噬菌體及其研究進展

1、噬菌體及其應用Contents噬菌體簡介1噬菌體應用技術簡介2噬菌體在食品產業(yè)中的應用3前景及展望41、噬菌體簡介v 概念：噬菌體是感染細菌、噬菌體是感染細菌、真菌、螺旋體、支原體、真菌、螺旋體、支原體、立克次體及放線菌等微生立克次體及放線菌等微生物的病毒物的病毒, ,屬非細胞微生屬非細胞微生物。物。v 特性： 個體微小，需用電鏡觀察，個體微小，需用電鏡觀察， 可以通過細菌濾器；可以通過細菌濾器； 沒有完整的細胞結構，由沒有完整的細胞結構，由核酸和蛋白質組成；核酸和蛋白質組成； 專性活細胞內寄生專性活細胞內寄生, ,具有具有嚴格的寄生特異性。嚴格的寄生特異性。形態(tài)與結構v 形態(tài)：蝌蚪形，微球形

2、，細桿形蝌蚪形，微球形，細桿形v 噬菌體顆粒在結構上有很噬菌體顆粒在結構上有很大差別，一般可分成三種大差別，一般可分成三種類型，即類型，即 ，和和，迄今已知的噬菌，迄今已知的噬菌體大多數(shù)是有尾部結構的體大多數(shù)是有尾部結構的二十面體。二十面體。 頭部頭部尾部尾部v 核酸：DNADNA或或RNA,RNA,基因組大小為基因組大小為2-200kb2-200kb，某些噬菌體基因，某些噬菌體基因組中還含有異常堿基。組中還含有異常堿基。 大多數(shù)為線狀雙鏈 DNA噬菌體 少數(shù)為環(huán)狀單鏈 多數(shù)為線狀單鏈 RNA噬菌體 少數(shù)為線狀雙鏈化學組成v 核酸：DNADNA或或RNA,RNA,基因組大小為基因組大小為2-2

3、00kb2-200kb，某些噬菌體基因，某些噬菌體基因組中還含有異常堿基。組中還含有異常堿基。 大多數(shù)為線狀雙鏈 DNA噬菌體 少數(shù)為環(huán)狀單鏈 多數(shù)為線狀單鏈 RNA噬菌體 少數(shù)為線狀雙鏈v 按與宿主的相互關系，噬菌體可以分為兩種類型：按與宿主的相互關系，噬菌體可以分為兩種類型： 烈性噬菌體 能在宿主菌內復制增殖，產生許多子代噬菌能在宿主菌內復制增殖，產生許多子代噬菌體，并最終裂解細菌。體，并最終裂解細菌。 溫和噬菌體（溶原性噬菌體）：噬菌體基因組整合于宿主噬菌體基因組整合于宿主菌染色體中，不產生子代噬菌體，也不引起細菌裂解，但菌染色體中，不產生子代噬菌體，也不引起細菌裂解，但噬菌體噬菌體DN

4、ADNA隨細菌基因組的復制而復制，并隨細菌的分裂隨細菌基因組的復制而復制，并隨細菌的分裂而分配至子代細菌的基因組中。而分配至子代細菌的基因組中。生物合成裝配釋放烈性噬菌體的溶菌周期烈性噬菌體的溶菌周期2、噬菌體的應用技術應用鑒定細菌分型測定輻射劑量檢測基因產物的活性篩選目的基因 檢測病原菌預防和治療傳染性疾病3、噬菌體在食品產業(yè)中的應用v 食源性疾病病原的檢測技術v 作為食品添加劑v 噬菌體展示技術檢測真菌毒素3.1食源性疾病病原的檢測技術食源性疾病病原的檢測技術是食源性疾病的預防與控制的關食源性疾病病原的檢測技術是食源性疾病的預防與控制的關健的技術環(huán)節(jié)。數(shù)據(jù)顯示，每年大約有健的技術環(huán)節(jié)。數(shù)據(jù)

