免疫共沉淀原理及實(shí)驗(yàn)方法

1、數(shù)據(jù)加載中.注冊(cè)登錄發(fā)表文章 ·     免疫共沉淀原理及實(shí)驗(yàn)方法     2007-03-22 16:07:46 大 中 小 免疫共沉淀一 原理：IP是利用抗原蛋白質(zhì)和抗體的特異性結(jié)合以及細(xì)菌蛋白質(zhì)的“prorein A"特異性地結(jié)合到免疫球蛋白的FC片段的現(xiàn)象活用開(kāi)發(fā)出來(lái)的方法。目前多用精制的prorein A預(yù)先結(jié)合固化在argarose的beads上，使之與含有抗原的溶液及抗體反應(yīng)后，beads上的prorein A就能吸附抗原達(dá)到精制的目的。實(shí)驗(yàn)最需要注意點(diǎn)就是抗體的性質(zhì)?？贵w不同和抗原結(jié)合能力也不同，免染能結(jié)合未必能用在I

2、P反應(yīng)。建議仔細(xì)檢查抗體的說(shuō)明書(shū)。特別是多抗的特異性是問(wèn)題。其次，要注意溶解抗原的緩沖液的性質(zhì)。多數(shù)的抗原是細(xì)胞構(gòu)成的蛋白，特別是骨架蛋白，緩沖液必須要使其溶解。為此，必須使用含有強(qiáng)界面活性劑的緩沖液，盡管它有可能影響一部分抗原抗體的結(jié)合。另一面，如用弱界面活性劑溶解細(xì)胞，就不能充分溶解細(xì)胞蛋白。即便溶解也產(chǎn)生與其它的蛋白結(jié)合的結(jié)果，抗原決定族被封閉，影響與抗體的結(jié)合，即使IP成功，也是很多蛋白與抗體共沉的悲慘結(jié)果。再次，為防止蛋白的分解，修飾，溶解抗原的緩沖液必須加蛋白每抑制劑，低溫下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。每次實(shí)驗(yàn)之前，首先考慮抗體/緩沖液的比例?？贵w過(guò)少就不能檢出抗原，過(guò)多則就不能沉降在beads上，

3、殘存在上清。緩沖劑太少則不能溶解抗原，過(guò)多則抗原被稀釋。欲速則不達(dá)，確定好比例很必要。(待續(xù))二 準(zhǔn)備：器械#微量高速冷凍離心機(jī)#移液槍#旋轉(zhuǎn)盤(pán)#電泳設(shè)備#vortex震蕩器#液氮及組織粉碎器#eppentube試劑#細(xì)胞或組織#蛋白定量kit#SDS電泳試劑#抗體(單抗時(shí)選擇protein G,二抗選擇抗鼠Ig兔血清)#PBS#NaN3#proteinA sapharose試劑配制抗原蛋白溶解緩沖液1.RIPA緩沖液 (最終濃度)1MTris-HCL(PH7.4) 5ml (10mM)5MNacl 15ml (150mM)0.5M EDTA(PH7.4) 5ml (5mM)20%Triton

4、X-100 25ml (1%)10% DOC 50ml (1%)10%SDS 5ml ( o.1%)TLCK 18.5mg (0.1mM)TPCK 35mg (0.2mM)DDW 395mltoal 500ml另外，使用之前加1mMPMSF(PMSF溶在酒精，濃度100mM，-20度遮光保存。注意不易溶于水)2.NP40 lysis 緩沖液1MTris-HCL(PH7.4) 5ml (10mM)5MNacl 15ml (150mM)0.5M EDTA(PH7.4) 5ml (5mM)20%NP40 25ml (1%)TLCK 18.5mg (0.1mM)TPCK 35mg (0.2mM)DDW

