基質(zhì)細胞衍生因子1α及其受體CXCR4在急性白血病的表達及與髓外浸潤的關系

1、基質(zhì)細胞衍生因子-1及其受體CXCR4在急性白血病的表達及與髓外浸潤的關系【摘要】 為了探討基質(zhì)細胞衍生因子-1（stromal cell derived factor-1，SDF-1）及其受體CXCR4在急性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞三系白血病的表達及與髓外浸潤的關系，對66例急性白血病中的急性淋巴細胞白血?。ˋLL）患者組（31例）、急性粒細胞白血?。∕2）患者組（20例）、急性單核系細胞白血?。∕4+M5）患者組（15例）、髓外浸潤患者組（41例）、非髓外浸潤患者組（25例），應用酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）及流式細胞術分別檢測SDF-1及其受體CXCR4在三組白血病外周血及骨髓白血病

2、細胞上的表達。結果表明：ALL患者組、M4+M5患者組、M2患者組及正常對照組血漿的SDF-1水平分別為1317.87±220.76，1339.79±187.06，1063.70±190.74，1908.34±135.55 (pg/ml)，其中ALL患者和M4+M5患者組高于M2患者組，但均明顯低于正常對照組（P0.01）。髓外浸潤患者組及非髓外浸潤患者組SDF-1血漿水平分別為1252.49±263.12、1234.91±185.50，（pg/ml），組間無顯著差別。CXCR4在ALL患者組、M4+M5患者組、M2患者組白血病細胞上

3、表達的平均熒光強度（MFI）為78.47±33.96、67.21±24.29、41.66±17.18，ALL患者組及M4+M5患者組明顯高于M2患者組（P0.05）。ALL患者組、M4+M5患者組間無顯著性差別。髓外浸潤患者組CXCR4表達的MFI（81.72±27.63）明顯高于非髓外浸潤患者組（36.94±11.86）（P0.05）。結論：急性淋巴細胞、單核細胞系白血病細胞趨化因子受體CXCR4高表達可能是其易發(fā)生髓外浸潤的分子機制，3組白血病患者外周血SDF-12 / 26表達水平均降低且與髓外浸潤無明顯相關，髓外浸潤可能更取決于受浸潤臟

4、器局部SDF-1表達水平。 【關鍵詞】 急性淋巴細胞白血病Expression of SDF-1 and Its Receptor CXCR4 in Acute Leukemias and Their Relationship with Extramedullary InfiltrationAbstract The study was aimed to explore the expression of stromal cell derived factor-1(SDF-1) and its receptor CXCR4，and their relationship with the extr

5、amedullary infiltration in acute lymphoblastic，grannulocytic and monocytic leukemia. 66 cases of acute leukemia included 31 cases of acute lymphoblatic leukemia (ALL)，20 cases of acute grannulocytic leukemia (M2) and 15 cases of acute monocytic leukemia (M4+M5). There were 41 cases with extramedulla

6、ry infiltration and 25 cases without-extramedullary infiltration. Enzyme-linked immunoabsorbent assay (ELISA) and flow cytometry were used to determine expression of SDF-1 and CXCR4 respectively on leukemia cells in peripheral blood and bone marrow of different groups. The results showed that averag

7、e plasma level of SDF-1 in the ALL，M4+M5，M2 patients and the normal control were 1317.87±220.76，1339.79±187.06，1063.70±190.74，1908.34±135.55 （pg/ml） respectively. The average levels in the ALL，M4+M5 and M2 patients groups were lower than those in normal control group. Both levels

8、 in ALL and M4+M5 patient groups were higher than that in M2 patient group. The average levels of SDF-1 in patient group with extramedullary infiltration and patient groups without-extramedullary infiltration were 1252.49±263.12，1234.91±185.50 （pg/ml） respectively. The former seemed as if

9、higher than the latter，but without statistical significance. The MFI of CXCR4 expression in ALL，M4+M5，M2 patient group were 78.47±33.96，67.21±24.29，41.66±17.18， respectively. CXCR4 expression in ALL and M4+M5 patient groups were higher than that in M2 patient group (P0.05). There was

10、no significant difference between the ALL and M4+M5 patient group (P>0.05). The MFI of CXCR4 expression in patients with extramedullary infiltration and patients without extra-medullary infiltration were 81.72±27.63，36.94±11.86 respectivehy. The former was higher than the latter(P&a