5、顯示，每年大約有7600 7600 萬人因食用了萬人因食用了受污染的食物而患病，其中受污染的食物而患病，其中91% 91% 是由于細菌污染造成。是由于細菌污染造成?，F(xiàn)存的檢測方法包括傳統(tǒng)的細菌分離培養(yǎng)法、多聚酶鏈式反現(xiàn)存的檢測方法包括傳統(tǒng)的細菌分離培養(yǎng)法、多聚酶鏈式反應應(PCR)(PCR)法、生物芯片技術和免疫學方法等。法、生物芯片技術和免疫學方法等。缺點缺點：費時費力、價格昂貴、特異性或靈敏度低、國內試劑：費時費力、價格昂貴、特異性或靈敏度低、國內試劑供應不配套等，很難適應公共衛(wèi)生事件應急處理快速反應的供應不配套等，很難適應公共衛(wèi)生事件應急處理快速反應的需要。需要。有必要尋找一種簡捷、快速

6、、靈敏度高的檢測食源性病原微有必要尋找一種簡捷、快速、靈敏度高的檢測食源性病原微生物的方法以及技術平臺。生物的方法以及技術平臺。報告基因檢測報告基因檢測熒光染料標記染料標記噬菌斑檢測檢測3.1.1噬菌斑檢測v 原理：用噬菌體截獲某種：用噬菌體截獲某種病原菌，隨后病原菌被噬病原菌，隨后病原菌被噬菌體感染，用殺毒劑將胞菌體感染，用殺毒劑將胞外的剩余噬菌體殺死，然外的剩余噬菌體殺死，然后將噬菌體與被感染細胞后將噬菌體與被感染細胞混合并在裝有軟瓊脂的雙混合并在裝有軟瓊脂的雙層培養(yǎng)基上培養(yǎng)，被感染層培養(yǎng)基上培養(yǎng)，被感染的細胞破裂釋放出子代噬的細胞破裂釋放出子代噬菌休，在培養(yǎng)基中就會形菌休，在培養(yǎng)基中就會

7、形成空斑。成空斑。實驗方法v 標本采集后置于標本采集后置于SC SC 增菌管中增菌管中37 37 增菌增菌18 h18 h左右左右, SS , SS 平平板分離培養(yǎng)板分離培養(yǎng)37 37 過夜過夜, , 然后挑出具有然后挑出具有沙門氏菌沙門氏菌特征的單特征的單個菌落劃線接種于普通瓊脂平皿上個菌落劃線接種于普通瓊脂平皿上, , 每塊平板劃格后可接每塊平板劃格后可接種種8 8 個菌落左右。個菌落左右。v 在每格中央用滅菌的毛細滴管滴上在每格中央用滅菌的毛細滴管滴上O-IO-I噬菌體噬菌體, , 待溶液干待溶液干后置后置37 6-8 h 37 6-8 h 培養(yǎng)或過夜培養(yǎng)或過夜, , 觀察噬菌體裂解情況

8、。觀察噬菌體裂解情況。v 發(fā)現(xiàn)被發(fā)現(xiàn)被O-I O-I 噬菌體裂解的菌株噬菌體裂解的菌株, , 馬上挑取噬斑周圍菌苔直馬上挑取噬斑周圍菌苔直接做沙門氏菌接做沙門氏菌A- F A- F 多價血清凝集試驗多價血清凝集試驗, , 凝集陽性者即可凝集陽性者即可初步報告結果初步報告結果, , 然后轉種克氏雙糖鐵管作進一步鑒定分型。然后轉種克氏雙糖鐵管作進一步鑒定分型。簡例v O-IO-I噬菌體是作用于沙門氏菌屬特異性噬菌體噬菌體是作用于沙門氏菌屬特異性噬菌體, ,染色體為雙染色體為雙鏈鏈DNA,DNA,受體是宿主細胞壁上核心多糖的乙酰氨基葡萄糖。受體是宿主細胞壁上核心多糖的乙酰氨基葡萄糖。應用應用O-IO

9、-I噬菌體進行飲食行業(yè)及公共場所從業(yè)人員帶菌調噬菌體進行飲食行業(yè)及公共場所從業(yè)人員帶菌調查結果表明查結果表明, , 沙門氏菌檢出率為沙門氏菌檢出率為0. 131%, 0. 131%, 與廣東省報道與廣東省報道的的0. 134%0. 134%檢出率相近檢出率相近, , 說明說明O- I O- I 噬菌體應用對沙門氏菌噬菌體應用對沙門氏菌的診斷具有較高的特異性和敏感性的診斷具有較高的特異性和敏感性, , 不失為大量從業(yè)人員不失為大量從業(yè)人員沙門氏菌調查的較為理想快速診斷方法。沙門氏菌調查的較為理想快速診斷方法。3.1.2熒光染料標記法v 原理：選用一種合適的染色劑，噬菌體的核酸染色標記，選用一種合