5、 450mltoal 500ml使用前加1mM的PMSF注意點(diǎn)：*Tris緩沖劑PH隨溫度變化，高濃度鹽酸滴定時(shí)發(fā)熱，冷卻后PH增高。*反復(fù)使用PMSF要注意保管方法。*1和2的緩沖劑的區(qū)別在于界面活性劑。TritonX-100,NP40是非離子界面活性劑，作用溫和，DOC<SDS是離子性的強(qiáng)活性劑。注意忘記加TritonX-100，只加DOC，SDS，可能使抗體完全失去活性。1的蛋白變性效果強(qiáng)，可能損害抗原/抗體結(jié)合，2的作用溫和，卻可能造成抗原溶解不全。*兩方都有EDTA，對(duì)抗原而言，二價(jià)離子Mg,Ca等是必要的。根據(jù)自己需要調(diào)節(jié)。EDTA用NaOH滴定。Protocol1 調(diào)制pr

6、otein A sapharoseprotein A sapharose 5ml 溶于20ml含0.02%NaN3的PBS離心2000轉(zhuǎn)2分，去上清，在沉淀加0.02%NaN3的PBS，離心后去上清，重復(fù)2次，最后沉淀加20ml含0.02%NaN3的PBS，冷藏保存用單抗做一抗時(shí)，把protein A sapharose先用抗鼠Ig兔血清處理(每50ulprotein A sapharose用1-5ul血清)。旋轉(zhuǎn)1-2h,混勻后，再離心1-2s去上清后，加PBS，vortex混合，離心去上清，重復(fù)二次加含0.02%NaN3的PBS到原來(lái)體積，冷存。避免長(zhǎng)期保存。2抗原的檢出以下操作全在冰面或

7、4度進(jìn)行去除細(xì)胞培養(yǎng)液，用冷PBS洗一次。加RIPA，溶解后，轉(zhuǎn)移到eppentube中用vortex混勻。RIPA的量：6cm的培養(yǎng)皿加1 ml(蛋白質(zhì)的量為500mg/ml),組織塊用液氮粉碎，在緩沖劑中搗勻，蛋白定量。30m，15000rpm離心，上清轉(zhuǎn)移到新tube 。不用移液槍，直接從tube倒進(jìn)另一個(gè)tube往上清加抗體，1ml加2-5ul抗體，冷室內(nèi)旋轉(zhuǎn)混勻1h加protein A sapharose50ul，再混勻1h5000rpm離心1s,使sapharose沉淀，去上清。往sapharose加RIPA，vortex 混勻，離心，去上清。重復(fù)4次洗凈。加電泳用 sample

8、緩沖液40ul,2m煮沸，泳動(dòng)后，固定/干燥膠，現(xiàn)像。3.注意點(diǎn)A：不熟練使用移液槍，會(huì)混入沉淀的不溶性蛋白，使實(shí)驗(yàn)失敗。對(duì)無(wú)論怎么也除不去的混入蛋白，只使用上清的上半部，或用超速離心機(jī)。B：對(duì)電泳的非特異條帶，最后可依次用含300mM，1omMNaCl的RIPA洗凈各一次。(完)文章引用自： 評(píng)論() 引用 閱讀(876) 圈子 編輯 打印 有獎(jiǎng)舉報(bào) 免疫共沉淀原理及實(shí)驗(yàn)方法 SPAN class=java id=text9766免疫共沉淀BR一 原理：BRIP是利用抗原蛋白質(zhì)和抗體的特異性結(jié)合以及細(xì)菌蛋白質(zhì)的“prorein A"特異性地結(jié)合到免疫球蛋白的FC片段的現(xiàn)象活用開(kāi)發(fā)出

9、來(lái)的方法。目前多用精制的prorein A預(yù)先結(jié)合固化在argarose的beads上，使之與含有抗原的溶液及抗體反應(yīng)后，beads上的prorein A就能吸附抗原達(dá)到精制的目的。BRBR實(shí)驗(yàn)最需要注意點(diǎn)就是抗體的性質(zhì)?？贵w不同和抗原結(jié)合能力也不同，免染能結(jié)合未必能用在IP反應(yīng)。建議仔細(xì)檢查抗體的說(shuō)明書(shū)。特別是多抗的特異性是問(wèn)題。BRBR其次，要注意溶解抗原的緩沖液的性質(zhì)。多數(shù)的抗原是細(xì)胞構(gòu)成的蛋白，特別是骨架蛋白，緩沖液必須要使其溶解。為此，必須使用含有強(qiáng)界面活性劑的緩沖液，盡管它有可能影響一部分抗原抗體的結(jié)合。另一面，如用弱界面活性劑溶解細(xì)胞，就不能充分溶解細(xì)胞蛋白。即便溶解也產(chǎn)生與其它

