;H-T11 C:5-AAGCTTTTTTTTTTTC-3.J

9、M109為本所保存，pGEMR -T載體購自Promega公司.無RNA的DNA酶，Sal和Sph購自TaKaLa公司;Su-perscriptTM RNase H-反轉(zhuǎn)錄酶及DNA凝膠回收試劑盒購自Gibco公司;-32 P dATP及-32 P dATP購自北京亞輝生物工程公司. 1.2 方法 取新鮮截肢標(biāo)本，無菌條件下，即取截肢體正常骨段骨組織，剔除骨膜，除凈松質(zhì)骨和骨髓，將此皮質(zhì)骨咬至0.5cm×0.5cm大小，以4生理鹽水反復(fù)沖洗后，迅速置液氮中保存.將保存的骨組織取出置室溫下35min，再放回液氮中，反復(fù)凍融58次.取此凍融骨組織約200mg浸入裝有2mL預(yù)冷變性液的離心

10、管中，冰浴下以高速離散器快速粉碎、勻漿，以備提取總RNA2 .參照奧斯伯標(biāo)準(zhǔn)酚/氯仿法抽提正常骨組織和骨肉瘤組織勻漿液中總RNA1 ，用無RNA的DNA酶處理后以DEPC處理水溶解，紫外分光光度儀測定總RNA吸光度（A260nm ，A280nm ），變性瓊脂糖凝膠電泳觀察總RNA完整性.mRNA差異顯示按GenHunter RNAim-ageTM kit1說明書（GenHunter公司）進(jìn)行.0.2g總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，在-32 P dATP存在的條件下，以5端8條隨機(jī)引物和3端3條錨定引物相組合對反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增.PCR產(chǎn)物經(jīng)60g・L-1 變性聚丙烯酰胺

11、凝膠電泳后放射自顯影.選擇并切取在骨肉瘤標(biāo)本泳道中有而在正常骨組織標(biāo)本泳道中無的差異顯示條帶的凝膠2 ，煮沸法回收其中的cDNA并對其進(jìn)行重擴(kuò)增.重擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳以凝膠回收試劑盒回收3 后克隆入pGEMR -T載體，用Sal和Sph雙酶切鑒定插入片段的大小.采用末端標(biāo)記法在PCR產(chǎn)物標(biāo)記上-32 P dATP作探針，對上述骨肉瘤組織及正常骨組織總RNA進(jìn)行打點雜交，以確認(rèn)并篩選在骨肉瘤組織中表達(dá)而在正常骨組織中未見表達(dá)的序列.在上海基康生物技術(shù)公司（ABI PRISMTM ）對純化并克隆入pGEMR -T載體的序列進(jìn)行測序;在Internet網(wǎng)上對測序結(jié)果進(jìn)行序列相似性分析，序列相似性分析工具

12、為GenBank NCBI BLAST2.0高級版本，開放讀框分析工具為NCBI ORF FINDER.確認(rèn)為新序列后，遞交給GenBank申請序列號. 2 結(jié)果 2.1 總RNA的純度和完整性 紫外分光光度儀對總RNA進(jìn)行定量:A260nm =1.1916，總RNA量為0.953g・L-1 .總RNA質(zhì)量判定:A260nm /A280nm 比值為1.9340，表明所提骨組織總RNA質(zhì)量較好.變性瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明總RNA較為完整（Fig1）. 圖1 總RNA變性凝膠電泳圖略 2.2 mRNA差異顯示結(jié)果 mRNA差異顯示結(jié)果清晰，條帶分隔良好（Fig2）. 圖2 部

13、分mRNA差異顯示結(jié)果略 2.3 差異片段克隆 從差異條帶中分離回收了6條有明顯表達(dá)差別的cDNA，命名為ZOL03，ZOL51，1C82，1C74，2A21及2G12.篩選的差異條帶重擴(kuò)增后電泳與重組克隆酶切產(chǎn)物電泳相一致（Fig3），表明所篩選的差異條帶成功可隆入pGEMR -T載體;可看到片段大小介于150bp和500bp之間. 2.4 打點雜交分析結(jié)果 所篩選的6條差異條帶均在骨肉瘤組織中表達(dá)而在正常骨組織中未見表達(dá)，說明它們確為差異表達(dá)基因片段（Fig4）. 圖3 圖4 略 2.5 序列測定及序列分析結(jié)果 序例測定結(jié)果顯示，5端隨機(jī)引物和3端錨定引物均存在，片段ZOL03長度為240

14、bp，片段ZOL51長度為180bp，片段1C82長度為294bp，片段1C74長度為242bp，片段2A21長度為226bp，片段2G12長度為455bp.開放讀框分析結(jié)果顯示此6個基因片段不具開放讀框.在GenBank中進(jìn)行序列同源性分析，表明6個片段同源性較低，認(rèn)為是新序列;其中片段ZOL03和ZOL51在GenBank中登錄，接受號為BI894276和BI936370. 3 討論 一些基因與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)4，5 ，但還知之甚少.現(xiàn)代分子生物學(xué)研究表明，人類基因表達(dá)的 變化處于控制生物學(xué)調(diào)節(jié)機(jī)制的中心位置6 .基因 表達(dá)水平的變化是最根本的變化，也是最敏感的變化.正常骨組織與骨肉瘤

15、組織間存在特征性差異表達(dá)基因，因此，研究骨肉瘤不同發(fā)展階段的基因表達(dá)變化，不僅有助于闡明骨肉瘤的發(fā)病機(jī)制，而且還能為進(jìn)一步開展骨肉瘤的基因診斷和基因治療提供重要的理論依據(jù).可見，能否找到與骨肉瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的一種或多種特異性或相對特異性差異表達(dá)基因，已成為制約研究骨肉瘤治療及早期診斷的關(guān)鍵因素.我們以基因背景、生長環(huán)境、組織來源都完全一樣的一對骨肉瘤組織和正常骨組織作為研究對象，運用差異展示PCR技術(shù)獲取了6條差異表達(dá)基因片段，它們在GenBank中同源性低或無，我們還很難闡明這6個基因片段在骨肉瘤發(fā)生或發(fā)展中的具體作用，只有獲取全基因序列并闡明其結(jié)構(gòu)與功能，才能最終了解它們的全部意義.

16、參考文獻(xiàn): 1Li D，Su HC，Zhao JR，F(xiàn)an QY，Yan XJ.Extraction of total RNA in bone tissue J.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1999;20（12）:1056. 2Zhao JR，Yan XJ，Han FC，Cui DX，Hou Y，Yan QJ，Su CZ.Overexpressed gene YA61cloned from human gastric carcinoma cell SGC-7901and its sequencing J.Prog Bioche

17、m Biophys，2001;28（1）:99-101. 3Cui DX，Yan XJ，Su CZ.Differentially expressed genes in GC7901or GES-1were isolated by optimized differential display and primary clinical significance J.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1998;19（7）:601-605. 4Li D，Cui DX，Su HC，Yan XJ，F(xiàn)an QY.Alteration of mdm2and p53in musculoskeletal tumors and its clinical significance J.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（8）:1002-1004. 5Lonardo F，Ueda T，Huvos AG.P53and MDM2alterations in osteosarcoma:correlation with clinicopathologic