一種檢測細菌性陰道病新方法的建立及臨床評價

1、檢驗醫(yī)學20四年24卷05期種檢測細菌性陰道病新方法的建立及臨床評價朱園園沈佐君萬士林【摘要】目的評估一種國內(nèi)自主婕立利用唾液酸酶法檢測細菌性陰道病方法的臨床應川價值。方法 比色法探索研發(fā)試劑的最佳反應條件：以酶標準品首先確定底物溶液的ph值范圍；在降低底物含 量以達到與bvblue進口試劑盒有相同檢出限后，再分別確定反應的最適溫度和時間。采用臨床標 木對優(yōu)化后的試劑、bvblue.臨床現(xiàn)用國產(chǎn)試劑盒三者檢測效果同吋進行驗證，判斷新產(chǎn)品臨床 應川價值。結(jié)果 研發(fā)試劑在ph 6.()6.2, 37°c10min時與酶標準品達到最佳反應，與bvblue相 比，檢出限相同時研發(fā)試劑底物用量

2、僅為bvblue的1/2.78。臨床實驗中，研發(fā)試劑與bvblue 對細菌性陰道病的檢測效果差異無顯若性意義,符合率96%。而國產(chǎn)試劑盒少bv blue對細菌性陰道 病的檢測效果差別有顯著性意義，符合率65%o結(jié)論研發(fā)試劑可以達到與bvblue相同的檢出效 果，優(yōu)于國內(nèi)類似方法產(chǎn)品。其成本較低，可信度高且快速方便，更有利于在臨床推廣使用。【關鍵詞】神經(jīng)氨酸酶；陰道病，細茵性experiment and clinical research of a new reagent detecting bacterial vaginosiszhu yuan-yuan, shen zuo-jun, wan

3、shi-1 in. anhui provincial hospital affiliated to anhui medical university, anhui provincial center of clinical laboratory, hefei 230001, china.corresponding author： shen zuo-jun, email: shenzuojun 【abstract objective to evaluate the diagnostic value of a new reagent developed by domestic institutio

4、n detecting bacterial vaginosis with sialidase. methods explore the optimal reaction condition of the new reagent by colorimetric method, then use clinical examples to verify its reliability and another domestic kits with u.s. bvblue kit as criteria. results the new reagent reacted best to standard

5、sialidase at 37c, lomin in solution of ph6.0. at the same minimum detection limit, the usage of substrate in new reagent was 1/2.78 times of bvblue kit's. in clinical trials, there had no significant difference between new reagent and bvblue kitthe coincidence was up to 96% whereas significant d

6、ifference was 基金項th安徽省人才開發(fā)資金資助項h (2005z040)作者單位：230001合肥，安徴醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院，安徽省臨床檢驗中心(朱園園，沈佐君)， 美國哥倫比亞大學醫(yī)學中心(萬士林)通訊作者：沈佐君，電子信箱：shenzuojun detected between another domestic kit and bvblue kit, the coincidence was only 65% conclusions the new reagent can be made to have the same characteristics as bvblue ki

7、t, such as quickness, convenience, reliability, but decreased cost greatly. it will have more wide market than other kits in china.key words neuraminidase; vaginosis, bacterial細菌性陰道?。╞acterial vaginosis, bv）是陰道內(nèi)乳酸桿菌人量減少而厭氧菌群如普雷沃菌屬、 動彎桿菌、陰道加徳納菌及支原體等人量繁殖，同時伴有陰道分泌物性質(zhì)改變的一組綜合征。bv與 早產(chǎn)、自發(fā)流產(chǎn)、子宮內(nèi)膜炎、輸卵管炎、繼發(fā)性不