10、的蛋白結(jié)合的結(jié)果，抗原決定族被封閉，影響與抗體的結(jié)合，即使IP成功，也是很多蛋白與抗體共沉的悲慘結(jié)果。BRBR再次，為防止蛋白的分解，修飾，溶解抗原的緩沖液必須加蛋白每抑制劑，低溫下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。BRBR每次實(shí)驗(yàn)之前，首先考慮抗體/緩沖液的比例?？贵w過(guò)少就不能檢出抗原，過(guò)多則就不能沉降在beads上，殘存在上清。緩沖劑太少則不能溶解抗原，過(guò)多則抗原被稀釋。欲速則不達(dá)，確定好比例很必要。(待續(xù))BR二 準(zhǔn)備：BR器械BR#微量高速冷凍離心機(jī)BR#移液槍BR#旋轉(zhuǎn)盤(pán)BR#電泳設(shè)備BR#vortex震蕩器BR#液氮及組織粉碎器BR#eppentubeBR試劑BR#細(xì)胞或組織BR#蛋白定量kitBR#SD

11、S電泳試劑BR#抗體(單抗時(shí)選擇protein G,二抗選擇抗鼠Ig兔血清)BR#PBSBR#NaN3BR#proteinA sapharoseBR試劑配制BR抗原蛋白溶解緩沖液BR1.RIPA緩沖液 (最終濃度)BR1MTris-HCL(PH7.4) 5ml (10mM)BR5MNacl 15ml (150mM)BR0.5M EDTA(PH7.4) 5ml (5mM)BR20%TritonX-100 25ml (1%)BR10% DOC 50ml (1%)BR10%SDS 5ml ( o.1%)BRTLCK 18.5mg (0.1mM)BRTPCK 35mg (0.2mM)BRDDW 395

12、mlBRtoal 500mlBR另外，使用之前加1mMPMSF(PMSF溶在酒精，濃度100mM，-20度遮光保存。注意不易溶于水)BR2.NP40 lysis 緩沖液BR1MTris-HCL(PH7.4) 5ml (10mM)BR5MNacl 15ml (150mM)BR0.5M EDTA(PH7.4) 5ml (5mM)BR20%NP40 25ml (1%)BRTLCK 18.5mg (0.1mM)BRTPCK 35mg (0.2mM)BRDDW 450mlBRtoal 500mlBR使用前加1mM的PMSFBR注意點(diǎn)：BR*Tris緩沖劑PH隨溫度變化，高濃度鹽酸滴定時(shí)發(fā)熱，冷卻后PH增

13、高。BR*反復(fù)使用PMSF要注意保管方法。BR*1和2的緩沖劑的區(qū)別在于界面活性劑。TritonX-100,NP40是非離子界面活性劑，作用溫和，DOClt;SDS是離子性的強(qiáng)活性劑。注意忘記加TritonX-100，只加DOC，SDS，可能使抗體完全失去活性。1的蛋白變性效果強(qiáng)，可能損害抗原/抗體結(jié)合，2的作用溫和，卻可能造成抗原溶解不全。BR*兩方都有EDTA，對(duì)抗原而言，二價(jià)離子Mg,Ca等是必要的。根據(jù)自己需要調(diào)節(jié)。EDTA用NaOH滴定。BRProtocolBRBR1 調(diào)制protein A sapharoseBRBRprotein A sapharose 5ml 溶于20ml含0.

