模擬失重對成骨細胞整合素亞單位表達的影響

1、模擬失重對成骨細胞整合素亞單位表達的影響 作者：楊志，王冰，李瑩輝，聶婕霖，孫喜慶，張舒 【關鍵詞】 失重；成骨細胞；整合素類 【Abstract】 AIM: To investigate the expression of integrin subunits in osteoblasts during simulated weightlessness induced by clinostat. METHODS: Calvarial osteoblasts of neonate rats were cultured under conditions of normal gravity(1G)

2、and simulated weightlessness induced by clinostat respectively. The total RNA in cells was isolated in different time points (24, 48, 72 h). Reverse transcription PCR analysis was made to examine the gene expression of 5, v and 1 integrin subunits. Each value was normalized against that of actin mRN

3、A. Moreover, the protein expressions of all kinds of integrin subunits were also detected with Western blotting. RESULTS: The gene expression of 3 integrin subunits started to change from 24 h of rotation in clinostat but not in stationary cultures. The expression of integrin 5 mRNA decreased at 24,

4、 48 and 72 h of rotation by 11.3%, 18.7% and 9.8%, respectively. The same trend was saw in the expression of integrin v mRNA as 23.0%, 12.3% and 16.7%, respectively. Moreover, the expressions of integrin 2 / 151 mRNA in different periods were also declined by 15.3%, 11.4% and 26.4%, respectively. Th

5、e differences were all statistically significant as compared with controls (P<0.05). The protein expression of 3 integrin subunits also started to change from 24 h of rotation in clinostat. The expression of integrin 5 at 24, 48 and 72 h decreased by 13.1%, 20.3% and 11.9%, respectively. The

6、same trend was seen in the expression of integrin v as 7.4%, 18.2% and 25.2%, respectively. Moreover, the expressions of integrin 1 protein in different periods were also declined by 18.6%, 25.9% and 27.5%, respectively. The differences were all statistically significant as compared with controls (P

7、<0.05). CONCLUSION: The expressions of 5, v, 1 integrin subunits decrease in simulated weightlessness. 【Keywords】 weightlessness; osteoblasts; integrins 【摘要】 目的： 觀察回轉器模擬失重對成骨細胞整合素亞單位表達的影響. 方法： 培養(yǎng)的大鼠乳鼠顱骨成骨隨機分為對照組和失重組（用回轉器模擬失重條件），在實驗的24, 48和72 h提取細胞總RNA，進行反轉錄PCR，檢測整合素的5, v和1亞單位mRNA表達，并計算與內參照肌動蛋

8、白 (betaactin) mRNA水平的比值. 同時用Western blotting檢測各種整合素亞單位的蛋白表達變化. 結果： 從模擬失重24 h開始，整合素亞單位的基因表達即發(fā)生改變，但在對照組中，基因表達無明顯變化. 整合素5 mRNA在模擬失重的24, 48和72 h分別下降了11.3%, 18.7%和9.8%；整合素v mRNA分別下降了23.0%, 12.3%和16.7%；整合素1 mRNA分別下降了15.3%, 11.4%和26.4%. 與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）. 整合素亞單位蛋白和基因表達的變化相似. 整合素5在模擬失重的24, 48和7

9、2 h分別下降了13.1%, 20.3%和11.9%；整合素v的蛋白表達分別下降了7.4%, 18.2%和25.2%；整合素1蛋白表達分別下降了18.6%, 25.9%和27.5%. 與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）. 結論： 在模擬失重環(huán)境下，整合素5, v和1亞單位mRNA的表達發(fā)生了下調性變化. 【關鍵詞】失重；成骨細胞；整合素類 0引言 在失重環(huán)境下，骨骼組織發(fā)生顯著的變化：骨骼脫鈣、骨量減少及力學性能下降，嚴重影響骨骼的結構和功能，威脅航天員返回地球后的安全1. 骨骼脫負荷引起的臨床及失重環(huán)境下的骨質喪失已成為妨礙人類健康和太空探索能力的難題之一. 目前有

