化學(xué)發(fā)光方法學(xué)比較

1、免疫學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展對精度的要求越來越高，一般的酶免檢測技術(shù)已逐漸無法適應(yīng)這種形勢的需要?，F(xiàn)今發(fā)展的主流已不再是用放射性同位素標(biāo)記的測定方法(避免污染環(huán)境及對人體損害)，而是轉(zhuǎn)向于能在任何地方操作的快速均相和固相測定，最終趨向于能夠槍測到皮克或10負(fù)18摩爾級的、非同位素的、自動或半自動的實驗室測定技術(shù)，發(fā)光免疫分析技術(shù)順應(yīng)了這一潮流，開創(chuàng)了免疫診斷的新紀(jì)元。 發(fā)光免疫分析是一種靈敏度高、特異性強、檢測快速及無放射危害的分析技術(shù)。70年代末以來得到了迅速發(fā)展，目前在國際上已經(jīng)實現(xiàn)商品化和產(chǎn)業(yè)化的發(fā)光免疫分析產(chǎn)品，基本上可以分為：化學(xué)發(fā)光、時間分辨熒光(也稱時間延遲光致發(fā)光)、電化學(xué)發(fā)光(也稱場

2、致發(fā)光和電致發(fā)光)幾種。 1、化學(xué)發(fā)光 化學(xué)發(fā)光是指在化學(xué)反應(yīng)過程中發(fā)出可見光的現(xiàn)象。通常是指有些化合物不經(jīng)紫外光或可見光照射，通過吸收化學(xué)能(主要為氧化還原反應(yīng))，從基態(tài)激發(fā)至激發(fā)態(tài)。退激時通過躍遷(或?qū)⒓ぐl(fā)能轉(zhuǎn)移至受體分子上)，釋放能量產(chǎn)生光子，以光形式放出能量從而導(dǎo)致的發(fā)光現(xiàn)象。其主要特點為消耗發(fā)光劑。同時量子效率相對較低。 1.1 按化學(xué)反應(yīng)類型分類：可分為酶促化學(xué)發(fā)光和非酶促化學(xué)發(fā)光兩類。其中酶促化學(xué)發(fā)光主要包括辣根過氧化物酶(HRP)系統(tǒng)、堿性磷酸酶 (ALP)系統(tǒng)、黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)等。酶促發(fā)光的共同特點為發(fā)光過程中作為標(biāo)記物的酶基本不被消耗，而反應(yīng)體系中發(fā)光劑充分過最，因此發(fā)光信

3、號強而穩(wěn)定，且發(fā)光時間較長。因此可采用速率法測量，故檢測方式簡單、成本較低。酶促反應(yīng)的主要缺點為工作曲線可能隨時間漂移，而且低端斜率容易呈非線性下移。而非酶促化學(xué)發(fā)光包括吖啶酯系統(tǒng)、草酸酯系統(tǒng)、三價鐵一魯米諾系統(tǒng)等。非酶促發(fā)光的共同特點為發(fā)光過程中標(biāo)記物被消耗，同時作為標(biāo)記物的發(fā)光劑是發(fā)光反應(yīng)的瓶頸，即含量總是相對不足，因此發(fā)光信號持續(xù)時間較短；如果直接在免疫反應(yīng)杯中啟動發(fā)光反應(yīng)，由于發(fā)光劑被很快消耗，故只能進(jìn)行一次性測量。所以重復(fù)性較差。為降低檢測成本并實現(xiàn)重復(fù)測量，目前普遍采用原位進(jìn)樣加流動池的時間積分測量方式。因此儀器成本及維護(hù)費用較高，而且反復(fù)使用的流動池可能導(dǎo)致交叉污染；并目沖洗或進(jìn)

