鐵皮石斛互補(bǔ)脫氧核糖核酸表達(dá)文庫(kù)的構(gòu)建及分析

1、鐵皮石斛互補(bǔ)脫氧核糖核酸表達(dá)文庫(kù)的構(gòu)建及分析 【關(guān)鍵詞】鐵皮石斛/化學(xué)；,石斛堿/生物合成；,基因文庫(kù) 摘要：【目的】構(gòu)建鐵皮石斛互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)表達(dá)文庫(kù)，為克隆石斛活性成分生物合成相關(guān)功能基因的全長(zhǎng)奠定基礎(chǔ)。【方法】以Trizol一步法從4年生的鐵皮石斛中提取總RNA，分離純化mRNA，LD_PCR(longdistancepolymerasechainreaction)法反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA，以TripIEX2為載體，構(gòu)建鐵皮石斛cDNA文庫(kù)，文庫(kù)滴度以每mL含噬菌斑形成單位(pfu)的數(shù)目來(lái)表示，PCR擴(kuò)增鑒定插入片段?！窘Y(jié)果】成功地構(gòu)建了鐵皮石斛cDNA表達(dá)文庫(kù)，原始文庫(kù)

2、的噬菌斑滴度為43×105?pfu/mL，總克隆數(shù)為31×105，重組率為976%，擴(kuò)增后文庫(kù)總滴度為68×109?pfu/mL，對(duì)隨機(jī)挑取的噬菌斑進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果插入片段多分布在0520?kb之間，絕大部分在1217?kb左右?！窘Y(jié)論】文庫(kù)質(zhì)量鑒定結(jié)果表明，所構(gòu)建的鐵皮石斛cDNA文庫(kù)具有較好的庫(kù)容量、較高的重組率以及較大的插入片段。 關(guān)鍵詞：鐵皮石斛/化學(xué)；石斛堿/生物合成；基因文庫(kù) 中藥功能基因的研究逐漸成為中藥現(xiàn)代化研究的一個(gè)熱點(diǎn)，因?yàn)楣δ芑蚝痛紊x酶基因決定了有效成分的結(jié)構(gòu)與功能，是中藥現(xiàn)代化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。在植物中藥功能基因研究中，與基因組測(cè)序

3、和表達(dá)序列標(biāo)記(expressedsequencetag，ESTs)測(cè)序相比，藥用活性成分生物合成相關(guān)基因的研究更受到重視，克隆基因的數(shù)量呈上升趨勢(shì)，預(yù)示著天然產(chǎn)物后基因組時(shí)代的開(kāi)啟及一些天然產(chǎn)物生產(chǎn)方式的可能變革。人們期望克隆中藥有效成分的功能基因，并通過(guò)基因工程與化學(xué)的有機(jī)結(jié)合而形成新的基因藥物。 2 / 13石斛為名貴中藥材，具有滋陰清熱、生津益胃、潤(rùn)肺止咳、明目強(qiáng)身等功效。石斛堿是石斛藥材中最重要的活性成分之一，也是最早從石斛中分離出來(lái)的化合物2-3，為分離、克隆石斛堿相關(guān)功能基因，本文構(gòu)建了鐵皮石斛互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)表達(dá)文庫(kù)，為克隆全長(zhǎng)石斛堿生物合成相關(guān)功能基因并進(jìn)行功能鑒

4、定奠定基礎(chǔ)。 1材料與方法 11材料供試鐵皮石斛采自云南大理，由中國(guó)科學(xué)院華南植物研究所葉秀嶙研究員提供，保種于本實(shí)驗(yàn)室。 12主要試劑與儀器Trizol試劑酶購(gòu)自Gibco公司；信使核糖核酸(mRNA)分離純化試劑盒購(gòu)自Promega公司；cDNA文庫(kù)試劑盒購(gòu)自Clontech公司；SfiI購(gòu)自Biolabs公司；焦碳酸二乙脂(DEPC)購(gòu)自上海生工公司(Amresco分裝)；其他常規(guī)生化試劑均為分析純。紫外分光光度計(jì)為Pharmacia公司的Genequant;聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀為PekingElemer公司的GeneAmpSYSTEMS?9600。 13總核糖核酸(RNA)提取及m

5、RNA純化取4年生新鮮的鐵皮石斛，稱取其葉片100?mg，經(jīng)清洗及用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇消毒后，置研缽中加液氮迅速充分研磨，加2?mLTrizol試劑，余下操作按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行；提取的總RNA用12?g/L的甲醛瓊脂糖變性凝膠電泳分析并鑒定其質(zhì)量，用100?LDEPC水溶解儲(chǔ)于-80的超低溫冰箱中備用；取10?LRNA用DEPC水稀釋50倍后，采用分光光度計(jì)測(cè)量260?nm/280?nm處的吸光度(D)，計(jì)算總RNA的得率，計(jì)算公式為：RNA=004×稀釋倍數(shù)×D260采用親和素順磁珠(SAPMPS)法從總RNA中分離純化mRNA。在無(wú)RNA酶(RNaesfree)的Ep