11、mp;lt;005). It is concluded that the higher expression of CXCR4 on acute lymphoblatic and monocytic leukemia cells may be one of the molecular mechanisams of extramedullary infiltration in both kinds of leukemia. The average plasma levels of SDF-1 decreased in leukemia patients and this decrease not

12、 related to the extramedular infiltration，which may be due to the SDF-1 local expression in the organ infiltrated.Key words acute lymphoblastic leukemia；acute grannulocytic leukemia；acute monocytic leukemia；stromal cell derived factor-1；CXCR4；extramedullary infiltration 白血病是惡性克隆性疾病，廣泛浸潤骨髓、肝、脾及淋巴結等器官

13、。盡管Reiter等1報道外周血白血病細胞數(shù)量反映體內(nèi)白血病細胞負荷的多少，與髓外浸潤的嚴重程度相關，但其具體機制并不清楚。白血病髓外浸潤是一個復雜的病理過程，包括白血病細胞的趨化、黏附、遷移、異位器官侵襲、生存、增殖及抗凋亡等多個環(huán)節(jié)。有關白血病細胞上黏附因子受體的表達與髓外浸潤的研究較多2，3，而對髓外浸潤與趨化因子及其受體的表達的關系國內(nèi)尚未見報道?；|(zhì)細胞衍生因子-1（stromal cell derived factor -1，SDF-1）是首先發(fā)現(xiàn)于骨髓基質(zhì)細胞培養(yǎng)上清的趨化性細胞因子，其受體CXCR4為G蛋白偶聯(lián)受體，屬于趨化因子亞家族CXC成員之一，二者特異結合，參與造血生成、

14、胚胎造血遷移、胚胎發(fā)育、組織再生、塑造、傷口愈合及腫瘤細胞的轉移和惡化等一系列生理、病理過程的調(diào)節(jié)。我們應用流式細胞術檢測白血病細胞表面的趨化因子及其受體CXCR4的表達，并探討二者與髓外浸潤的關系。材料和方法病例選擇和分組所有病例取自本院血液科門診及住院的初治急性白血病患者，66例，分組如下。 依據(jù)1986年FAB制定的MIC分型標準劃分為：急性淋巴細胞白血?。ˋLL）31例，其中男20例，女11例，平均年齡23.71±19.28歲，L1 1例，L2 29例，L3 1例；急性非淋巴細胞白血?。▎魏思毎礛4+M5）15例，男9例，女6例，平均年齡39.67±17.52歲，

15、M4 4例，M5 11例；急性非淋巴細胞白血?。＜毎礛2）20例，男12例，女8例，平均年齡31.86±13.25歲。 依據(jù)髓外浸潤的癥狀分為髓外浸潤組和非髓外浸潤組。髓外浸潤的判斷：體檢及B超檢查出現(xiàn)下列體癥之一即為髓外浸潤組：皮膚結節(jié)（病理證實為白血病細胞浸潤），牙齦增生，肝、脾、淋巴結腫大，中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤。本研究66例患者中髓外浸潤41例，男18例，女23例，平均年齡28.74±19.16歲；其中ALL 23例，M2 7例，M4+M5 11例。非髓外浸潤25例，男14例，女11例，平均年齡32.13±17.35歲；其中ALL 8例，M2 13例，M4+

16、M5 4例。 正常對照組10例，男6 例，女4例，平均年齡35.0±12.0 歲。儀器試劑FACSort流式細胞儀（Becton Dickinson公司產(chǎn)品），SVNRISR全自動酶標儀（澳大利亞Ges.M.B.H.TECAN公司產(chǎn)品）。4520 S/N17918-455搖床（美國Forma Scientific InC公司產(chǎn)品），Biofuge Stratus，Heraeus臺式高速低溫離心機（德國貝克曼公司產(chǎn)品）。-80冰箱（日本Sanyo產(chǎn)品）。-20冰箱（新飛公司產(chǎn)品）。CD2、CD7、CD19、CD20、CD38、CD33、CD34、CD117單克隆體抗為Becton Di