10、適的染色劑，噬菌體的核酸染色標記，然后用標記過的噬菌體侵染相應的宿主菌，噬菌體吸附在然后用標記過的噬菌體侵染相應的宿主菌，噬菌體吸附在宿主菌表面后，隨即將標記過的核酸注入宿主細胞，隨著宿主菌表面后，隨即將標記過的核酸注入宿主細胞，隨著越來越多的噬菌體核酸的注入，細胞內熒光隨著熒光素的越來越多的噬菌體核酸的注入，細胞內熒光隨著熒光素的增多而增強，借助熒光顯微鏡便能判定宿主菌的存在，從增多而增強，借助熒光顯微鏡便能判定宿主菌的存在，從而實現(xiàn)病原菌的檢測。而實現(xiàn)病原菌的檢測。簡介A圖只有細菌,熒光視野里不見任何發(fā)光物質;B圖中只有熒光標記O-I噬菌體,視野下偶爾可見少量圓點狀的熒光物質,不見菌形;C

11、圖是熒光標記O-I噬菌體和沙門氏菌混合,可見大量桿狀物,少量點狀物,極少數(shù)彗星狀桿狀物,將桿狀物質與沙門氏菌的革蘭氏染色形態(tài)進行比較,兩者一致。由此可推知,C圖中桿形物是侵有熒光噬菌體的沙門氏菌,點狀物是標記的O-I噬菌體,結合B圖可知彗星狀桿形物是即將裂解的宿主菌。簡例v 蔣魯巖等用此方法快速檢測食品源沙門氏菌，檢測靈敏度蔣魯巖等用此方法快速檢測食品源沙門氏菌，檢測靈敏度達達10 CFU/100L;12010 CFU/100L;120份食品樣品中沙門氏菌的份食品樣品中沙門氏菌的O-IO-I噬菌體噬菌體檢測與生化鑒定結果的陽性率分別為檢測與生化鑒定結果的陽性率分別為9.17%9.17%和和10

12、%,10%,符合率符合率為為91.7%91.7%。表明用熒光標記的。表明用熒光標記的O-IO-I噬菌體可以快速、直觀、噬菌體可以快速、直觀、準確、大量地檢測食品中沙門氏菌。準確、大量地檢測食品中沙門氏菌。3.1.3報告基因檢測技術v 該技術中，將一個報告基因通過噬菌體插入到目標菌體的該技術中，將一個報告基因通過噬菌體插入到目標菌體的D N A D N A 中，隨著報告基因的表達，目標菌體便可快速得到中，隨著報告基因的表達，目標菌體便可快速得到檢測。檢測。v 應用在這一技術的報告系統(tǒng)主要有原核生物和真核生物的應用在這一技術的報告系統(tǒng)主要有原核生物和真核生物的熒光素酶熒光素酶(lux,luc)(l

13、ux,luc)基因，細菌冰核蛋白基因，細菌冰核蛋白(inaW)(inaW)基因，基因，E.coli-E.coli- 半乳糖苷酶半乳糖苷酶(lacZ)(lacZ)基因和生物素親和蛋白。報基因和生物素親和蛋白。報告 噬 菌 體 已 經 能 夠 成 功 檢 測 許 多 菌 種 ， 如告 噬 菌 體 已 經 能 夠 成 功 檢 測 許 多 菌 種 ， 如E.coli,Salmonella.spp E.coli,Salmonella.spp 等等 。簡介利用熒光素酶基因作為報告基因的快速檢測技術對于細菌來說，發(fā)光機理可用下式表述：對于細菌來說，發(fā)光機理可用下式表述：F M N H 2+ R C H O

14、+ O 2 F M N + H 2O + R C O O H + h (490nm)反應是在熒光素酶的催化下進行的。細菌的熒光素酶是一個反應是在熒光素酶的催化下進行的。細菌的熒光素酶是一個7 7 k D 7 7 k D 的的二聚體，其中包含二聚體，其中包含亞基亞基( 4 0 3 7 k D ) ( 4 0 3 7 k D ) 和和亞基亞基(37kD)(37kD)。目前，生物發(fā)光基因目前，生物發(fā)光基因(lux,luc)(lux,luc)在報告噬菌體檢測技術中應用最為廣泛。在報告噬菌體檢測技術中應用最為廣泛。Waddell Waddell 等利用轉座子致突變，將等利用轉座子致突變，將lucAluc