4、樣中產(chǎn)生的氣泡也會干擾測定；同時繁瑣冗長的沖洗過程也會成為提高檢測效率的瓶頸。另外，使用磁性或非磁性微粒時，強烈的散射吸收作用也會降低靈敏度。 1.2 按發(fā)光持續(xù)時間分類：可分為閃光和輝光兩類，閃光型發(fā)光時間在數(shù)秒內(nèi)，如吖啶酯系統(tǒng)。其檢測方式一般采用原位進(jìn)樣和時間積分法測量，即在檢測器部位加裝進(jìn)樣器，并保證加入發(fā)光劑和檢測2個過程同步進(jìn)行；同時以整個發(fā)光信號峰的面積為發(fā)光強度。而輝光型發(fā)光時間在數(shù)分鐘至數(shù)十分鐘以上，如HRP一魯米諾系統(tǒng)、ALPAMPPD系統(tǒng)、黃嘌呤氧化酶-魯米諾系統(tǒng)等。其信號檢測無需原位進(jìn)樣，一般以速率法測量，即在發(fā)光信號相對穩(wěn)定的區(qū)域任意點測量單位時間的發(fā)光強度。 測量化學(xué)

5、發(fā)光反應(yīng)的光強度，求得某些化學(xué)物質(zhì)和生物物質(zhì)的含量，尤其與免疫學(xué)方法結(jié)合以后形成的化學(xué)發(fā)光免疫測定法(CLIA)，其既具有發(fā)光檢測的高度靈敏性，又具有免疫分析的高度特異性，檢測快速，試劑無放射危害，檢測限達(dá)10負(fù)15 molL。 1.3 評價：化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物已廣泛應(yīng)用于抗原、半抗原和抗體的檢測，與放射性核素標(biāo)記物相比較，它的優(yōu)點在于安全(無放射危害)、穩(wěn)定、測量快速、靈敏度高、線性范圍寬、自動化程度高、減少了人為的誤差。檢測快速縮短了等待結(jié)果的時間，無需批量檢測可隨到隨測保證及時提供結(jié)果。缺點在于一般化學(xué)發(fā)光是標(biāo)記催化酶或化學(xué)發(fā)光分子的發(fā)光反應(yīng)，一般發(fā)光不穩(wěn)定，為問斷的、閃爍性發(fā)光，而且在反應(yīng)

6、過程中易發(fā)生裂變，導(dǎo)致反應(yīng)結(jié)果不穩(wěn)定。此外。檢測時需對結(jié)合相、游離相進(jìn)行分離，操作步驟多，測試成本高。主要問題是化學(xué)發(fā)光的產(chǎn)生通常是瞬間完成的，發(fā)光的峰值很快衰減，再是本底較高和干擾妨礙應(yīng)用。 1.4 代表儀器 1.4.1 美國拜耳公司最新診斷產(chǎn)品ACS：180系列全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)，以吖啶酯作為標(biāo)記，量度AE標(biāo)記物化學(xué)反應(yīng)所產(chǎn)生的光量為基礎(chǔ)，靈敏度可達(dá)10負(fù)15 gmL。 1.4.2 美國雅培公司生產(chǎn)的AxSYM系列全自動免疫發(fā)光分析儀將3種技術(shù)于一機，可用于非均相標(biāo)記微粒子酶免發(fā)光分析(MEIA)、離子捕捉發(fā)光分析(ICIA)和均相標(biāo)記熒光偏振免疫發(fā)光技術(shù)(FPIA)，目前已有80

7、多個檢測項目可供臨床應(yīng)用。1.4.3 美國貝克曼庫爾特公司AccessOR全自動微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)。采用ALP-AMPPD發(fā)光系統(tǒng)，以微粒子作為載體，表面積大、結(jié)合快、達(dá)到最大發(fā)光信號時間短、反應(yīng)及分離速度快，縮短了分析時間，有效提高了靈敏度和準(zhǔn)確性。該系統(tǒng)可全自動控制整個測定和數(shù)據(jù)分析處理，具有批量和任選測定24個項目的能力和急診插入功能，平均檢測速度100/h。冷藏試劑盤可放24種試劑，探針直接插入試劑盒并自動封閉，直至試劑用完，不污染不浪費。超聲波技術(shù)被用于攪拌使微粒懸液混均勻并加速反應(yīng)，用于探針取樣液面檢查保證取樣準(zhǔn)確，用于洗滌時減少交叉污染。使用AccessOR的用戶還可以申