17、ckinson公司產(chǎn)品，TdT、CD5、CD10、CD13、CD14、CD64單克隆抗體均為PharMingen公司產(chǎn)品，PE標記CXCR4單克隆抗體及小鼠同型Ig2對照購自R&D公司。SDF-1酶聯(lián)免疫吸附實驗試劑盒（購自R&D公司，靈敏度為18 pg/ml）包括：覆蓋SDF-1單克隆抗體96孔板，SDF-1結合液21 ml，SDF-1標準品100 ng，檢測稀釋液RD1-55 11 ml，校正稀釋液RD6Q 21 ml，顯色劑A 12.5 ml，顯色劑B 12.5 ml，停止反應液6 ml，清洗緩沖液20 ml，膠帶4張。淋巴細胞分離液，小牛血清白蛋白（BS

18、A），疊氮鈉，肝素鈉（12 500 U），Dubicol緩沖液。CXCR4的檢測采用雙色熒光標記法，以新鮮骨髓標本常規(guī)白血病免疫分型，同樣標本以淋巴細胞分離液梯度密度離心獲單個核細胞，以預冷的含0.5%的BSA、0.1%疊氮鈉的PBS(Dubicol)洗2次（1 000轉/5分鐘）。調(diào)細胞濃度至4×106/L，取上述細胞懸液50 l，分別加入PE標記的CXCR4單克隆抗體和小鼠Ig2同型對照。4冰箱內(nèi)放置40分鐘，以PBS(Dubicol)離心洗去多余未結合的抗體，加入400 l PBS 上機檢測。各測定管用FACSort流式細胞儀CellQuest軟件以對數(shù)（log）取樣，每管獲取

19、并分析10 000個細胞。通過前向角光散射（forward scatter，F(xiàn)SC）和側向角散射（side scatter，SSC）設門（R1），以排除碎片和死細胞。再用CD45/SSC設門分析R1內(nèi)細胞，依據(jù)細胞的抗原表達及細胞的顆粒性識別各群細胞。判別正常細胞與異常細胞群進行重點分析。依據(jù)CellQuest軟件32分析細胞表面的MFI。SDF-1檢測血漿標本的收集和處理 收集骨髓標本同時取肝素抗凝的外周靜脈血1.5 ml，30 分鐘內(nèi)離心，1 000×g離心15分鐘，取上層血漿在-4條件下以10 000×g進行第2次離心10分鐘，留取上層血漿置-80冰箱凍存。正常對照組

20、取自門診檢查并排除惡性血液病的就診者外周靜脈血（肝素抗凝）1.5 ml，標本處理方法同上。血漿SDF-1濃度的酶聯(lián)免疫吸附檢測主要步驟如下：復溫：將所有試劑及標本溫度恢復至室溫；標準曲線的制作：取試管8個，分別編號1-8，于1管中加入900 l校正稀釋液，2-8管分別加入500 l校正稀釋液。將1ml三蒸餾水加入100 ng SDF-1標準品中，充分混勻，終濃度為100 000 pg/ml，取100 l上述濃度標準品加1管中，混勻后以移液槍吸取500 l移入2管，再次混勻，依次移入3-7中，8為空白對照管；于ELISA微孔板中每孔加檢測RD1-55稀釋液100 l；每孔加標準品或樣本100 l

21、，混勻，以膠帶封閉，固定至搖床上（500 ±50 rpm）室溫下孵育2小時； 配制清洗緩沖液：以量筒量取480 ml蒸餾水，以吸管加入濃縮稀釋液20 ml至500 ml，玻棒混勻待用；每孔加入400 l上述清洗緩沖液，混勻，棄去液體，以洗水紙吸干，重復洗4次；每孔加200 l SDF-1結合液，以膠帶覆蓋，重復放置搖床上孵育2小時；每孔加入400 l上述清洗緩沖液，4次；配制底物作用液：取A液、B液等量混勻于小燒杯中，避光保存；每孔加200 l上述混合液，室溫下避光放置30分鐘；11每孔加50 l停止作用液，混勻；1230分鐘內(nèi)以全自動酶標儀分別在570 nm和540 nm波長處測量

22、吸光度（A），測量值A=A540 nm-A570 nm。在讀取A值，重復檢測2次，取均值。13以標準品的不同濃度及相應的A分別取自然對數(shù)后回歸分析，求出回歸方程：=3.525±0.936X，相關系數(shù)r=0.980（t=4.130，P0.001）。根據(jù)回歸方程以實驗所得A值求出樣品濃度，進行統(tǒng)計學分析。統(tǒng)計方法兩均數(shù)比較用t 檢驗，多個均數(shù)比較應One Way-ANONY，3組以上均數(shù)間兩兩比較應用最小顯著差（LSD）t檢驗，統(tǒng)計均用SSPS 10.0醫(yī)學軟件。結 果SDF-1在各型白血病中的表達ALL、M4+M5、M2三組急性白血病患者外周血漿SDF-1的表達均低于正常對照組。ALL