6、pendorf管中加入01?mg的總RNA和無(wú)RNA酶的水至終體積為500?L，65加熱10?min，加入3?L生物素標(biāo)記的高聚脫氧胸苷酸Oligo(dT)和13?L?20倍的SSC緩沖液于RNA中，其余步驟按說(shuō)明書(shū)及文獻(xiàn)4-5方法進(jìn)行。 14cDNA的合成及文庫(kù)的構(gòu)建采用LongDistancePCR(polymerasechainreaction)法合成cDNA的第1和第2鏈4-7。在05?mL離心管中，加入3?L鐵皮石斛mRNA，按試劑盒方法加入相應(yīng)試劑及引物，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶合成第1鏈cDNA；在1個(gè)05?mL的離心管中加入2?L第1鏈cDNA，其余試劑按試劑盒要求加入，放入經(jīng)預(yù)熱到95的P

7、CR儀中。PCR反應(yīng)程序如下：94變性30?s，接著94、5?s，68、6?min，共26個(gè)循環(huán)；PCR結(jié)束后，取5?L采用11?g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。合成的cDNA經(jīng)蛋白酶K處理去除蛋白質(zhì)，經(jīng)氯仿/異戊醇抽提，酒精沉淀后，用限制性內(nèi)切酶SfiI酶切消化，過(guò)CHROMASpin400柱分離純化，除去分子量小于400?bp的cDNA片段和雜質(zhì)。 將分離的雙鏈cDNA片段按一定濃度與定向克隆到SfiI酶切的去磷酸化的TripIEX2噬菌體連接，cDNA按濃度梯度設(shè)計(jì)3個(gè)連接反應(yīng)，cDNA的用量分別為05?L、10?L、15?L；并將連接產(chǎn)物用噬菌體包裝蛋白進(jìn)行包裝構(gòu)成cDNA原始文庫(kù)，以XL1

8、_Blue為受體擴(kuò)增文庫(kù)后，用噬菌體緩沖液收集于4保存。 15cDNA文庫(kù)質(zhì)量鑒定 151滴度測(cè)定用噬菌體緩沖液分別將原始和已擴(kuò)增的cDNA文庫(kù)稀釋不同倍數(shù)，加入100?L的XL1_Blue受體菌及100?L稀釋液，37吸附15?min；然后混合2?mL溶化的LB/MgSO4頂層軟瓊脂(48左右)，迅速混勻到預(yù)熱至37的平板，快速搖動(dòng)平板使頂層軟瓊脂分布均勻，頂層軟瓊脂凝固后，37倒置培養(yǎng)過(guò)夜，每隔2?h檢查噬菌斑生長(zhǎng)情況。每2?mL的頂層軟瓊脂加50?L?5溴4氯3吲哚D半乳糖苷(XGal，20?g/L)、50?L異丙基硫代D半乳糖(IPTG，20?g/L)，計(jì)數(shù)噬菌斑形成單位(plague

9、formingunit，pfu)，按下列公式計(jì)算文庫(kù)滴度：npfu/(個(gè)・mL-1)=(N噬菌斑×稀釋倍數(shù))/V受體菌152文庫(kù)重組率的測(cè)定采用藍(lán)白斑互選法測(cè)定重組率8-11，利用XGal顯色原理，在測(cè)定滴度時(shí)加入100?mmol/L的IPTG及XGal，過(guò)夜培養(yǎng)，通過(guò)籃、白斑的數(shù)量計(jì)算文庫(kù)重組率。 153cDNA插入片段的PCR快速鑒定采用TripIEX2噬菌體5PCR?primer和3PCR?primer引物分別對(duì)構(gòu)建的文庫(kù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢查插入片段的長(zhǎng)度；從LB平板上隨機(jī)挑取13個(gè)獨(dú)立的噬菌斑，分別加到含有200?L噬菌體緩沖液的Eppendorf管中，

10、37放置1?h后，保存于4；在PCR管中加入3?L?10倍的PCR緩沖液、24?L2?mmol/L脫氧核苷酸混合物(dNTP)、24?L25?mmol/LMgCL2、1?L?Tap酶、TripIEX2上下游測(cè)序引物各10?pmol/L，加去離子水使總體積達(dá)30?L。PCR反應(yīng)條件為95預(yù)變性4?min，95變性30?s，55退火45?s，72延伸1?min，36個(gè)循環(huán)，最后72延伸10?min，反應(yīng)在PTC?220型PCR儀上進(jìn)行，11?g/L?的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分析。 2結(jié)果 21總RNA及mRNA的質(zhì)量提取的總RNA經(jīng)分光光度計(jì)測(cè)定，測(cè)得mRNA的D260nm平均吸收值為023，平均得率