8、請Internet全球通訊網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)行通訊查詢。AccessOR獨特的塑料智能化外形設(shè)計，使其從外觀到內(nèi)在品質(zhì)，給人們留下深刻的印象。 1.4.4 美國DPC公司全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀IMMULlTE，以ALP為標(biāo)記物，以金剛烷作發(fā)光底物，測定靈敏度相當(dāng)于10負(fù)21molml的酶，采用聚苯乙烯珠作載體，其檢測水平已能達(dá)到10負(fù)12gml。目前能夠檢測性腺類、甲狀腺功能類、腫瘤標(biāo)記物類、傳染病類、細(xì)胞因子類、血液病類、糖尿病類、腎上腺功能類、治療藥物類、成癮藥物類、短肽及其他分析物類，還能提供象肌鈣蛋白(TNI)這類急診項目的快速診斷試劑盒。 2、電化學(xué)發(fā)光分轎 2.1 電化學(xué)發(fā)光 2.1.1

9、電化學(xué)發(fā)光的原理是對電極施加一定的電壓進(jìn)行電化學(xué)反應(yīng)，反應(yīng)的產(chǎn)物之間或與體系中某種組分發(fā)生化學(xué)發(fā)光，用普通光學(xué)手段測髓發(fā)光光譜軍強度從而對物質(zhì)進(jìn)行衡量分析的一種方法。與化學(xué)發(fā)光有所不同，其差異在予氧化反應(yīng)是通過電極上的電化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的，而不是氧化劑或發(fā)光劑自身內(nèi)氧化產(chǎn)生，其標(biāo)記物為三聯(lián)吡啶釕及其衍生物Ru(bpy)3 2+，并以三丙胺(TPA)為還原荊。如圖1所示，Ru(bpy)32十穰TPA分剃在弼投裊囂氧化成Ru(bpy)3 3+搬TPA的陽離子自由基IPA+，IPA+迅速脫去一個質(zhì)子形成TPA自由基，TPA具有強的還原性，從而把Ru(bpy)3 3+還原為激發(fā)態(tài)的Ru(bpy)3 2+，

10、后者發(fā)射一個620 nm的光子回到基態(tài)再參與下一次電化學(xué)發(fā)光。必需0.01毫秒就可發(fā)出穩(wěn)定的光，每毫秒幾十萬次的循環(huán)電化學(xué)發(fā)光，大大提高了分析的靈敏度。另外，通過電極反應(yīng)在線制備了不穩(wěn)定的發(fā)光劑Ru(bpy)32+TPA，避免了直接使用Ru(bpy)3 2+對分析測試的影響。 2.1.2 電純學(xué)發(fā)光的主要特點是發(fā)光過程中的標(biāo)記物基本不被消耗，麗反應(yīng)體系中其他成分充分過量，因此發(fā)光倍號強而穩(wěn)定，且發(fā)光時間較長。其缺點為測量方式復(fù)雜、儀器成本及維護(hù)費用高；同時環(huán)境及樣品中同類元素也存在較弱的本底干擾。反復(fù)使用的流動池可能導(dǎo)致交叉污染；而沖洗或進(jìn)樣中產(chǎn)生的氣泡也會干擾測定；同時繁瑣冗長的沖洗過程也會

11、成為提高檢測效率的瓶頸。另外使用磁性或非磁性微粒時，強烈的散射吸收作用也會降低靈敏度。 2.2 免疫電化學(xué)發(fā)光分析：集電化學(xué)發(fā)光、生物素一抗生物索、免疫分析和由固相免疫分析發(fā)展起來的磁微球等技術(shù)于一體，是眾多學(xué)科交叉的研究領(lǐng)域。 免疫學(xué)的核心問題是抗原一抗體的特異性結(jié)合，主要采用固相的方法，即將抗原或抗體固定到磁微球上，經(jīng)免疫反應(yīng)后，在固相載體磁微球上形成抗原一抗體復(fù)合物，外加磁場沉降這種復(fù)合物，然后洗滌除去多余或游離的抗體或抗原，然后進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光測定。與一般免疫反應(yīng)類似，可分為直接法、雙抗體夾心法和競爭法。 2.3 免疫毫純學(xué)發(fā)光鶼瘟曩毫純學(xué)發(fā)光綜合了光學(xué)、電子學(xué)、生物學(xué)、免疫學(xué)和計算機，