14、02%NaN3的PBSBRBR離心2000轉(zhuǎn)2分，去上清，在沉淀加0.02%NaN3的PBS，離心后去上清，重復(fù)2次，最后沉淀加20ml含0.02%NaN3的PBS，冷藏保存BRBR用單抗做一抗時(shí)，把protein A sapharose先用抗鼠Ig兔血清處理(每50ulprotein A sapharose用1-5ul血清)。旋轉(zhuǎn)1-2h,混勻后，再離心1-2sBRBR去上清后，加PBS，vortex混合，離心去上清，重復(fù)二次BRBR加含0.02%NaN3的PBS到原來(lái)體積，冷存。避免長(zhǎng)期保存。BRBR2抗原的檢出BR以下操作全在冰面或4度進(jìn)行BRBR去除細(xì)胞培養(yǎng)液，用冷PBS洗一次。加RI

15、PA，溶解后，轉(zhuǎn)移到eppentube中用vortex混勻。RIPA的量：6cm的培養(yǎng)皿加1 ml(蛋白質(zhì)的量為500mg/ml),組織塊用液氮粉碎，在緩沖劑中搗勻，蛋白定量。BRBR30m，15000rpm離心，上清轉(zhuǎn)移到新tube 。不用移液槍，直接從tube倒進(jìn)另一個(gè)tubeBRBR往上清加抗體，1ml加2-5ul抗體，冷室內(nèi)旋轉(zhuǎn)混勻1hBRBR加protein A sapharose50ul，再混勻1hBRBR5000rpm離心1s,使sapharose沉淀，去上清。往sapharose加RIPA，vortex 混勻，離心，去上清。重復(fù)4次洗凈。BRBR加電泳用 sample 緩沖液4

16、0ul,2m煮沸，泳動(dòng)后，固定/干燥膠，現(xiàn)像。BRBR3.注意點(diǎn)BRA：不熟練使用移液槍，會(huì)混入沉淀的不溶性蛋白，使實(shí)驗(yàn)失敗。對(duì)無(wú)論怎么也除不去的混入蛋白，只使用上清的上半部，或用超速離心機(jī)。BRB：對(duì)電泳的非特異條帶，最后可依次用含300mM，1omMNaCl的RIPA洗凈各一次。(完) /SPANBR  查看文章 4. 免疫共沉淀技術(shù)路線(CoIP)2007-05-07 09:14準(zhǔn)備工作：  預(yù)冷PBS，RIPA Buffer，細(xì)胞刮子（用保鮮膜包好后，埋冰下），離心機(jī)  1. 用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，最后一次吸干PBS；&

17、#160; 2. 加入預(yù)冷的RIPA Buffer(1ml/107個(gè)細(xì)胞、10cm培養(yǎng)皿或150cm2培養(yǎng)瓶，0.5ml/5×106個(gè)細(xì)胞、6cm培養(yǎng)皿、75cm2培養(yǎng)瓶)  3. 用預(yù)冷的細(xì)胞刮子將細(xì)胞從培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶上刮下，把懸液轉(zhuǎn)到1.5EP管中，4，緩慢晃動(dòng)15min（EP管插冰上，置水平搖床上）  4. 4，14000g離心15min，立即將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中  5. 準(zhǔn)備Protein A agarose，用PBS 洗兩遍珠子，然后用PBS配制成50%濃度，建議減掉槍尖部分，避免在涉及瓊脂糖珠的

18、操作中破壞瓊脂糖珠  6. 每1ml總蛋白中加入100l Protein A瓊脂糖珠（50%），4搖晃10min（EP管插冰上，置水平搖床上），以去除非特異性雜蛋白，降低背景  7. 4，14000g離心15min，將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，去除Protein A珠子  8. (Bradford 法)做蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定蛋白濃度，測(cè)前將總蛋白至少稀釋1：10倍以上，以減少細(xì)胞裂解液中去垢劑的影響（定量，分裝后，可以在-20保存一個(gè)月）  9. 用PBS將總蛋白稀釋到約1 g/l，以降低裂解液中去垢劑的濃度，如果