11、為046?g/L，D260nm/D280nm=19，無(wú)DNA、蛋白質(zhì)及小分子污染。提取的總RNA經(jīng)12?g/L的甲醛瓊脂糖變性凝膠電泳檢測(cè)，出現(xiàn)非常清晰的28s?RNA(s為沉降系數(shù))和18s?RNA兩條帶(圖1)，表明所提取的RNA基本上沒(méi)有降解；加樣孔處沒(méi)有亮帶，說(shuō)明沒(méi)有DNA和小分子物質(zhì)的污染；mRNA分離純化后電泳呈彌散狀，也證明了總RNA的完整性，說(shuō)明提取的RNA質(zhì)量很高，符合建庫(kù)要求。 22cDNA的合成及分析用LDPCR法合成cDNA第1和第2鏈之后，經(jīng)11?g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，整個(gè)條帶呈彌散狀，結(jié)果顯示合成的cDNA基本分布在059?kb之間(圖2)，中間有幾條與組織特

12、異性高豐度mRNA相對(duì)應(yīng)的亮帶，說(shuō)明純化的mRNA所合成的cDNA較為完整、質(zhì)量較好，合成的雙鏈cDNA是成功的，符合建庫(kù)要求。 23文庫(kù)的滴度、重組率及插入片斷大小分析將包裝產(chǎn)物稀釋后進(jìn)行原始文庫(kù)的滴度檢測(cè)，結(jié)果表明原始文庫(kù)的滴度為43×105?pfu/mL，總克隆數(shù)為31×105個(gè)；擴(kuò)增文庫(kù)的滴度為68×109pfu/mL。通過(guò)XGal顯色原理測(cè)定重組率，計(jì)算藍(lán)斑及白斑的數(shù)量，得到文庫(kù)的重組率為976%。從LB平板上隨機(jī)挑取13個(gè)噬菌斑的PCR鑒定，結(jié)果插入片段多分布在0520?kb之間，絕大部分在1217?kb左右(圖3)。 3討論 構(gòu)建高質(zhì)量的cDNA文庫(kù)

13、，是高效篩選目的基因的關(guān)鍵。而其前提是提取并分離出高質(zhì)量的mRNA，因此提取純度高、完整性好的mRNA就成為cDNA文庫(kù)構(gòu)建的核心步驟，直接關(guān)系到文庫(kù)的建立和文庫(kù)的質(zhì)量。植物組織中的RNA含量較低，而且離體植物組織的RNA降解速度很快，因此，鐵皮石斛葉片采下后應(yīng)迅速用液氮冷凍，然后放置-70中保存，以保證RNA不被降解。在提取過(guò)程中嚴(yán)格防止RNA酶的污染，并設(shè)法抑制其活性，是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。鐵皮石斛RNA提取和mRNA分離的方法與其他植物的方法基本相同，但由于鐵皮石斛多糖含量較高，我們采用十六烷基三乙基溴化銨(CTAB)法去除多糖，結(jié)合LiCl分離DNA和RNA，加強(qiáng)了RNA的純化過(guò)程，取得了

14、很好的效果，獲得了高質(zhì)量的總RNA；采用磁珠法分離mRNA，簡(jiǎn)單、快速、方便，得到了純凈的mRNA。 文庫(kù)的滴度、重組率及插入片段的大小是鑒定cDNA文庫(kù)質(zhì)量的重要指標(biāo)。本文運(yùn)用了LD_PCR法合成cDNA，使得低豐度的基因表達(dá)序列在文庫(kù)中得到了富集，便于稀有mRNA的擴(kuò)增和克隆。一般來(lái)說(shuō)，文庫(kù)的滴度達(dá)到105pfu/mL以上即為有效的文庫(kù)12。我們構(gòu)建的cDNA文庫(kù)的滴度為43×105pfu/mL，符合這一要求，文庫(kù)的重組率為976%，說(shuō)明文庫(kù)是完整的、有效的，并且質(zhì)量較高。另外，我們選用容易質(zhì)粒化的TripIEX2為cDNA的克隆載體，TripIEX2具有多方面的優(yōu)點(diǎn)，它可以通過(guò)

15、插入亞克隆而轉(zhuǎn)至質(zhì)粒載體或其他表達(dá)載體，每一個(gè)插入TripIEX2載體的多克隆位點(diǎn)(MCS)部位的cDNA均可通過(guò)全部3個(gè)閱讀框架進(jìn)行表達(dá)；且構(gòu)建的文庫(kù)滴度高，為應(yīng)用快速末端擴(kuò)增法(rapidamplificationofcDNAends，RACE)克隆全長(zhǎng)石斛堿生物合成相關(guān)功能基因奠定了基礎(chǔ)。 參考文獻(xiàn)： 朱平，王偉，程克棣.藥用植物功能基因J.中國(guó)生物工程雜志，2004，24(2)：3. BiZhiming，WangZhengtao，XuLuoshanChemicalconstituentofDendrobiummoniliformeJ.ActaBotanicaSinica，2004，46

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