血紅蛋白的提取和分離 上課用PPT學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1 簡(jiǎn)述蛋白質(zhì)提取和分離的基本原理，并了解凝膠色譜法、電泳法等分離生物大分子的基本原理。凝膠色譜法 電泳法 緩沖溶液 它們?cè)谘t蛋白的提取中分別起到什么作用。凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理 電泳法分離樣品的原理 緩沖溶液的組成和作用機(jī)理凝膠色譜法的原理和方法 樣品的預(yù)處理 色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填。第1頁(yè)/共33頁(yè)選用一定的物理或化學(xué)的方法分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子。根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)和對(duì)其他分子的親和力等等，可以用來(lái)分離不同種類的蛋白質(zhì)。第2頁(yè)/共33頁(yè) 大多數(shù)凝膠是由多糖類化合物（如葡聚糖或瓊脂糖）構(gòu)成的

2、多孔小球體，內(nèi)部有許多貫穿的通道。 根據(jù)被分離的蛋白質(zhì)根據(jù)被分離的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量相對(duì)分子質(zhì)量的大小，利的大小，利用具有用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的的凝膠的分子篩分子篩作用，來(lái)進(jìn)行分離。作用，來(lái)進(jìn)行分離。 當(dāng)相對(duì)分子量不同的蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠時(shí)，相對(duì)分子量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢;而相對(duì)分子量較大的蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動(dòng)，路程較短，移動(dòng)速度較快。相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離。第3頁(yè)/共33頁(yè)分離蛋白質(zhì)第4頁(yè)/共33頁(yè)第5頁(yè)/共33頁(yè) 在一定的范圍內(nèi)，凡是能夠抵制在一定的范圍內(nèi)，凡是能夠抵制外加少量強(qiáng)外加少量強(qiáng)酸或強(qiáng)堿酸或強(qiáng)

3、堿的影響使原來(lái)溶液的影響使原來(lái)溶液PHPH值基本保持值基本保持不變的混不變的混合溶液。合溶液。 能夠抵制外界的酸和堿對(duì)溶液能夠抵制外界的酸和堿對(duì)溶液PHPH值的影響，值的影響，維持維持PHPH基本不變基本不變。 通常由通常由1 12 2 種緩沖劑種緩沖劑溶解于水溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例使用比例就可以制得在就可以制得在不不同同PHPH范圍內(nèi)范圍內(nèi)使用的緩沖液。使用的緩沖液。, 利用緩沖液模擬細(xì)胞內(nèi)的PH環(huán)境，保證 血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，便于觀察()和科 學(xué)研究()磷酸緩沖液磷酸緩沖液第6頁(yè)/共33頁(yè)帶電粒子在電場(chǎng)作用下發(fā)生遷移的過(guò)程。 許多重要的生物大

4、分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團(tuán)，在一定的PH下，這些基團(tuán)會(huì)帶上正電或負(fù)電。在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)。電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小，形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。瓊脂糖凝膠電泳、聚丙稀酰胺凝膠電泳。第7頁(yè)/共33頁(yè) 第8頁(yè)/共33頁(yè) 1、在測(cè)定蛋白質(zhì)分子量時(shí)常用十二烷基硫酸鈉（SDS）聚丙稀酰胺凝膠電泳。聚丙稀酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺在引發(fā)劑和催化劑的作用下聚合交聯(lián)成的具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。第9頁(yè)/共33頁(yè) 蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)在聚丙

5、烯酰胺凝膠中的遷移率遷移率取決取決于它所帶于它所帶凈電荷凈電荷的多少以及的多少以及分子的大小分子的大小等因素。等因素。為了消除為了消除凈電荷對(duì)遷移率的影響，凈電荷對(duì)遷移率的影響，可以在凝膠中加入可以在凝膠中加入SDSSDS。 。由幾條肽鏈組成的蛋白質(zhì)復(fù)合體在SDS的作用下會(huì)，因此測(cè)定的結(jié)果只是。SDS能與各種蛋白質(zhì)形成，SDS所帶負(fù)電荷的量大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分子。因而掩蓋了，使電泳遷移率完全取決于分子的大小。第10頁(yè)/共33頁(yè)用用SDSSDS測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的方法測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的方法第11頁(yè)/共33頁(yè)第12頁(yè)/共33頁(yè)每個(gè)肽鏈環(huán)繞一個(gè)每個(gè)肽鏈環(huán)繞一個(gè)亞鐵血紅素基團(tuán)，亞鐵血紅素基團(tuán)，此基團(tuán)可攜帶

6、此基團(tuán)可攜帶一分子氧或一分子二一分子氧或一分子二氧化碳，氧化碳，血紅蛋白因含有血紅蛋白因含有血紅素血紅素而而呈呈紅色。紅色。第13頁(yè)/共33頁(yè)第14頁(yè)/共33頁(yè)1. 1.紅細(xì)胞的洗滌紅細(xì)胞的洗滌2.2.血紅蛋白的釋放血紅蛋白的釋放3.3.分離血紅蛋白溶液分離血紅蛋白溶液4.4.透析透析離心去除血漿離心去除血漿加蒸餾水漲破加蒸餾水漲破離心處理離心處理除去小分子雜質(zhì)除去小分子雜質(zhì)凝膠色譜法進(jìn)行分離和純化，將凝膠色譜法進(jìn)行分離和純化，將分子量較大的雜質(zhì)蛋白除去分子量較大的雜質(zhì)蛋白除去SDSSDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量，和純度鑒定相對(duì)分子質(zhì)量，和純度鑒定樣品處理粗