23、、M4+M5組間無顯著性差別(P0.05)，但均高于其在M2組血漿中的表達水平(F=10.97，P0.05） (表1)。Table 1. SDF-1 expression in different leukemia groups and normal control group（略）CXCR4在各型白血病中的表達ALL、M4+M5組骨髓白血病細胞上CXCR4表達的MFI高于M2組（LSD檢驗：均數(shù)間MD分別26.583，36.217；P分別為0.021，0.001），ALL組、ANLL（M4+M5）組間比較無統(tǒng)計學差異(均數(shù)間MD為0.410，P=0.410)（表2）。Table 2. CXC

24、R4 expression in different leukemia groups（略）SDF-1/CXCR4在髓外浸潤組和非髓外浸潤組的表達急性白血病髓外浸潤組和非髓外浸潤組外周血漿SDF-1水平的比較無顯著性差別(P0.05)，而髓外浸潤組骨髓白血病細胞上CXCR4的表達明顯高于非髓外浸潤組（P0.01）（表3）。Table 3. SDF-1/CXCR4 expression in extramedullary infiltration and non-extramedullary infiltration patients（略）SDF-1/CXCR4與外周血白血病細胞的數(shù)量的相關性分析

25、3組急性白血病患者外周血漿SDF- 1的表達同外周血白血病細胞計數(shù)間無明顯相關（Pearson檢驗，r=-0.197，P0.05），而骨髓中白血病細胞上CXCR4的表達與外周血白血病細胞計數(shù)呈正相關（Pearson檢驗，r=0.628，P0.01）。討論髓外浸潤是白血病細胞的重要生物學特點，髓外浸潤的過程可能與淋巴細胞的歸巢和白細胞的游走有相似的機制，體內(nèi)白血病細胞總是趨向于能提供的適宜其生長的特定條件、表達特定的趨化因子，并能捕獲或吸引血流中表達其特定受體的組織或器官，這是一個有序的、復雜的、有器官選擇性的病理過程，除黏附因子外，趨化因子及受體在此過程中也可能起重要作用。在造血干細胞歸巢的研

26、究中發(fā)現(xiàn)，SDF-1不僅是正常造血干/祖細胞的趨化因子，也是分化受阻的白血病細胞的趨化因子4，其影響白血病趨化能力與白血病細胞上其受體CXCR4的表達有關。 CXCR4表達在多種白血病細胞上，與白血病細胞在血髓的分布和擴散有關。Mohle等4用RT-PCR技術發(fā)現(xiàn)，所有的白血病細胞系及原代白血病細胞均表達CXCR4 mRNA，體外試驗表明CD34+白血病細胞同CD34+造血干細胞一樣在Transwell體系中向高濃度SDF-1方向遷移，這證明細胞雖已惡性轉化，但仍保持著趨化因子受體的功能，是影響白血病細胞體內(nèi)遷移的重要生物學基礎。Voermans 等5和Mohle等6在體外實驗中發(fā)現(xiàn)，白血病細

27、胞的遷移能力與細胞表面的CXCR4的表達呈正相關，而與白血病細胞的大小、生長周期無關，高度表達CXCR4的白血病細胞遷移能力明顯增強，這證明趨化因子受體的表達是影響白血病細胞體內(nèi)播散的重要因素。 本研究應用流式細胞儀檢測分析了66例成人急性淋巴細胞、急性單核細胞及急性粒細胞三系白血病細胞的免疫分型及趨化因子受體CXCR4的表達，結果發(fā)現(xiàn)CXCR4在急性淋巴細胞白血病細胞、急性單核系白血病細胞上高表達，而在粒細胞系白血病細胞上表達相對減弱。這與臨床上淋巴細胞、單核細胞兩類白血病易合并髓外浸潤的癥狀相一致。本研究結果顯示，CXCR4在髓外浸潤組的表達率明顯高于非髓外浸潤組，提示CXCR4表達上調(diào)可

