midkine、Ki67和CD34在子宮內(nèi)膜癌中的表達及其意義

1、midkine、Ki-67和CD34在子宮內(nèi)膜癌中的表達及其意義【摘要】 目的 探討中期因子（midkine,MK）、Ki-67、CD34在正常子宮內(nèi)膜組織、子宮內(nèi)膜上皮內(nèi)瘤變（EIN）組織、子宮內(nèi)膜癌組織中的表達及其在生物學(xué)行為方面的意義。方法 15例正常子宮內(nèi)膜組織、20例EIN組織及30例子宮內(nèi)膜癌組織標本，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法（SP法）分別檢測MK、Ki-67、CD34的表達情況，并進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果 MK、Ki-67、CD34在正常子宮內(nèi)膜、EIN和子宮內(nèi)膜癌組織中的表達逐漸升高，其在3種組織中表達之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）；MK、Ki-67和CD34的表達與子宮內(nèi)膜癌

2、的臨床分期、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤肌層浸潤程度等有關(guān)(P0.05），而與宮內(nèi)膜癌患者的年齡無關(guān)(P0.05)；MK與Ki-67在子宮內(nèi)膜癌中的表達呈正相關(guān)（r=0.781,P0.05）。結(jié)論 MK的陽性表達與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后有關(guān),可聯(lián)合Ki-67和CD34作為一組有價值的腫瘤標記和預(yù)后指標。 【關(guān)鍵詞】 子宮內(nèi)膜癌；中期因子；Ki-67；CD34 Abstract： Objective To investigate the expressions and significance of biological behavior of midkine, Ki-67 and CD3

3、4 in normal endometrial tissues, endometrial intraepithelial neoplasia (EIN) and endometrial carcinoma. Methods A total of 15 samples of normal endometrial tissue, 20 samples of endometrial intraepithelial neoplasia and 30 samples of endometrial carcinoma were examined for the expression of MK, Ki-6

4、7 and CD34 by immunohistochemical method (SP) and statistical analysis of the results. Results The positive expressions of MK, Ki-67 and CD34 in endometrial carcinoma were significantly higher than in endometrial intraepithelial neoplasia and normal endometrial tissue (P<0.05) . The expressio

5、n of MK, Ki-67 and CD34 was associated significantly with a clinical staging, grading, lymphatic metastasis and the degree of myometrial infiltration of the tumor (P<0.05), while it was not associated with age of the patients (P>0.05). The expression of MK was positively correlated wit

6、h that of Ki-67 and CD34 in endometrial carcinoma (r=0.781,P<0.05). Conclusion The positive expressions of MK are significantly correlated with the pathogenesis, progression and prognosis of endometrial carcinoma. MK in combination with Ki-67 and CD34 may serve as a set of valuable markers an

7、d prognostic indicators of endometrial carcinoma.2 / 22 Key words： endometrial carcinoma; midkine; Ki-67; CD34 分子生物學(xué)技術(shù)研究表明,腫瘤的形成和進展是一個多因素參與、多基因改變的復(fù)雜過程。目前研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移與新生血管形成有關(guān)，血管生成和腫瘤生長的關(guān)系已經(jīng)成為腫瘤研究的熱點，血管的生成是腫瘤細胞生長、侵襲和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。中期因子(midkine， MK)是新發(fā)現(xiàn)的肝素結(jié)合生長因子,可誘導(dǎo)神經(jīng)元分化、誘導(dǎo)PC12細胞分化，還具有增強大動脈內(nèi)皮細胞纖溶酶原激活物活性的作用

8、。MK在多種惡性腫瘤中有過表達,并與腫瘤的發(fā)生、演進和預(yù)后等因素有關(guān)1-3。Ki-67是一種增殖細胞核抗原，其表達能反映腫瘤的增殖活性，已成為腫瘤生物學(xué)行為的可靠指標4-5。 CD34是近年在研究腫瘤新生血管時采用的血管內(nèi)皮細胞標志物6，在血管內(nèi)皮細胞上可以結(jié)合轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-)的受體蛋白,在增殖的內(nèi)皮細胞和血管生成旺盛的腫瘤組織內(nèi)新生血管內(nèi)皮細胞中呈過表達，而在正常成熟組織的血管內(nèi)皮細胞中弱表達或不表達。CD34不與大血管內(nèi)皮細胞發(fā)生反應(yīng)，但與腫瘤組織內(nèi)的微血管反應(yīng)強烈，它的表達反映了腫瘤血管的生成，用以計數(shù)微血管密度（MVD）,在腫瘤的診斷、預(yù)后及治療等諸方面均表現(xiàn)出良好的發(fā)展前景。

