標(biāo)準(zhǔn)菌株的制備

1、標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存菌株和工作菌株制備作業(yè)指導(dǎo)書一、目的保證菌種經(jīng)過較長(zhǎng)時(shí)間保藏后仍然保持較強(qiáng)的生命力， 不被其 他雜菌污染， 減少菌株突變或發(fā)生典型的特性變化， 從而保證微 生物學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。二、方法依據(jù)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求 GB4789.28-2013及附錄 B標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存菌株和工作菌株的制備。三、適用范圍適用于本中心檢驗(yàn)菌種 （大腸埃希氏菌、 產(chǎn)氣腸桿菌） 的傳代、 儲(chǔ)存及工作菌株制備。四、名詞解釋4.1標(biāo)準(zhǔn)菌株（F0）:直接從官方菌種保藏機(jī)構(gòu)獲得。4.2標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株（F1）:將標(biāo)準(zhǔn)菌株在實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)接一代以后得到的 一套完全相同的獨(dú)立菌株。4.3儲(chǔ)備菌株（F2）

2、：從標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株轉(zhuǎn)接一代獲得的培養(yǎng)物。4.4 工作菌株：由標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株、儲(chǔ)備菌株或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)轉(zhuǎn)接一代 獲得的菌株。五、培養(yǎng)基和試劑5.1 營(yíng)養(yǎng)肉湯5.2 營(yíng)養(yǎng)瓊脂5.3 乳糖蛋白胨培養(yǎng)液5.4 75%乙醇5.5 無菌水六、儀器設(shè)備6.1 生物安全柜6.2生化培養(yǎng)箱(37C, 44.5C)6.3 高壓蒸汽滅菌器6.4 冰箱(4C, 20C)6.5 微型旋渦混合儀6.6 水浴恒溫振蕩器6.7 接種環(huán)6.8 酒精燈七、標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存菌株的制備7.1 本中心所需標(biāo)準(zhǔn)菌株從認(rèn)可的菌種中心購買，并要求生產(chǎn)商 提供驗(yàn)證報(bào)告。 冷凍干燥菌種為 0 代。本中心應(yīng)做好符合性檢查 并做好符合性檢查并填寫記錄，做好文件歸檔。

3、7.2 菌種復(fù)活7.2.1 將標(biāo)準(zhǔn)菌株及已滅菌的培養(yǎng)基等用物移入生物安全柜。7.2.2 點(diǎn)燃酒精燈，在酒精燈火焰周圍 5 厘米無菌區(qū)內(nèi)，用砂輪 在距菌種管封口端 1/3 處劃痕， 75%酒精棉球消毒菌種管外壁， 用無菌紗布包裹菌種管末端用力掰開。7.2.3 用無菌吸管吸取 0.5ml 適宜的液體培養(yǎng)基加大菌快上，混 勻成菌懸液。再將全部菌懸液移入含有 5ml 適宜的培養(yǎng)基的培養(yǎng) 試管中，在37C生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-18小時(shí)。7.2.4 取出培養(yǎng)試管，仔細(xì)觀察液體培養(yǎng)基是否渾濁，渾濁說明 菌種復(fù)活成長(zhǎng)。形成第一代菌種（） ，各菌種適宜培養(yǎng)基及培養(yǎng) 條件見表 1.7.3 在適宜的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行

4、平板分離選擇適宜的鑒別平板，用灼燒滅菌的接種環(huán)完全浸入復(fù)活的 培養(yǎng)基中， 取一滿環(huán)接種物， 將接種環(huán)接觸容器邊緣 3 次去除多 余的液體。劃線時(shí)，接種環(huán)與瓊脂平面的角度應(yīng)為 200， 300。接 種環(huán)壓在瓊脂表面的壓力和劃線速度前后一致， 整個(gè)劃線應(yīng)快速 連續(xù)。置于37 C生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24小時(shí)。7.4 菌種純度檢查和確認(rèn)觀察菌落形態(tài)是否符合， 同一平板上的單菌落的大小、 形狀、 顏 色、質(zhì)地、光澤是否相似。 對(duì)于出現(xiàn)兩種或兩種以上形態(tài)的菌株， 需要分離挑選目標(biāo)菌株。各菌種菌落形態(tài)特征見表 1.7.4.2 革蘭氏染色7.4.2.1 涂片：在載玻片上滴加一滴生理鹽水， 用滅菌接種環(huán)取典 型菌落少許，與生理鹽水混勻，涂布成薄膜。7.4.2.2 干燥：在室溫中使自然干燥。7.4.2.3 固定： 將載玻片迅速通過火焰 2-3 次，以載玻片反面接觸 皮膚，熱面不燙為度。7.4.2.4 染色：滴加結(jié)晶紫染色液，染色 1 分鐘，水洗7.4.2.5 脫色：滴加 95%乙醇脫色，約 30 秒，水洗7.4