12、禚臨床中可糟予以下幾個方面。 (1) 蛋白質(zhì)和激素測定：電化學(xué)發(fā)光技術(shù)在激素的測定中有替代放射免疫的趨勢?？蓹z測甲狀腺激素、促甲狀腺激索、性激素、雌二醇、促卵泡激索、促黃體激索、人絨毛膜促性腺激素、胰島素、胰島素樣生長因子、甲狀腺降鈣素、腫癌標(biāo)志物、前列腺特異性抗原、肌鈣蛋白、甲胎蛋白、癌胚抗原、腫瘤壞死因子、r干擾素、人體腫瘤相關(guān)糖蛋白、自細(xì)胞介素系列等。 2.3.1 毒素與病毒抗原分析：如肉毒桿菌毒索、蓖麻蛋翻、霍亂亞基和葡萄球菌腸毒素等，檢測限達(dá)10-15g。還有炭疽桿菌芽孢、傷寒沙門菌、鼠疫抗原等沙門菌和。O一157病毒等。 2.3.2 DNARNA核酸序列分析：在核酸分析中利用電化學(xué)

13、發(fā)光技術(shù)將Ru(bpy)3+標(biāo)記引物或探針進(jìn)行DNA雜交分析或聚合酶鏈反應(yīng)，是實驗室定量分析標(biāo) 本中核酸含量的一種有發(fā)展前景的檢測方法。該技術(shù)述可用于檢測乙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒等其他致病性病毒和病原微生物。 2.3.3 其它物質(zhì)的檢測：還可對其他一些微量物質(zhì)進(jìn)行測定，如維生索、葉酸、免疫球蛋白及酶類，人免疫球蛋白、人血清清蛋白、人中性粒細(xì)胞溶菌酶、葡萄糖和除草荊等。 2.4 評價：電化學(xué)發(fā)光是一種電促發(fā)光技術(shù)，采用的是特殊的化學(xué)發(fā)光劑Ru(bpy)3+作為標(biāo)記物并在發(fā)光反應(yīng)中循環(huán)使用，既避免了同位素的半衰期短及放射蝕危害，又克服了酶標(biāo)記的不穩(wěn)定性，而標(biāo)記物很穩(wěn)定，在室溫下半衰期大于1年

14、；同時還結(jié)合了90年代初期問世的鏈霉親和素的新型固相技術(shù)，不但使檢測的融敏度大大提高，而且還可自動分離游離相和結(jié)合相，使檢測更易實現(xiàn)自動化。電化學(xué)發(fā)光的反應(yīng)時間僅為20 min，而且標(biāo)準(zhǔn)曲線儲存在條碼中，每次測定只需一點標(biāo)定，Ru(bpy)3+的穩(wěn)定性很好，在室溫下半衰期長達(dá)1年。這些優(yōu)點決定了操作的快速、簡捷，無需經(jīng)常校正。 因此該技本與其它的分析手段比較，在免疫學(xué)檢測中有顯著的優(yōu)勢。它的優(yōu)點除了靈敏度高、特異性強、檢測快速外，更為可取的是所用試劑毒性低，無放射性危害，并且有良好的穩(wěn)定性。以最易受影響的促甲狀腺素為例，353周后，電化學(xué)發(fā)光試劑仍然穩(wěn)定。電化學(xué)發(fā)光分析方法多樣，適用面較大，廣