9、MK與子宮內(nèi)膜癌關(guān)系的研究國內(nèi)鮮見報道。本文采用免疫組織化學(xué)方法檢測子宮內(nèi)膜腺癌(endometrial adenocarcinoma，EA)組織中MK、CD34、Ki-67的表達情況,探討其與子宮內(nèi)膜腺癌生物學(xué)行為的關(guān)系及對預(yù)后的意義。1 材料和方法1.1 材料選取徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 2007 年 9月至 2009 年 4 月正常子宮內(nèi)膜（NC）組織標本15例、子宮內(nèi)膜上皮內(nèi)瘤變（EIN）組織標本20例及子宮內(nèi)膜腺癌組織標本 30 例進行研究。同時復(fù)習(xí)所有標本來源病例的臨床資料。 子宮內(nèi)膜癌按FIGO(國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟,2000年)診斷標準進行臨床分期?；颊咂骄挲g （55.23±5

10、.45）歲(4265 歲)， 50歲的患者 10 例，50 歲的患者20例。臨床分期：期 11 例,期11例,期 8例。組織學(xué)分級：高分化10 例,中低分化20例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移8例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例。肌層浸潤程度：無或1/2肌層12例，1/2肌層18例。 取同期正常子宮內(nèi)膜組織 15 例(因陰道出血診刮病檢示增生期子宮內(nèi)膜或分泌期子宮內(nèi)膜)為對照組，患者平均年齡（53.10±4.38）歲（3555歲）。根據(jù)婦產(chǎn)科學(xué)第7版診斷標準，選擇子宮內(nèi)膜上皮內(nèi)瘤變(EIN) 20例，患者平均年齡（50.02±6.48）歲（3768 歲）。 各組患者年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。所

11、有標本均經(jīng)過病理科醫(yī)師再次閱片證實并進行病理分級，所有腫瘤病例取材前均未經(jīng)過放化療或生物學(xué)治療。1.2 試劑兔抗人 midkine單克隆抗體 (武漢博士德生物有限責任公司)，鼠抗人CD34單克隆抗體(北京中杉生物技術(shù)有限公司)，鼠抗人Ki-67單克隆抗體（北京中杉生物技術(shù)有限公司），免疫組化染色（SP法）試劑盒（北京中杉生物技術(shù)有限公司），濃縮型DAB試劑盒（北京中杉生物技術(shù)有限公司）。1.3 免疫組化方法標本組織常規(guī)石蠟包埋,4 m 連續(xù)切片6 張,SP法分別做MK、Ki-67 和CD34的免疫組化染色。已知陽性切片作陽性對照,用PBS 代替一抗作陰性對照。1.4 結(jié)果判定以腫瘤細胞胞質(zhì)或胞

12、膜出現(xiàn)清晰棕黃色染色為MK陽性細胞。每張切片在400倍鏡下選擇切片平展、細胞形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)清晰的10個視野，每個視野計數(shù)100個細胞，MK陽性細胞數(shù)10%者為陰性（-），MK陽性細胞數(shù)10%20%者為弱陽性（+），MK陽性細胞數(shù)20%者為強陽性（+）。 CD34在腫瘤組織中陽性表達均位于血管內(nèi)皮細胞的細胞質(zhì)中，呈棕黃色。 Ki-67 陽性判定：腫瘤細胞核出現(xiàn)清晰棕黃色染色顆粒即為Ki-67陽性細胞。整張切片在 400 倍鏡下選擇切片平展、細胞形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)清晰的 10 個視野，每個視野計數(shù)100個細胞，組織中Ki-67陽性細胞數(shù)10%者為陰性（-），Ki-67陽性細胞數(shù)10%20%者為弱陽性（

13、+），Ki-67陽性細胞數(shù)20%者為強陽性（+）。 MVD 計數(shù)：按 Weidner等7方法。用抗CD34 標記記錄MVD。在低倍顯微鏡(×100)下對整張組織切片找出5個血管內(nèi)皮細胞染色密集區(qū)域(熱點),然后每個區(qū)域在高倍(×400)視野下分別計數(shù)熱點內(nèi)染成棕色的血管內(nèi)皮細胞或血管內(nèi)皮細胞簇，只要它們和鄰近的微血管、腫瘤細胞或其他結(jié)締組織分開，就視為一個微血管。取 5 個區(qū)域的平均數(shù)即為 MVD。1.5 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件,采用確切概率法、方差分析、t檢驗及Pearson相關(guān)分析進行統(tǒng)計學(xué)分析。P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2 結(jié)果2.1 MK、Ki