15、A和和lucBlucB基因插入到基因插入到E.coli E.coli O157:H7O157:H7的溫和噬菌體的溫和噬菌體 V 1 0 V 1 0 中，構建了一個熒光素酶轉座噬菌體，中，構建了一個熒光素酶轉座噬菌體，這一噬菌體能夠使這一噬菌體能夠使E.coli O157:H7 E.coli O157:H7 在在1h 1h 內被成功檢測，并報告出結果。內被成功檢測，并報告出結果。vMasahitoMasahito等將綠熒光蛋白等將綠熒光蛋白(GFP)(GFP)基因分別插入到基因分別插入到T T偶數(shù)型噬菌體偶數(shù)型噬菌體PP01 PP01 的外殼蛋白的外殼蛋白(SOC)(SOC)基因的基因的C C

16、末端和末端和N N 末端，構建成噬菌體末端，構建成噬菌體PP01-GFP/SOC PP01-GFP/SOC 和和PP01-SOC/GFPPP01-SOC/GFP，這種對，這種對E.coli O157:H7E.coli O157:H7特異的噬菌體能夠成功檢測特異的噬菌體能夠成功檢測菌體的可培養(yǎng)細胞，不可培養(yǎng)但可存活細胞菌體的可培養(yǎng)細胞，不可培養(yǎng)但可存活細胞(VBNC)(VBNC)及經過巴氏消毒過及經過巴氏消毒過的細胞，靈敏度高，檢測時間僅為的細胞，靈敏度高，檢測時間僅為20min20min。以- 半乳糖苷酶作為報告基因的快速檢測技術-半乳糖苷酶半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)(EC 3.2.

17、1.23)是一種催化是一種催化-半乳糖苷水解半乳糖苷水解反應的糖苷酶。反應的糖苷酶。-半乳糖苷酶的作用特性是隨著水解反應底物的不同而改半乳糖苷酶的作用特性是隨著水解反應底物的不同而改變，鄰硝基苯變，鄰硝基苯-D- -D- 半乳糖苷是檢測中常用的靈敏基質，半乳糖苷是檢測中常用的靈敏基質，它被它被- - 半乳糖苷酶水解后產生半乳糖苷酶水解后產生藍色沉淀，藍色沉淀，該技術可以使該技術可以使檢測的靈敏度達到生物發(fā)光熒光素酶檢測的水平。檢測的靈敏度達到生物發(fā)光熒光素酶檢測的水平。GoodridgeGoodridge等設計了一個帶有等設計了一個帶有l(wèi)acZlacZ基因的基因的T4T4噬菌體，用這種噬菌體，

18、用這種噬菌體感染待測樣品，并用化學發(fā)光基質作為檢測基質，噬菌體感染待測樣品，并用化學發(fā)光基質作為檢測基質，研究人員成功檢測了肉湯培養(yǎng)基中的研究人員成功檢測了肉湯培養(yǎng)基中的E.coliE.coli，檢測限僅為，檢測限僅為10102 2CFU/mlCFU/ml。然后，研究人員將最大概率數(shù)。然后，研究人員將最大概率數(shù)(most probable (most probable numbernumber，MPN)MPN)法應用到食源性病原菌檢測中，檢測水平可法應用到食源性病原菌檢測中，檢測水平可降至降至10CFU/ml10CFU/ml，用時僅，用時僅1h1h。3、噬菌體在食品產業(yè)中的應用v 食源性疾病病

19、原的檢測技術v 作為食品添加劑v 噬菌體展示技術檢測真菌毒素3.2作為食品添加劑美國食品和藥物管理局批準了一種由噬菌體病毒混合而成的產美國食品和藥物管理局批準了一種由噬菌體病毒混合而成的產品，主要用于殺滅肉制品中的李氏桿菌。這是美國首次批準將品，主要用于殺滅肉制品中的李氏桿菌。這是美國首次批準將病毒用作食品添加劑。病毒用作食品添加劑。美藥管局專家稱，該產品在制備過程中可能留有殘毒，但試驗美藥管局專家稱，該產品在制備過程中可能留有殘毒，但試驗表明，這些微量的殘毒不會引起任何健康問題。該產品包含表明，這些微量的殘毒不會引起任何健康問題。該產品包含6 6種噬菌體病毒，可在熟肉片和香腸等包裝前噴灑在這