15、泛地應(yīng)用于抗原、半抗原和抗體的免疫梭測。其線性范圍也較寬，符合臨床檢驗的需要。耐它與普通的化學(xué)發(fā)光比較，前者為電促發(fā)光，在電極表面通過三角形脈沖電壓的激發(fā)產(chǎn) 生穩(wěn)定、連續(xù)、高效的發(fā)光，后者則是標(biāo)記辣根過氧化物酶作用下催化化學(xué)發(fā)光劑(如魯米諾、吖啶酯等產(chǎn)生不穩(wěn)定、間斷、閃爍性的發(fā)光)，基反應(yīng)過攘中容易發(fā) 像裂變恧使結(jié)果不穩(wěn)定。電億學(xué)發(fā)光測定的照光度裰據(jù)釋放光子的波長仍屬熒光測定酶范疇，但與直接的熒光發(fā)光不同，熒光發(fā)光的靈敏度受熒光發(fā)光的本底和光學(xué)部件散射光的影響，適應(yīng)范圍也較低。 電化學(xué)發(fā)光技術(shù)的發(fā)展趨向在于合成新的發(fā)光標(biāo)記物、優(yōu)化標(biāo)記技術(shù)和免疫分析方法，從而追蹤生命科學(xué)發(fā)展的前沿領(lǐng)域，建立對生

16、命過程有重要意義的內(nèi)源性和外源性物質(zhì)的分析方法。 2.5 代表儀器：目前生產(chǎn)電化學(xué)發(fā)光儀的廠家較少，主要生產(chǎn)廠家是瑞士羅氏診斷公司，與德國BoehringerMannheim寶靈曼公司公司合 作，Elecsysl0lO20lO，ROCHE 2010系列全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(ORIGEN分析儀)。標(biāo)本可隨時插入常規(guī)操作中并優(yōu)先測試，也為臨床急診測定提供了方便。 3、時間分辨熒光 3.1 時間分辨熒光免疫分析(TR-FIA)TR-FIA是將三價稀土鑭系離子銪(Eu)，釤(Sin)等通過絡(luò)合物標(biāo)記到抗原或抗體分子上，并通過檢測其熒光實現(xiàn)免疫分析。由于稀土離子熒光的激發(fā)光波長范圍較寬，而發(fā)射光波

17、長范圍較窄，而且激發(fā)光和發(fā)射光之間的波長差距較大，特別是熒光壽命大大長于常規(guī)熒光。因此它采用了與常規(guī)熒光免疫不同的檢測方式，即通過脈沖激光器間歇激發(fā)樣品，同時檢測器在其激發(fā)的間隙測定特定波長的熒光強度。這樣不僅消除了雜散光的干擾，而且也大大減弱了樣品及反應(yīng)杯中雜質(zhì)所產(chǎn)生的背景熒光干擾。所以其檢測靈敏度和線性范圍大大高于常規(guī)熒光。 3.2 解離增強時間分辨熒光免疫分析法(DELFIA) 由于稀土離子在水相中的熒光效率很低，因此需要將其包裹在一個非水相的環(huán)境中才能檢測到理想的熒光強度。最常見的做法是在檢測前先用酸將稀土離子從標(biāo)記抗原或抗體七解離出來，由一系列表面活性劑構(gòu)成的微囊吸收并包裹稀土離子，

18、這種方式稱為DELFIA，其中的酸和表面活性劑等被稱為增強劑。迄今為止，在所有的時間分辨熒光免疫分析法中，這種方法的靈敏度是最高的，因此近年來得到了廣泛應(yīng)用，已經(jīng)成為目前最常見的時間分辨免疫分析技術(shù)。 3.3 直接時間分辨熒光測囂法由于該方法需要在常規(guī)免疫分析中的洗滌步驟后還要進(jìn)行熒光素的解離和增強操作，因此分析步驟有些冗長繁瑣。時間分辨熒光免疫分析最大的不足是環(huán)境及樣品中同類元素導(dǎo)致的本底干擾。作為稀土資源大國的中國，這一點尤其不容忽視，特別對北方地區(qū)更為重要。雖然可以通過實驗用水和實驗室環(huán)境的特殊凈化杜絕一部分干擾，但會帶來運行成本的提高；況且由于患者體內(nèi)這類元素的積累而造成的臨床標(biāo)本污染