10、許多研究表明，失重和模擬失重導致的骨丟失是一個以骨形成抑制起主導作用的過程，特別是成骨細胞的增殖、分化功能以及細胞內細胞骨架的聚合與解聚受到了抑制，而成骨細胞的代謝紊亂，又進一步抑制了細胞的骨骼形成能力. 在航天醫(yī)學領域，有關成骨細胞在失重或模擬失重環(huán)境下整合素變化的研究鮮見報道. 本實驗利用大鼠乳鼠顱骨成骨細胞，觀察模擬失重環(huán)境對細胞整合素亞單位基因表達的影響，以探討失重致骨骼結構改變的可能細胞學機制. 1材料和方法 1.1材料達爾伯克必需基本培養(yǎng)基 (dulbeccos modified eagle medium, DMEM)由Biotech生產；RNA提取試劑盒（批號：D312T）,RT

11、PCR試劑盒（批號：#A1260）為美國Promega公司產品；整合素的5, v, 1亞單位和肌動蛋白引物由北京賽百盛基因技術有限公司合成，PAGE法純化. 1.2方法 1.2.1成骨細胞的分離SD大鼠乳鼠4只由第四軍醫(yī)大學動物中心提供，體質量不限. 利用多段酶消化法無菌摘取大鼠乳鼠顱骨并去除骨膜. 將顱骨碎片用2.5 g/L胰蛋白酶消化90 min，去除上清液后，顱骨碎片用2.5 g/L的胰蛋白酶和1 g/L I型膠原酶混合液消化30 min，重復4次. 將消化上清液1000 r/min離心5 min，將細胞加入含100 mL/L胎牛血清(FBS), 100 U/mL青霉素及0.01 mg/

12、mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，按細胞數(shù)2×105個細胞/瓶接種于25 mL培養(yǎng)瓶中. 1.2.2成骨細胞的培養(yǎng)細胞在37 50 mL/L CO2恒溫孵箱中孵育并及時進行傳代. 經37 50 mL/L CO2恒溫孵箱中培養(yǎng)46 h后，細胞換液，每瓶灌滿含100 mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)基，密封瓶口. 再隨機分為2組（每組12瓶細胞，約3×106個細胞）：模擬失重組（利用回轉器模擬失重環(huán)境2），1 G重力組（對照組），置于相同的培養(yǎng)條件下培養(yǎng). 回轉器以30 r/min水平旋轉. 在不同重力環(huán)境培養(yǎng)72 h后，進入下一步實驗. 1.2.3PCR反應參照試劑盒說明提取總RNA

13、. 在紫外分光光度儀上測定260 nm處的吸光度，RNA的濃度（g /mL）=A260 nm×40 g/mL×稀釋倍數(shù). 計算并將各組樣本RNA調節(jié)為相同濃度，進行RTPCR反應. 過程： 48, 45 min, 反轉錄；94, 2 min, AMV反轉錄酶失活； 94, 30 s, 變性；Tm=X,1 min，退火；68, 2 min，延伸；此過程共35個循環(huán)； 68, 7 min，延伸. Tm代表退火溫度. PCR反應結束后將相同量DNA產物在20 g/L瓊脂糖凝膠中電泳，通過凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，用ImageMaster TotalLab v1.11軟件(totall

14、ab凝膠成像軟件，美國)測定電泳條帶的灰度值，計算整合素亞單位cDNA產物與內對照肌動蛋白cDNA產物的灰度比值. 從而反映整合素亞單位mRNA的表達量. 1.2.4蛋白免疫印跡樣本提取了RNA后，進行蛋白的提取. 配制120 g/L聚丙烯酰胺凝膠，各取細胞蛋白420 g進行SDSPAGE（十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳），電泳結束后用2.5 g/L考馬斯亮藍R250染色，觀察蛋白含量.用BioRad Mini電泳儀在冰上將細胞蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，120 V, 2.5 h. TTBS洗膜, 6次/5 min. 用50 g/L脫脂奶粉，室溫封閉1 h. 加兔抗鼠整合素5, v, 1血清(

15、1500稀釋)室溫反應1 h后，TTBS洗膜,6次/5 min. 加HRP羊抗兔IgG(15000稀釋)室溫反應1 h; TBS洗膜,6次/5 min.最后加入化學發(fā)光試劑，置室溫5 min后，X片顯影，定影. 統(tǒng)計學處理: 相同條件的實驗重復3次（n=3），實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較利用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗檢測各組間差異，顯著性檢驗水準0.05. 2結果 2.1模擬失重對大鼠乳鼠顱骨成骨細胞整合素亞單位mRNA表達的影響從模擬失重24 h開始，整合素5, v, 1基因表達即發(fā)生改變，與對照組相比，5 mRNA在模擬失重的24, 48和72 h分別下降了11.3%,

