慢性低O2高CO2對大鼠海馬Bcl2、Bax基因表達和細胞凋亡的影響

1、慢性低O2高CO2對大鼠海馬Bcl-2、Bax基因表達和細胞凋亡的影響【摘要】 目的:探討慢性低O2高CO2對大鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡的誘發(fā)作用及對Bcl-2、Bax基因表達的影響。方法:雄性SD大鼠50只，隨機均分成5組：正常對照組（NC）、低O2高CO21周組（1HH）、2周組（2HH）、3周組（3HH）和4周組（4HH）。采用TUNEL法檢測海馬神經(jīng)細胞凋亡；以RT-PCR檢測海馬Bcl-2 mRNA和Bax mRNA的表達。結(jié)果:隨著低O2高CO2時間延長，凋亡指數(shù)(AI)及Bax mRNA水平進行性升高；Bcl-2 mRNA先升高后下降（均P<0.01）。AI與Bax mR

2、NA之間呈顯著正相關(guān)（r=0.814，P<0.01），而與Bcl-2 mRNA/Bax mRNA比值之間呈顯著負相關(guān)（r=-0.405，P<0.01）。結(jié)論:慢性低O2高CO2可以誘發(fā)大鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡，Bcl-2/Bax比值下降是促進凋亡的重要因素。 【關(guān)鍵詞】 海馬 低氧 高碳酸血癥 凋亡 Bcl-2 Bax Abstract: Objective: To explore the inducing effect of chronic hypoxic hypercapnia on the apoptosis of rat neural cells in the

3、hippocampus, and the relationship between the apoptosis and Bcl-2 as well as Bax gene expression. Methods: Fifty male spragu-dawley rats were randomly divided into five groups: normal control group (NC), hypoxic hypercapnia 1-week (1HH), 2-week (2HH), 3-week (3HH) and 4-week (4HH) group. The in situ

4、 cell apoptosis in the hippocampus was detected with TUNEL staining. The expression of Bcl-2 and Bax mRNA in the hippocampus were examined with RT-PCR. Results: Apoptosis index (AI) and the expression Bax mRNA were progressirely increased with the prolongation of duration of hypoxic hypercapnic expo

5、sure, and the expression of Bcl-2 mRNA was increased at first, then declined. There was a significant positive correlation between AI and the expression of Bax mRNA (r=0.814, P<0.01), and there was a significant negative correlation between AI and the ratio of Bcl-2 mRNA/Bax mRNA (r=-0.405, P

6、<0.01). Conclusion: Apoptosis can be induced by chronic hypoxic hypercapnia in rat hippocampus. The ratio of Bcl-2/Bax decline accelerates the occurrence of apoptosis.2 / 13 Key words: hippocampus; hypoxia; hypercapnia; apoptosis; Bcl-2; Bax 臨床上慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstruc-tive pulmonary disease，

7、COPD）由于通氣功能障礙常引起低氧血癥或伴高碳酸血癥，病情持續(xù)發(fā)展可導致肺性腦病。動物實驗也發(fā)現(xiàn)，慢性低氧能夠引起腦組織結(jié)構(gòu)和功能的損害1，2，但迄今為止，其發(fā)生機制尚未完全闡明。近年來研究發(fā)現(xiàn)，細胞凋亡可能在慢性低氧性腦損害中起重要作用3。本實驗采用慢性低O2高CO2性肺動脈高壓大鼠模型，通過不同低O2高CO2干預(yù)時間（1周、2周、3周、4周），動態(tài)觀察大鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡及凋亡相關(guān)基因表達的變化，初步探討慢性低O2高CO2大鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡的可能機制。 1 材料和方法 1.1 主要材料 常壓低02高CO2艙（溫州醫(yī)學院肺心病研究室研制），CYESIl型O2、CO2氣體測定儀（上海市嘉定

8、學聯(lián)儀表廠生產(chǎn)），Medlab生物信號采集處理系統(tǒng)（南京美易科技有限公司生產(chǎn)），TUNEL試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)），梯度PCR儀（Effendorf公司生產(chǎn)），RT-PCR試劑盒（Fermentas公司提供）。 1.2 動物分組及模型制備4 雄性SD大鼠50只（溫州醫(yī)學院實驗動物中心提供），體重180220 g。隨機分成5組：即正常對照組（NC）、低O2高CO21周組（1HH）、2周組（2HH）、3周組（3HH）和4周組（4HH），每組10只。將后4組動物放入常壓低O2高CO2艙內(nèi)，艙內(nèi)充入氮氣（N2）使O2濃度維持在9%11%，CO2濃度維持在5.5%6.5%，每天8 h，連