8、孕等多種婦產(chǎn)科疾病密切相關可使患者對 aids和性傳播疾病的易感性增加h。世界范圍內(nèi)其感染率約為5%51 %叫bv的實驗室診斷金標 準為amsel法，其成本低廉，但指標易受到主客觀因素多種干擾，盡管后人發(fā)展出了多胺檢測卡、 革藍染色評分檢測線索細胞等改良方法，仍存在耗時長、操作繁瑣等缺點，不利于臨床快速診斷需 要。唾液酸嗨是bv患者陰道分泌物中致病菌分泌的特異性酶z ，其活性被認為與bv感染水平成 止和關。利用唾液酸酶檢測bv漸漸成為近年來臨床檢驗的首選方法。本研究以經(jīng)美國fda認證的 gryphus診斷試劑公司產(chǎn)品bvblue試劑盒為參照，開發(fā)了一種能達到為bvblue試劑盒有相同 檢測效果

9、的低成木的新型試劑，以期為國內(nèi)市場提供一個更好的選擇。材料與方法1. 材料：木院婦科門診2007年10月至12月以外陰瘙癢、h帶增多、有異味等癥狀就診患者138 例，平均年齡30歲。無菌長棉拭子采集患者陰道壁下1/3處分泌物3份（盡量多取口均勻一致），聯(lián)羊 前72 h內(nèi)無性生活，未使用陰道乳劑或灌注療法，避開經(jīng)期。2. 主要試劑與儀器：唾液酸梅標準品（美國new england biolabs公司）無菌分裝，bvblue試 劑盒（含底物ibx-4041,美國gryphus診斷試劑公司），目的底物mstt （美國lhe bioscience公司）, 國產(chǎn)唾液酸酶一步法檢測試劑盒（北京某公司），顯

10、色劑naoh。du-530型分光光度計（美國beckman 公司），phs-25b型數(shù)字酸度計（上海人普儀器有限公司），bx-41型倒置顯微鏡（口木olympus公司）。3. 方法：（1）底物ibx4041、msttm唾液酸酶標準品最適反應ph值的檢測：根據(jù)bvblue試 劑盒說明帖（ph5.5-6.0）及其實測值，經(jīng)預實驗縮小范圍后配制ph值為5.5、6.0、6.2、6.5、6.7的底 物ibx-404k mstt緩沖液各0.5ml （同一底物z間濃度相同，前者為后者的兩倍），分別加入足夠量 的酶標準品10u, 37 °c水浴lomin,加入1 mol/lnaohl-2滴,混勻后立

11、即在波長590 nm （產(chǎn)物吸收 峰）處比色，以相同處理的無酶液調(diào)零，根據(jù)產(chǎn)物量找出最適反應ph值?；槲飅bx-4041為唾液酸 酶苛性牛色底物,經(jīng)酶催化牛成ibx-4050和唾液酸，加入naoh后顯示綠色或藍色，即為陽性；酶暈 不足時顯示黃色，即為陰性。底物mstt為其類似物，顯色原理相同。 最適ph值時對于目的底物 mstt的唾液酸l*w最低檢出限：在0.5ml最適ph值的mstt緩沖液中分別加入0、0.25、0.5、0.75、1.0 u的標準酶，反應條件同上，肉眼觀察顯色情況并對產(chǎn)物進行波段掃描（波長45（）nm650nm）,觀 察峰的形成情況，記錄峰吸光度（a）值。同吋以bvblue

12、試劑盒作對照,標準酶量為0、0.75、1.0、 1.25、1.5 uo用同一管標準酶各重復三次取均值。 確定mstt用量，使兩種底物在相同反應條件 下檢出限相同：bvblue試劑盒每管0.5ml,加入檢出限量及其上下量的標準酶，以其結(jié)果為參照， 調(diào)節(jié)mstt用量使二者具有相同陰陽性標準。（4）臨床應用中反應溫度及反應時間的確定：以調(diào)整后 的mstt和bvblue試劑盒各0.5ml為反應液,酶量2、6、1（） u,分別在4、24、37反應lomin,根據(jù) a值找出最佳反應溫度，并在此溫度下再次分別反應3、5、lomin,比較后判定最佳反應時間。其中 酶量多少分別反映陽性程度為低、屮、高；根據(jù)現(xiàn)冇