14、-67、CD34在正常子宮內(nèi)膜、EIN、子宮內(nèi)膜癌組織中的表達見表1。表1 MK、Ki-67、 CD34在各組的表達情況（略）2.1.1 MK在正常子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜上皮內(nèi)瘤變、子宮內(nèi)膜癌組織中的表達MK在腫瘤組織中陽性表達均位于細胞膜和(或) 細胞質(zhì)中，呈黃色或棕黃色顆粒，見圖1。3種組織中MK表達率分別為0（0/15）、40.0%（8/20）、70.0%（21/30），3組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05），組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。見表1。2.1.2 Ki-67在正常子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜上皮內(nèi)瘤變、子宮內(nèi)膜癌組織中的表達見圖2。3種組織中Ki-67表達率分別為 6.7%（

15、1/15）、30.0%（6/20）、63.3%（19/30），3組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05），組間兩兩比較，子宮內(nèi)膜癌組織中Ki-67的陽性表達率顯著高于正常子宮內(nèi)膜組織（P0.05)和子宮內(nèi)膜上皮內(nèi)瘤變組織(P0.05）,而子宮內(nèi)膜上皮內(nèi)瘤變組織和正常子宮內(nèi)膜組織中的Ki-67陽性表達率無顯著性差異（P0.05）。見表1。2.1.3 CD34在正常子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜上皮內(nèi)瘤變、子宮內(nèi)膜癌組織中的表達 見圖3。3種組織中 MVD 分別為（13.33±4.11）、（25.30±2.59）、（35.20±3.78）條/HP，3組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=173.0

16、0，P0.05），組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。見表1。2.2 MK、Ki-67、CD34與子宮內(nèi)膜癌臨床病理特征的關(guān)系MK、Ki-67、CD34的表達與子宮內(nèi)膜癌的臨床分期、組織學(xué)分級、腫瘤肌層浸潤程度、淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移有關(guān)，而與子宮內(nèi)膜癌患者的年齡無關(guān)。見表2。表2 MK的表達與子宮內(nèi)膜癌臨床病理特征的關(guān)系（略）2.3 MK與CD34、Ki-67在子宮內(nèi)膜癌中表達的相互關(guān)系2.3.1 MK與CD34在子宮內(nèi)膜癌中表達的關(guān)系MK陽性表達患者的MVD顯著大于MK陰性表達患者(P0.05)。表明伴隨 MK 的表達,MVD 值明顯增加,腫瘤新生血管明顯增多。見表3。表3 MK與CD3

17、4在子宮內(nèi)膜癌中表達的關(guān)系（略）2.3.2 MK與Ki-67在子宮內(nèi)膜癌中表達的相關(guān)性 MK與Ki-67在子宮內(nèi)膜癌中的表達呈正相關(guān)(r=0.781,P0.05)。見表4。表4 MK與Ki-67在子宮內(nèi)膜癌中的表達的相關(guān)性（略）3 討論 子宮內(nèi)膜癌是女性生殖道常見惡性腫瘤之一，占女性生殖道惡性腫瘤的2030。近年來，伴隨著女性的高齡化，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率呈上升趨勢，而且發(fā)病年齡趨年輕化。許多專家提出腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴腫瘤組織的微血管形成。因此，血管生成和腫瘤生長的關(guān)系即成為腫瘤研究的熱點，并為進一步指導(dǎo)臨床治療及判斷預(yù)后提供了新的思路。 MK是一個新的肝素結(jié)合性生長因子,成人的正常組織有MK

18、的少量表達,大部分癌包括食管癌、胃癌、膀胱癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、肺癌和Wilms瘤等均以組織非依賴方式高水平表達MK8-9 。殷正豐等10的實驗結(jié)果也顯示，在肝癌中MK不僅表達在肝癌細胞,在肝癌細胞外間質(zhì)中的血管內(nèi)彈力膜層及內(nèi)皮細胞也有表達,尤以密集的血管處明顯。腫瘤的血管內(nèi)皮細胞增殖較正常組織高202 000倍,它形成的新生血管是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。腫瘤細胞通過新生的血管組織獲得必要的養(yǎng)分,帶走大量的代謝產(chǎn)物,同時腫瘤誘生的血管基底膜薄而易斷裂,癌細胞易侵入血管,經(jīng)由血液途徑發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移。本實驗顯示,MK在正常子宮內(nèi)膜組織、子宮內(nèi)膜上皮內(nèi)瘤變組織、子宮內(nèi)膜癌組織中的表達逐漸升高,差