28、能是導致髓外浸潤發(fā)生的原因之一。這與Crazzolara等7在小兒ALL的臨床研究一致。相關性分析表明，CXCR4的表達同外周血白血病細胞數(shù)呈正相關，提示除反映白血病的容量負荷外周白血病細胞數(shù)量外，趨化因子受體CXCR4的表達也是髓外浸潤發(fā)生的重要條件，是預測髓外浸潤發(fā)生的敏感生物學指標。這種趨化因子受體表達的上調(diào)可能是惡性克隆細胞獲得多臟器廣泛浸潤的生物學特性的生物學基礎，是“功能多余性”表現(xiàn)8，也是腫瘤異質(zhì)性特征之一，而趨化因子受體表達的上調(diào)及其與配體的相互作用可能是白血病髓外浸潤發(fā)生的分子機制之一。同時發(fā)現(xiàn)在CXCR4及外周血白血病細胞數(shù)均減低時仍有9例發(fā)生髓外浸潤（本文未報），說明除趨

29、化因子外，其他細胞因子如黏附因子也在白血病的髓外浸潤發(fā)生中起重要作用。 SDF-1是CXCR4的配體，不僅產(chǎn)生于骨髓基質(zhì)細胞，也產(chǎn)生于肝、脾、淋巴結、腎、腦等多種組織器官，并通過參與黏附分子1的激活9，提高基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）活性，降低組織型金屬蛋白酶抑制劑（TMP）的活性，特異性地降解細胞外基底膜的型膠原10，促進白血病細胞趨化、黏附、穿出血管壁，進入血管外組織，形成惡性克隆的浸潤。SDF-1在肝、脾、淋巴結、中樞神經(jīng)系統(tǒng)及內(nèi)皮細胞高表達而在腎臟組織血管內(nèi)皮細胞低表達11，后者白血病細胞浸潤相對少見，這可能是導致白血病時各臟器髓外浸潤癥狀不均衡的重要原因之一。本研究首次發(fā)現(xiàn)：3種細胞系急

30、性白血病患者的SDF-1的血漿水平明顯低于正常對照組，但與外周血白血病細胞數(shù)量及髓外浸潤的發(fā)生無明顯相關，可能與白血病時惡性克隆在骨髓中異常增生，使骨髓基質(zhì)細胞生長相對受抑，SDF-1分泌水平減少有關，也可能與白血病時其他細胞因子如TGF使骨髓基質(zhì)細胞中SDF-1的mRNA的表達下調(diào)有關12。外周血中SDF-1的水平可能與外周血白血病細胞數(shù)量及髓外浸潤的程度無關，而髓外浸潤癥狀的發(fā)生可能更取決于各臟器局部SDF-1的水平。SDF-1是一種生長刺激因子，通過增加bcl-2的表達促進白血病細胞生長、增殖及抗凋亡能力的調(diào)節(jié)。應用抗SDF-1單克隆抗體可以加速腫瘤細胞的凋亡，減緩腫瘤的生長13。由此可

31、見，骨髓基質(zhì)細胞及髓外組織內(nèi)產(chǎn)生SDF-1不僅促進白血病細胞的局部浸潤，而且也是使其在局部生長、增殖的保護因子，是髓外浸潤得以發(fā)生、發(fā)展的重要條件。在完全緩解期，隨基質(zhì)細胞功能的恢復，髓外浸潤器官中SDF-1可能是殘留的白血病細胞得以生存的原因及導致白血病復發(fā)的根源。 統(tǒng)計分析還表明：ALL、M4+M5組SDF-1的血漿水平高于M2組，在3組白血病骨髓基質(zhì)功能均受抑時，急性淋巴細胞白血病、急性單核細胞白血病患者血漿中SDF-1水平的升高提示，在急性淋巴細胞白血病、急性單核細胞白血病中除SDF-1的旁分泌作用外，可能同時存在兩系白血病細胞的自分泌作用。Cignetti等14應用RT-PCR技術發(fā)

32、現(xiàn)，ANLL，M4，M5細胞表達SDF-1的mRNA，ALL細胞的體內(nèi)自分泌作用目前尚未見報道，有待于進一步研究。 由上可見，SDF-1/CXCR4系統(tǒng)在白血病中表達水平并不一致，可能主要是通過CXCR4表達的上調(diào)發(fā)揮其生物學效應的，其失衡的機制有待于進一步探討。進一步研究二者在相互作用及轉錄調(diào)控機制，有可能為以CXCR4為靶點的白血病治療提供新的思路?！緟⒖嘉墨I】 1Reiter A，Schrappe M，Ludwig WD，et al. Chemotherapy in 998 unselected childhood acute lymphoblastic leukemia patient

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