7、分離純化純度鑒定（一）蛋白質(zhì)提取和分離步驟第15頁(yè)/共33頁(yè)樣品處理粗分離純化純度鑒定（一）蛋白質(zhì)提取和分離步驟（二）操作過(guò)程 本課題可選用豬、牛、羊或其他脊椎 動(dòng)物的血液來(lái)分離血紅蛋白。 去除雜蛋白，以利于后續(xù)血紅蛋白的分離純化，洗滌次數(shù)不可過(guò)少。 1、采集血樣。2、低速短時(shí)間離心（速度越高和時(shí)間越長(zhǎng)，會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等一同沉淀，達(dá)不到分離的效果）3、吸取血漿：上層透明的黃色血漿。4、鹽水洗滌：用五倍體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9的氯化鈉溶液洗滌。5、低速離心（低速短時(shí)間）6、重復(fù)4、5步驟三次，直至上清液中已沒(méi)有黃色，表明洗滌干凈。第16頁(yè)/共33頁(yè)3次洗滌后的結(jié)果次洗滌后的結(jié)果第17頁(yè)/共3

8、3頁(yè) 加蒸餾水到原血液體積，再加40體積的甲苯 ，置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?0分鐘（加速細(xì)胞破裂）,細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以2000r/min的速度離心10 min。第1層（最上層）：甲苯層（無(wú)色透明）；第2層（中上層）：脂溶性物質(zhì)沉淀層（白色薄層固體）；第3層（中下層）：血紅蛋白的水溶液層（紅色透明液體）；第4層（最下層）：雜質(zhì)沉淀層（暗紅色）。用濾紙過(guò)濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。第18頁(yè)/共33頁(yè) 取1ml的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300ml的物質(zhì)的量濃度為20mmol/l的磷酸緩沖液中（pH為7.

9、0），透析12小時(shí)。除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)。第19頁(yè)/共33頁(yè)第20頁(yè)/共33頁(yè)第21頁(yè)/共33頁(yè) 取長(zhǎng)40厘米，內(nèi)徑1.6厘米的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。底塞的制作：打孔挖出凹穴安裝移液管頭部覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好，插到玻璃管的一端。：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實(shí)尼龍網(wǎng)，還會(huì)導(dǎo)致液體殘留，蛋白質(zhì)分離不徹底。頂塞的制作：打孔安裝玻璃管。組裝：將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個(gè)整體。安裝其他附屬結(jié)構(gòu)。第22頁(yè)/共33頁(yè)A、材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠（G-75）。B、代表意義：“G”表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍。75表示凝膠的得水值，即每克凝膠膨脹

10、時(shí)吸水7.5克。配置凝膠懸浮液：計(jì)算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，配成凝膠懸浮液。A、固定：將色譜柱裝置固定在支架上。B、裝填：將凝膠懸浮液一次性的裝填入色譜柱內(nèi)，裝填時(shí)輕輕敲動(dòng)色譜柱，使凝膠填裝均勻。注意：1、凝膠裝填時(shí)盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。 2、裝填凝膠柱時(shí)不得有氣泡存在：因?yàn)闅馀輹?huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。第23頁(yè)/共33頁(yè)第24頁(yè)/共33頁(yè)裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在50cm高的操作壓下，用300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液（pH為7.0）充分洗滌平衡12小時(shí)。1、液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)

11、的流動(dòng)與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果。2、不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。第25頁(yè)/共33頁(yè)打開(kāi)下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。 吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時(shí)，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動(dòng)加樣，同時(shí)注意不要破壞凝膠面。 加樣后打開(kāi)下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口。 小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開(kāi)下端出口進(jìn)行洗脫。待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每5ml收集一試管，連續(xù)收集。（在分離過(guò)程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動(dòng)，說(shuō)明色譜柱制作成功）正確的加

12、樣操作：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)。第26頁(yè)/共33頁(yè)正確的加樣操作是：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)。第27頁(yè)/共33頁(yè)第28頁(yè)/共33頁(yè)讓血紅蛋白處在穩(wěn)定的pH范圍內(nèi)，維持結(jié)構(gòu)和功能。 血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時(shí)可以通過(guò)觀察顏色來(lái)判斷什么時(shí)候應(yīng)該收集洗脫液。這使血紅蛋白的分離過(guò)程非常直觀，大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作。 血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步，包括：。首先通過(guò)洗滌紅細(xì)胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液，即:樣品的處理；再經(jīng)過(guò)透析去除分子量較小的雜質(zhì)，即樣品的粗分離；然后將相對(duì)分子

13、質(zhì)量較大的雜質(zhì)蛋白除去，即:樣品的純化；最后經(jīng)進(jìn)行純度鑒定。第29頁(yè)/共33頁(yè)鑒定血紅蛋白純度。第30頁(yè)/共33頁(yè)觀察你處理的血液樣品離心后是否分層（見(jiàn)教科書(shū)圖5-18），如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過(guò)高和時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。1、你是否完成了對(duì)血液樣品的處理？你能描述處理后的樣品發(fā)生了哪些變化嗎？2、你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產(chǎn)生？你的色譜柱裝填得成功嗎？你是如何判斷的？ 由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以加入大分子的有色物質(zhì)，例如藍(lán)色葡聚糖2000或紅色葡聚糖，觀察色帶移動(dòng)的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說(shuō)明凝膠色譜柱的性能良好。如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時(shí)要重新裝柱。 第31頁(yè)/共33頁(yè) 如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說(shuō)明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)。1.1.凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的的原理是怎樣的凝膠色譜法分