19、興趣蛋白在細(xì)胞中含量較低，則總蛋白濃度應(yīng)該稍高（如10 g/l）  10. 加入一定體積的兔抗到500l總蛋白中，抗體的稀釋比例因興趣蛋白在不同細(xì)胞系中的多少而異  11. 4緩慢搖動(dòng)抗原抗體混合物過(guò)夜或室溫2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建議用2 h室溫孵育  12. 加入100l Protein A瓊脂糖珠來(lái)捕捉抗原抗體復(fù)合物，4緩慢搖動(dòng)抗原抗體混合物過(guò)夜或室溫1h，如果所用抗體為鼠抗或雞抗，建議加2 l“過(guò)渡抗體”（兔抗鼠IgG，兔抗雞IgG）  13. 14000rpm瞬時(shí)離心5s，收集瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物

20、，去上清，用預(yù)冷的RIPA buffer洗3遍，800l/遍，RIPA buffer有時(shí)候會(huì)破壞瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物內(nèi)部的結(jié)合，可以使用PBS  14. 用60l 2×上樣緩沖液將瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物懸起，輕輕混勻，緩沖液的量依據(jù)上樣多少的需要而定（60 l足夠上三道）  15. 將上樣樣品煮5min，以游離抗原，抗體，珠子，離心，將上清電泳，收集剩余瓊脂糖珠，上清也可以暫時(shí)凍-20，留待以后電泳，電泳前應(yīng)再次煮5min變性。  RIPA Buffer配制：  基礎(chǔ)成分：  T

21、ris-HCl（緩沖液成分，防止蛋白變性）  NaCl（鹽份，防止非特異蛋白聚集）  NP-40（非離子去污劑，提取蛋白；用H2O配制成10%儲(chǔ)存液）  去氧膽酸鈉（離子去污劑，提取蛋白；用H2O配制成10%儲(chǔ)存液；避光保存）  注意：準(zhǔn)備激酶（致活酶）實(shí)驗(yàn)時(shí)，不要加去氧膽酸鈉，因?yàn)殡x子型去污劑能夠使酶變性，導(dǎo)致活性喪失。  RIPA蛋白酶抑制劑  苯甲基磺酰氟（PMSF）（用異丙醇配制成200mM的儲(chǔ)存液，室溫保存）  EDTA（鈣螯合劑；用H2O配制成

22、100mM的儲(chǔ)存液，PH 7.4）  亮抑酶肽（Leupeptin）（用H2O配制成1mg/ml的儲(chǔ)存液，分裝，-20保存）  抑蛋白酶肽（Aprotinin）（用H2O配制成1mg/ml的儲(chǔ)存液，分裝，-20保存）  胃蛋白酶抑制劑（Pepstatin）（用甲醇配制成1mg/ml的儲(chǔ)存液，分裝，-20保存） RIPA磷酸（酯）酶抑制劑  激活的Na3VO4（用H2O配制成200mM的儲(chǔ)存液，見(jiàn)Sodium Orthovanadate Activation Protoco）  NaF（200mM

23、的儲(chǔ)存液，室溫保存）  注意：在準(zhǔn)備做磷酸（酯）酶實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，不加磷酸酯酶抑制劑  工作液配制：  配制100ml的modified RIPA buffe：  1. 稱取790mg 的Tris-Base，加到75ml 去離子水中，加入900mg的NaCl，攪拌，直到全部溶解，用HCl調(diào)節(jié)PH值到7.4  2. 加10 ml 10%的NP-40  3. 加2.5 ml 10%的去氧膽酸鈉，攪拌，直到溶液澄清  4. 加1 ml 100mM的EDTA，用量筒定容到100ml，2-8保存  5. 理論上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制劑應(yīng)該在使用當(dāng)天同時(shí)加入（抑蛋白酶肽，亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制劑各100 µl; PMSF, Na3VO4, NaF各500 µl），但是PMSF在水溶液中很不穩(wěn)定，30分鐘就會(huì)降解一半，所以PMSF應(yīng)該在使用前現(xiàn)加，其他抑制劑成分可以在水溶液中穩(wěn)定5