13、資料對唾液酸酶（即神經(jīng)氨酸酶）一般反應特 性描述，應用調(diào)整后的底物量在寒冷（4°c）、室溫（24 °c）、理論最適值（37 °c）狀態(tài)下反應，判 斷臨床應用溫度范圍；在預實驗認為lomin已足夠反應的前提下，分析縮短反應時間對結(jié)果的影響。（5）臨床標本驗證：根據(jù)優(yōu)化后條件制成mstt試劑盒，與bvblue試劑盒、本院所用國產(chǎn)試劑盒同 時対每一患者3個拭子進行檢測，并以bvblue試劑盒為標準，均嚴格按照試劑盒說明書操作。對于 mstt與bvblue檢測結(jié)果不-致者立即重取標木按amsel法復查：（i）陰道ph >4.5； （2）陰道分 泌物增多，變稀薄如奶狀

14、，有異味；（3）胺試驗（whiff）陽性，即在陰道分泌物中加入10%koh 產(chǎn)生魚腥味；（4）陰道分泌物涂片中可見線索細胞。4項中有3項以上符合即可判斷為bv陽性。4. 統(tǒng)計學分析：應mj spss 13.0軟件，臨床標本結(jié)果比較運用配對設計mcnemaa2檢驗法和 kappa（k）檢驗法。三0.7表示兩種方法吻合度較強，（）.7$0.4技示吻合度-般，k<0.4衣示吻合度 較弱。結(jié)果1.二種底物與標準酶反應的最適ph值的判斷。由于底物濃度及酶童均相同且底物過量，因此酶 的催化活性與產(chǎn)物的量成正向變化，對以用產(chǎn)物a值較高者對應ph值作為酶的最適ph值，結(jié)杲見圖1。圖1不同ph值時標準晦的

15、二種產(chǎn)物的a值變化由圖1可得，二種產(chǎn)物a值由ph值5.5到6.0吋上升明顯，而ph值繼續(xù)增加則a值變化不人，mstt 在ph6.5時甚至有所下降?？紤]到臨床bv患者實際陰道ph值多在5.06.5z間叫正常人ph值3.54.5 國），綜合認為標準唾液酸酶應川底物液最佳ph值為6.06.2之間，選擇“拐點”處即ph6.0作為后續(xù) 實驗溶液ph值。此時產(chǎn)物均肉眼可見綠或藍色，即為陽性。2針對目的底物的標準酶最低檢岀限確定據(jù)預實驗結(jié)果逐步減少酶的川量并縮小差距，確定 酶的梯度；根據(jù)肉眼能分辨顏色變化的程度及在波長掃描中是否有產(chǎn)物峰和對應的峰a值高低，判 斷最低檢出限。反應后溶液顏色隨產(chǎn)物量增加由黃至藍

16、逐漸變化，見表1和表2。表1不同含量標準酶與mstt作川對產(chǎn)物顏色及a值影響mstt結(jié)果0u0.25 u0.5 u0.75 u1.0 ua值0.0230.2730.3210.5020.804顯色（判斷）黃色（陰性）黃色（陰性）黃色（陰性）黃綠色（弱陽性）綠色（陽性）表2不同含量標準酶與ibx作川對產(chǎn)物顏色及a值影響1bx結(jié)果0u0.75 u1.0 u1.25u1.5 ua值0.0200.3210.3590.4190.508顯色（判斷）黃色（陰性）黃色（陰性）黃色（陰性）黃綠色（弱陽性）綠色（陽性）根據(jù)表中結(jié)果認為，在bvblue底物用量為h的底物的2倍時，目的底物mstt在ph6.0條件卜所需