19、根本無法消除。因此人們研究開發(fā)了另一種稱為直接時間分辨熒光測量法的技術(shù)，也有人稱之為后標(biāo)記技術(shù)。它首先使用一種不含稀土元素的特殊絡(luò)合物標(biāo)記抗原或抗體，等常規(guī)免疫分析中的洗滌完成后，再加入稀土元素并進(jìn)行測定，這樣就基本掩蔽了同類元素導(dǎo)致的本底干擾。但其靈敏度較低，目前還不能與上述兩種方法相抗衡。除上述方法外，還有一種固 相時間分辨熒光法，它是使用一種特殊的絡(luò)合物將三價稀土離子標(biāo)記到抗原或抗體分子上，同時該絡(luò)合物還可以維持三價稀土離子周圍的非水相環(huán)境，因此也充當(dāng)了增強劑的角色。該方法的特點是無需增強劑，故操作簡單，但靈敏度度低于上述DELFIA。 3.4 評價時間分辨熒光技術(shù)的不足為測量方式復(fù)雜、

20、儀器成本及維護(hù)費用高，環(huán)境及樣品中同類元素可導(dǎo)致本底干擾等。 3.5 代表儀器法國CIS公司1996年在歐洲推出KRYPTOR全自動時間分辨熒光免疫分析系統(tǒng)，用三價鑭系元素銪(Eu3+)與磷酸三丁酯劑量 校準(zhǔn)曲線。近年來，該系統(tǒng)已可供臨床實驗室應(yīng)用的試劑盒有腫瘤標(biāo)志物、唐氏癥篩查指標(biāo)、性功能激素檢查、心血管疾病、骨代謝、甲狀腺自身免疫性疾病等。TRFlA可做雙標(biāo)記和多標(biāo)記分析，美國PE公司的1420Victor多標(biāo)記免疫分析系統(tǒng)集時間分辨免疫熒光分析、化學(xué)發(fā)光免疫分析、熒光分析及酶聯(lián)免疫吸附分析于一機，實現(xiàn)一次反應(yīng)多項結(jié)果，1臺儀器多種功能。 4、生物發(fā)光 4.1 生物發(fā)光是生物體內(nèi)發(fā)光蛋白通

21、過消耗能量物質(zhì)而產(chǎn)生的發(fā)光現(xiàn)象，其特點為只消耗能量物質(zhì)，不消耗發(fā)光物質(zhì)。近年來，隨著越來越多的發(fā)光蛋白被提純、其編碼基因序列被測定、表達(dá)，其發(fā)光底物被人工合成，相關(guān)的基礎(chǔ)研究和產(chǎn)品的商業(yè)化進(jìn)展迅速。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的發(fā)光蛋白包括細(xì)菌熒光素酶、蟲熒光素酶、腰鞭毛蟲、熒光索酶水母素及奧貝林綠色熒光蛋白等，類似的熒光蛋白還有橙色熒光蛋白、黃色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、藍(lán)綠熒光蛋白等。另外，目前己經(jīng)被發(fā)現(xiàn)的生物發(fā)光底物有：蟲熒光素、腔腸素、還原型黃素單核苷酸、腰鞭毛蟲熒光素、種蝦索等。 4.2 生物發(fā)光免疫分析法是采用生物發(fā)光物質(zhì)，如蟲熒光素酶或細(xì)菌熒光素酶或者轉(zhuǎn)助因子(NAD+、三磷酸腺苷等)進(jìn)行標(biāo)記抗原抗體，使其直接或間接發(fā)光反應(yīng)進(jìn)行檢測。如Wannlund等在1980、1982年用熒光素酶進(jìn)行標(biāo)記，發(fā)光免疫分析測定氨甲蝶呤和細(xì)菌熒光素酶，Terouanne在1986年采用6一磷酸葡萄糖脫氨酶標(biāo)記孕酮進(jìn)行發(fā)光免疫分析血清中孕酮。 4.3 生物發(fā)光免疫分析法在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用主要包括細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)、衛(wèi)生學(xué)、生物傳感器、脂質(zhì)過氧化檢測和藥物篩選等6個方面。其中細(xì)胞學(xué)檢測主要是利用細(xì)胞內(nèi)ATP導(dǎo)致的蟲熒光索酶生物發(fā)光進(jìn)行活細(xì)胞計數(shù)，目前已實現(xiàn)快速、動態(tài)，單細(xì)胞分析。近年來，在該領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)