20、些肉制品種噬菌體病毒，可在熟肉片和香腸等包裝前噴灑在這些肉制品上，有效殺滅多種李氏桿菌，預防由這些細菌引起的食物中毒。上，有效殺滅多種李氏桿菌，預防由這些細菌引起的食物中毒。產品中所包含的噬菌體只會攻擊李氏桿菌，對人體和植物細胞產品中所包含的噬菌體只會攻擊李氏桿菌，對人體和植物細胞都不會產生影響。都不會產生影響。3、噬菌體在食品產業(yè)中的應用v 食源性疾病病原的檢測技術v 作為食品添加劑v 噬菌體展示技術檢測真菌毒素3.3 噬菌體展示技術檢測真菌毒素v 噬菌體展示技術噬菌體展示技術(Phage display technology)(Phage display technology)是是20 2

21、0 世紀世紀80 80 年代逐步建立并發(fā)展起來的一項分子生物學新技術。年代逐步建立并發(fā)展起來的一項分子生物學新技術。它以噬菌體或噬粒為載體它以噬菌體或噬粒為載體, , 使外源肽或蛋白基因與噬菌體使外源肽或蛋白基因與噬菌體表面特定蛋白基因在其表面進行融合表達表面特定蛋白基因在其表面進行融合表達, , 進而通過親和進而通過親和富集法篩選表達有特異肽或蛋白質的噬菌體。富集法篩選表達有特異肽或蛋白質的噬菌體。真菌毒素作為天然毒素廣泛存在于谷物等食品中，世界很多國家真菌毒素作為天然毒素廣泛存在于谷物等食品中，世界很多國家均有被污染的報告，由于真菌毒素屬于痕量污染物，因此檢測技均有被污染的報告，由于真菌毒

22、素屬于痕量污染物，因此檢測技術主要有各類色譜法和利用抗體的免疫學方法。術主要有各類色譜法和利用抗體的免疫學方法。其中其中高效液相色譜法（高效液相色譜法（HPLCHPLC）、氣相色譜和質譜聯(lián)用（）、氣相色譜和質譜聯(lián)用（GC-MSGC-MS）優(yōu)點優(yōu)點：靈敏度和可靠性都很高：靈敏度和可靠性都很高缺點缺點：樣品處理繁瑣，儀器昂貴，現(xiàn)場快速檢測中難以普及使用：樣品處理繁瑣，儀器昂貴，現(xiàn)場快速檢測中難以普及使用酶聯(lián)免疫吸附檢測技術酶聯(lián)免疫吸附檢測技術(ELISA)(ELISA)優(yōu)點優(yōu)點：可以同時大批量檢測樣品，攜帶方便，操作簡便和經濟：可以同時大批量檢測樣品，攜帶方便，操作簡便和經濟, , 常以試劑盒的形

23、式出現(xiàn)且易商品化常以試劑盒的形式出現(xiàn)且易商品化缺點缺點: :目前用于目前用于ELISA ELISA 檢測試劑盒的各類毒素的單克隆抗體檢測試劑盒的各類毒素的單克隆抗體(McAb) (McAb) 主要來源于小鼠雜交瘤細胞，在篩選單克隆抗體生產雜交瘤細胞主要來源于小鼠雜交瘤細胞，在篩選單克隆抗體生產雜交瘤細胞株系上，需要做雜交融合，亞克隆篩選，是一個長期復雜的過程，株系上，需要做雜交融合，亞克隆篩選，是一個長期復雜的過程，既耗費財力、物力，又浪費時間，且檢測所用真菌毒素標準品價既耗費財力、物力，又浪費時間，且檢測所用真菌毒素標準品價格昂貴。格昂貴。v 利用噬菌體展示技術制備抗體、模擬抗原表位，不僅繞過利用噬菌體展示技術制備抗體、模擬抗原表位，不僅繞過了細胞融合，而且可以以單克隆抗體（了細胞融合，而且可以以單克隆抗體（McAbMcAb） 或單鏈抗或單鏈抗體（體（ ScFv ScFv）為靶分子篩選真菌毒素的模擬抗原表位，代）為靶分子篩選真菌毒素的模擬抗原表位，代替真菌毒素的標準品，建立無毒替真菌毒素的標準品，建立無毒ELISAELISA檢測方法