16、 18.7%和9.8%，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）. 5 mRNA的表達隨模擬失重時間的延長呈現(xiàn)一定的波動變化趨勢. v mRNA在模擬失重的24 h, 48 h和72 h分別下降了23.0%, 12.3%和16.7%，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）. v mRNA的表達隨模擬失重時間的延長呈現(xiàn)逐步增加的變化趨勢. 1 mRNA在模擬失重的24，48和72 h分別下降了15.3%, 11.4%和26.4%，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）. 1 mRNA的表達隨模擬失重時間的延長亦呈現(xiàn)逐步增加的變化趨勢（圖1）. 2.2模擬失重對大鼠乳鼠

17、顱骨成骨細胞整合素亞單位蛋白表達的影響從模擬失重24 h開始，整合素5, v和1亞單位的蛋白即發(fā)生改變，與對照組相比，5的蛋白表達在模擬失重的24，48和72 h分別下降了13.1%, 20.3%和11.9%，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）. v的蛋白表達在模擬失重的24, 48和72 h分別下降了7.4%, 18.2%和25.2%，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）. 1的蛋白表達在模擬失重的24，48和72 h分別下降了18.6%, 25.9%和27.5%，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）. 三種蛋白表達隨模擬失重時間的延長均呈現(xiàn)逐步增加的變

18、化趨勢（圖2）. 3討論 整合素是一類重要的細胞表面受體家族，主要介導細胞與細胞外基質（ECM）的粘附，使細胞得以附著而形成整體. 整合素可將細胞外基質分子（如纖粘連蛋白、膠原等）與細胞內的骨架蛋白連接起來形成焦點粘附物，許多信號蛋白通過與焦點粘附物結合，調節(jié)著細胞的多種功能（包括細胞凋亡、細胞增殖、細胞粘附與遷移等）3-4. 由一個亞單位和一個亞單位非共價結合構成的異二聚體跨膜糖蛋白超家族. 至少15種亞單位和9種亞單位經不同組合產生二十多種整合素，不同類型的細胞可選擇性表達某些整合素而改變其粘附特性. , 亞單位都由較長的胞外區(qū)、單個跨膜區(qū)和通常較短的胞內區(qū)三部分組成. 胞外區(qū)能與細胞外基

19、質(ECM)大分子結合，使細胞粘附于ECM；胞內區(qū)則與細胞骨架相互作用，將大量研究證實失重或模擬失重環(huán)境下骨骼的力學信號傳導途徑受到抑制，其中一條重要的途徑為跨膜整合素、細胞骨架和細胞核轉錄功能之間的直接聯(lián)系. Schneider等7將5, 1整合素的抗體加入培養(yǎng)的UMR10601成骨細胞中，發(fā)現(xiàn)骨的礦化率分別下降了20%和45%；加入整合素21抗體，骨的礦化率下降95%；去除抗體以后骨的礦化率又能恢復正常. Nesti等8的研究表明TGF1這種促成骨作用是通過整合素來實現(xiàn)的. 楊志明等9的實驗結果發(fā)現(xiàn)阻斷I型膠原整合素21系統(tǒng)后，成骨細胞增殖能力減弱，凋亡率增高，I型膠原，整合素2, 1及骨

20、鈣素的mRNA表達減少. 以上的實驗結果提示整合素在調節(jié)成骨細胞作用. 我們的實驗結果提示失重環(huán)境下整合素發(fā)生的下調性改變可能是引起骨質疏松的原因之一. 【參考文獻】 1 Holick MF. Microgravityinduced bone losswill it limit human space exploration J? The Lancet, 2000,355(9215):1569-1570. 2 Zhang S, Wu XY, Li YH, et al. Effects of simulated weightlessness on the release of PGE2 in r

21、at calvarial osteoblasts induced by flow shear stress J. Space Med Med Engin, 2001,14(4):235-239. 3 CavalcantiAdam EA, Tomakidi P, Bezler M, et al. Geometric organization of the extracellular matrix in the control of integrinmediated adhesion and cell function in osteoblasts J. Prog Orthod, 2005,6(2):232-237. 4 Brakebusch C, Fassler R. Beta