9、續(xù)1周（1HH組）、2周（2HH組）、3周（3HH組）或4周（4HH組）。對照組大鼠除吸入空氣外，其他飼養(yǎng)條件與各低O2高CO2組相同。動物飼養(yǎng)到規(guī)定時間后，用戊巴比妥鈉（35 mg/kg）腹腔麻醉，右心導管法測定平均肺動脈壓（mPAP）、平均頸動脈壓（mCAP）。 1.3 取材和標本制作 經(jīng)左頸總動脈插管處用4 生理鹽水200 m1灌注10 min。將大鼠斷頭，取腦置于冰盤上，快速分離出左、右海馬。左側(cè)海馬置于液氮迅速冷凍，再放-70 冰箱保存，用于RT-PCR檢測。右側(cè)海馬放入4%多聚甲醛中固定4 h，依次進行梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、5m厚連續(xù)切片，用于細胞凋亡檢測。 1.4

10、 海馬神經(jīng)細胞凋亡原位檢測 采用原位缺口末端標記（TUNEL）法，按試劑盒提供方法操作。鏡檢細胞核中有棕黃色顆粒者為凋亡細胞。隨機計算5個高倍視野（×400）下的凋亡細胞數(shù)。凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI）以凋亡細胞/100個細胞（%）表示。 1.5 Bcl-2和Bax基因的RT-PCR檢測 Bcl-2和Bax引物根據(jù)Genebank資料，利用primer 5.0引物設(shè)計軟件確定最優(yōu)引物，然后經(jīng)Blast匹對，由上海生工生物有限公司合成。Bcl-2引物：上游為5'-CTGGTGGACAACATCGCTCTG-3'，下游為5'-GGTCTGCTG

11、ACCTCACTTGTG-3'，擴增片段228 bp；Bax引物：上游為5'-GCGAATTGGAGATGAACTGG-3'，下游為5'-GTGAGCGAGGCGGTGAGGAC-3'，擴增片段366 bp。以GAPDH作為內(nèi)參照，引物序列：上游為5'-AGTATGACTCCACTCACGGCAA-3'，下游為5'-TCTCGCTCCTGGAAGATGGT-3'，擴增片斷100 bp。 取左側(cè)海馬組織勻漿后，提取1l RNA樣品，采用紫外分光光度法測定RNA純度，以O(shè)D260/OD280的比值表示，要求比值在1.82.0之

12、間。取2g RNA，采用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，按20l體系，42 ，逆轉(zhuǎn)錄1 h。多聚酶反應(yīng)總體系為20l（包含GAPDH引物），所有引物退火溫度為56 ，擴增35個循環(huán)，脂糖電泳，溴乙啶染色，紫外燈照相，凝膠圖像掃描。 1.6 統(tǒng)計分析 多組樣本均數(shù)比較進行方差齊性檢驗，組間比較采用單因素方差分析，方差齊性者用LSD檢驗，方差不齊者用Dunnett's T3檢驗。雙變量相關(guān)分析用Pearman直線相關(guān)分析法分析。 2 結(jié)果 2.1 低O2高CO2對大鼠mPAP、mCAP、RV/（LV+S）的影響 慢性低O2高CO2各組mPAP、RV/（LV+S）均高于正常對照組（均P<0

13、.01），mPAP、RV/（LV+S）在慢性低O2高CO2 2周時達最高，34周漸趨穩(wěn)定。各組間mCAP差異無顯著性（均P>0.05）。見表1。 2.2 大鼠海馬細胞凋亡檢測 NC組海馬神經(jīng)細胞少量凋亡（見圖1）；低O2高CO2各組與NC組比較，細胞凋亡均顯著增加（P<0.05或P<0.01）。隨著低O2高CO2時間的延長，細胞凋亡有逐漸增多的趨勢，4HH組TUNEL陽性細胞最多（見圖4）。4HH組AI較1HH組高261.6%（P<0.01），較2HH組高71.4%（P<0.01），較3HH組增高不明顯（見表2）。 2.3