19、異有統(tǒng)計學(xué)意義。且MK的表達與子宮內(nèi)膜癌組織學(xué)分級、臨床分期、淋巴轉(zhuǎn)移、肌層浸潤程度相關(guān), 提示MK不僅可望成為子宮內(nèi)膜癌早期診斷的標志物, 并可作為治療及判斷預(yù)后的一個指標。 CD34作為跨膜單鏈糖蛋白,相對分子質(zhì)量為（105120）×103,定位于1號染色體長臂,主要表達在造血前體細胞和血管內(nèi)皮細胞上,又稱為人原始造血細胞抗原(human hepatopoietic proenitorcell antigen),與血管生成密切相關(guān),是內(nèi)皮細胞特異的標記物,特別對腫瘤內(nèi)毛細血管、小血管內(nèi)皮細胞表達的穩(wěn)定性和敏感性較強,該抗體特異地標記腫瘤血管而對淋巴細胞和基質(zhì)細胞不存在交叉性反應(yīng)1

20、1。 CD34在增殖的內(nèi)皮細胞和血管生成旺盛的腫瘤組織內(nèi)新生血管內(nèi)皮細胞中呈過表達,而在正常成熟組織的血管內(nèi)皮細胞中弱表達或不表達12。這為免疫組化研究提供了依據(jù)。本實驗檢測CD34的表達作為腫瘤組織血管生成的指標，子宮內(nèi)膜癌組織和子宮內(nèi)膜上皮內(nèi)瘤變組織、正常子宮內(nèi)膜組織的MVD有顯著差異;并且隨著子宮內(nèi)膜癌的臨床分期、組織學(xué)分級的增加，以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)和肌層浸潤程度的增強, MVD值明顯增加。結(jié)果提示子宮內(nèi)膜癌的生長、發(fā)展和轉(zhuǎn)移有賴于血管生成。 大量研究已證實細胞過度增殖是許多腫瘤發(fā)生與發(fā)展的基礎(chǔ)。Ki-67又稱為細胞核增殖抗原, 是一種DNA結(jié)合蛋白, 定位于細胞核。它存在于增殖細胞中

21、, 參與驅(qū)動細胞周期的調(diào)控網(wǎng)絡(luò), 除G1期、G1早期外,其他各期均有表達,M期達到高峰。因其半衰期短, 細胞脫離增殖周期后迅速降解, 因此被視為較全面反映細胞群體增殖活性的指標13。有研究表明,它與很多惡性腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后具有相關(guān)性14。本實驗檢測Ki-67表達作為增殖活性指標,子宮內(nèi)膜癌組織與正常子宮內(nèi)膜組織、子宮內(nèi)膜上皮內(nèi)瘤變的陽性表達率有顯著差異,說明子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生與細胞增殖有關(guān),考慮Ki-67可作為鑒別腫瘤良、惡性的輔助指標。而正常子宮內(nèi)膜組織與子宮內(nèi)膜上皮內(nèi)瘤變組織相比無統(tǒng)計學(xué)差異，可能還需要增加樣本量以進一步研究。同時實驗結(jié)果還顯示,隨著子宮內(nèi)膜癌的臨床病理分期的增加、腫瘤

22、細胞分級的增高、肌層浸潤程度的加深和淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移, Ki-67陽性表達率呈上升趨勢。因此認為Ki-67與腫瘤惡性程度呈正相關(guān),可以作為評價子宮內(nèi)膜癌增殖分化狀態(tài)、判斷腫瘤侵襲力的重要標志。 MK、CD34和Ki-67可能共同參與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、生長和轉(zhuǎn)移。我們還發(fā)現(xiàn)MK與代表腫瘤組織新生血管的CD34所標記的MVD值有關(guān),同時MK在腫瘤組織的新生血管內(nèi)皮細胞基質(zhì)細胞也有表達,因此推測,MK可能具有刺激內(nèi)皮細胞增殖、促進腫瘤血管生成的作用。實驗結(jié)果還提示，MK與Ki-67在子宮內(nèi)膜癌的表達有一定相關(guān)性,兩者可能是互相促進作用,協(xié)同致子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生。 MK是一個分泌性肝素結(jié)合蛋白,當組織中MK生

23、成達一定量時,循環(huán)系統(tǒng)中MK水平開始升高。有研究結(jié)果顯示在超過60%的成人癌組織中可檢測到MK水平升高,去除了腫瘤后血清MK水平即下降。同時,MK、CD34和Ki-67這三者在子宮內(nèi)膜癌的高水平表達及它們之間的相關(guān)性提示,在臨床上我們可單獨測定MK或聯(lián)合測定CD34和Ki-67作為子宮內(nèi)膜癌的診斷依據(jù),以提高確診率,并預(yù)測預(yù)后?！緟⒖嘉墨I】 1Ikematsu S, Yano A, Aridome K, et al. Serum midkine levels are increased in patients with various types of carcinomas J. Br J C

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