17、標準酶的最低檢出限為0.75 u, bvblue底物所需酶的最低檢出限為1.25 u。3. 根據(jù)以上結(jié)果，以bvblue底物所需酶的最低檢岀限為標準，調(diào)節(jié)fl的底物用量使二者一致, 即陰陽性標準相同，發(fā)現(xiàn)此吋目的底物的用量僅為bvblue底物的1/2.78,即0.09mgo4. 臨床反應溫度確定：根據(jù)現(xiàn)有資料對唾液酸酶（即神經(jīng)氨酸酶）一般反應特性描述，應用調(diào) 整后的底物量在寒冷及室溫狀態(tài)下與不同含量酶反應，結(jié)果以波長590nm處a值表示，見表3。表3不同溫度對二種底物反應的影響4 °c24 °c37 °c酶量2u6ui0u2u6u10u2u6ui0uibx0.11

18、60.3770.6130.4571.0691.5690.4721.3831.781mstt 0.1710.4290.8230.4411.2121.5520.587l6771.822可以看出，酶在37 °c時催化活性最好,酶量高時更明顯,較冷條件下(4 °c)易造成假陰性而不適 宜檢測。鑒于24 °c與37 °c時的a值比較接近，認為臨床應用時在一般室溫下反應即可，即使標本中 酶量較低也不影響結(jié)果判讀。反應時間優(yōu)化:采用最佳溫度37 °c分別反應3、5、lomin,見表4。表4不同時間對兩種底物酶反應的影響3 min5 min10 mina 值

19、2u6u10 u2u6u10 u2u6u10 uibx0.5491.0241.6470.5811.4791.9480.9701.910251mstt0.5111.3651.7500.6211.728l8691.328l7951.909由以上數(shù)據(jù)可知兩者均能快速反應，3min5min產(chǎn)物顏色與a值差別均不明顯，而lominlht則反應很 充分，在低酶量時也呈淺藍色，a值育了人人提高。因此在考慮速度與效率的前提下，選jljlomin為 最佳反應吋間。5. 臨床試驗中138例疑似患者中bvblue陽性檢出率為26%,研發(fā)試劑為25%。研發(fā)試劑敏感度 為92%,特異度為98%,符合率為96%,陽性預測

20、值為94%,陰性預測值為97%。與bvblue相比差 異無顯著性意義，兩種試劑吻合度較強，見表5。表5研發(fā)試劑盒対138例門診患者bv檢測結(jié)果比較研發(fā)試劑bvblue陽性陰性合計陽性33235陰性3100103合計36102138p>005,k=0.905>0.7其中有5例結(jié)杲不-致，經(jīng)amsel標準判斷認為：研發(fā)試劑陽性、bvblue陰性2例：amsel 陽性1例，陰性1例；研發(fā)試劑陰性、bvblue陽性3例：amsel陽性2例，陰性1例。國產(chǎn)試劑陽性檢出率為59%,敏感度為97%,特異度為54%,符合率為65%,陽性預測值為43%, 陰性預測值為98%；與bvblue相比差異有

21、非常顯著性意義，兩種試劑吻合度較弱，見表6。表6國產(chǎn)試劑盒對138例門診患者bv檢測結(jié)果比較國產(chǎn)試劑bvblue陽性陰性合計陽性354782陰性15556合計36102138p<o.oh k =0.362<0.4討論健廉女性陰道中厭氧菌與需氧菌數(shù)量比為2： 15： 191,正常情況下陰道通過白凈作用維持內(nèi) 環(huán)境的穩(wěn)定，抵御外來微生物感染。當卵巢功能紊亂導致雌激素水平下降或人為因素使ph值升高等 破壞菌群平衡時，原本占優(yōu)勢的乳酸桿菌被陰道加德納菌及其它厭氧菌群等機會致病菌所取代， 造成病理上無明顯炎癥的細菌性陰道?。ㄒ蚣拥录{菌及普雷沃菌屬分泌的唾液酸嗨可間接促進片細 胞的分解）l，0