14、海馬Bcl-2 mRNA和Bax mRNA的表達及Bcl-2/Bax比值 低O2高CO2各組海馬Bcl-2 mRNA和Bax mRNA表達上調(diào)，與NC組比較均有顯著性差異（均P<0.01）。隨著低O2高CO2時間延長，Bcl-2 mRNA表達先升高而后下降（見圖5），而Bax mRNA表達逐漸增高（見圖6）。Bcl-2/Bax比值的變化趨勢同Bcl-2 mRNA，即隨著低O2高CO2時間的延長，先升高而后下降（見表2）。 2.4 相關(guān)性分析 將海馬神經(jīng)細胞AI與Bcl-2 mRNA、Bax mRNA及Bcl-2 mRNA/Bax mRNA的比值作相關(guān)分析表明：AI與Bax mRN

15、A之間存在顯著正相關(guān)（r=0.814，P<0.01），而與Bcl-2 mRNA/Bax mRNA比值之間存在顯著負相關(guān)（r=-0.405，P<0.01）。 3 討論 慢性低氧能夠引起腦組織結(jié)構(gòu)和功能的損害，細胞凋亡被證實在其中起著重要作用2，3。Gozal等5在研究大鼠間斷性低氧模型時發(fā)現(xiàn)，在間斷低氧14 d時，大鼠皮層和海馬區(qū)細胞凋亡達到高峰。Xu等6在Gozal實驗基礎(chǔ)上進一步研究發(fā)現(xiàn)，在間斷性低氧21 d、30 d時，細胞凋亡出現(xiàn)下降的趨勢。而本實驗顯示，海馬細胞凋亡指數(shù)隨低O2高CO2時間延長呈逐漸升高，在第4周時未見下降。據(jù)推測可能是不同的實驗條件和動物模

16、型使腦細胞凋亡出現(xiàn)不同變化趨勢。另外，本實驗與低O2同時存在的高CO2也可能是造成這種趨勢的重要因素。因為，高CO2能明顯抑制低氧誘導的腦血管密度增加，通過抑制腦血管重建而加重低氧性腦損害7，8；高CO2使大腦乳酸根濃度明顯增加及葡萄糖濃度明顯減少，使大腦發(fā)生能量代謝障礙9。 細胞凋亡是許多基因參與的程序化過程，有著非常復(fù)雜的調(diào)控機制，其中，Bcl-2基因家族是目前較為公認與凋亡密切相關(guān)的基因。Bcl-2家族包括兩類成員，一類如Bcl-2、Bcl-xl等抑制凋亡發(fā)生，另一類如Bax、Bak、Bcl-xs、Bad、Bid、Bik等促進凋亡發(fā)生，Bcl-2/Bax增大時促進細胞存活，反之則導致細胞

17、凋亡10。本實驗觀察到，隨著低O2高CO2干預(yù)時間的延長，海馬Bcl-2 mRNA表達先升高后下降。這種變化出現(xiàn)的原因，可能是由于在低O2高CO2損傷早期，首先啟動了Bcl-2基因表達以阻止細胞凋亡；而隨著低O2高CO2時間延長，其他誘導凋亡因素持續(xù)存在，細胞損傷不斷加重，最終Bcl-2的表達被抑制，細胞繼而發(fā)生凋亡。另外，隨著低O2高CO2干預(yù)時間的延長，海馬Bax mRNA表達逐漸增多，表明低O2高CO2可引起海馬Bax表達增多，進而誘導細胞凋亡，因而Bcl-2/Bax比值逐漸下降，海馬神經(jīng)細胞AI逐漸增高，兩者呈顯著負相關(guān)。本實驗提示，慢性低O2高CO2可以誘發(fā)大鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡。Bc

18、l-2/Bax比值下降可能是促進凋亡的重要因素?！緟⒖嘉墨I】 1 Mikati MA, Zeinieh MP, Kurdi RM, et al. Long-term effects of acute and of chronic hypoxia on behavior and on hippoc- ampal histology in the developing brain J. Brain Res Dev Brain Res, 2005, 157(1): 98-102.2 Benesova P, Langmeier M, Betka J, et al. Long-lasting chang

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