22、jo te由于其感染癥狀不明顯且常易復發(fā)，致病菌產(chǎn)生的粘蛋白水解酶一再使陰道粘膜 屏障受損，導致其他病原體更易入侵產(chǎn)生局部感染和全身癥狀因此bv對女性特別是孕婦的庁心 健康構(gòu)成了很大的潛在威脅。近年來bv診斷依靠對致病菌特斤性代謝酶類的?；瘷z測，如脯氨酸氨肽酶竝】、粘蛋口水解酶 陰、唾液酸御叫乳酸脫氫酶冋等，尤以唾液酸酶法商品試劑盒發(fā)展最為迅速、廣泛，如美國gryphus 診斷試劑公司90年代開發(fā)的bvblue試劑盒上市后已獲fda認證及專利保護，以其簡便、快速、準 確的優(yōu)點在歐美許多國家都己大量應用。但由于單靠進口價格昂貴，它在國內(nèi)的使用受到很大限制。 目前各大醫(yī)院多采用國產(chǎn)唾液酸酶法檢測試

23、劑盒，根據(jù)其中是否加入顯色劑乂可細分為一步法與兩 步法。國產(chǎn)試劑普遍價格低廉，但是市場上產(chǎn)品質(zhì)量良莠不齊，臨床應用時很難保證結(jié)果的對靠性, 易造成漏診、誤診。因此，我們與美國哥倫比亞大學合作，以bvblue為參考，開發(fā)出了底物關鍵 成分mstt,確定了新試劑盒的最佳反應條件，經(jīng)過臨床初步測試認為它bvblue檢驗結(jié)果具 有很高的符合率（96%）,敬感度92%、特異度98%。有5例結(jié)杲不符，在排除操作誤差后認為可能 是取樣差異較大，如性質(zhì)不均勻或取材部位略有不同存在酶活性差異，導致標木含酶量在檢出限左 右時，顏色判斷易受主觀因索影響，造成二者結(jié)果差異。這種影響可以通過臨床醫(yī)師嚴格按要求取 樣來避

24、免。在新試劑盒研制成功的同時，比較了本院在用的國產(chǎn)一步法試劑盒，發(fā)現(xiàn)它雖然敏感度 高（97%）,但特異性相當?shù)?，假陽性率高達46%,與bvblue符合率僅肓65%,結(jié)果并不完全真實 可靠。因此認為就檢測效果而言，新試劑不僅在二步法產(chǎn)品中接近國際先進標準，且優(yōu)于現(xiàn)有一-步 法產(chǎn)品。就成本而言，新試劑盒約為10元人民幣，bvblue和國產(chǎn)試劑盒為其23倍，所以新試劑盒 除了同樣具備簡便、快速、直觀的優(yōu)點外，還人人節(jié)省了試劑成木，利于各級醫(yī)院推廣使川。根據(jù) 以上研究我們得出結(jié)論，認為木試劑在經(jīng)過更多的臨床驗證后完全有望成為bvblue在國內(nèi)的替代 產(chǎn)品，應用前景十分廣闊。致謝：感謝美國lhe bio

25、science inc.何海音博士提供底物mstt。參考文獻1 darwish a, elnshar em, hamadeh sm, et al. treatment options for bacterial vaginosis in patients at high risk of preterm labor and premature rupture of membranes. j obstet gynaecol res, 2007, 33:781-787. pmid: 180014422 andrews ww, hauth jc, cliver sp, et al. associati

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27、r, 2007, 4:25. pm1d: 179537614 jones fr, miller g, gadea n, et al. prevalence of bacterial vaginosis among young women in low-incomc populations of coastal pcm. int j std aids, 2007, 1 & 188-192. pmid: 173625535 amsel r, totten pa, spiegel ca , et al. nonspecific vaginitis. diagnostic criteria a

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