細(xì)胞庫建立標(biāo)準(zhǔn)

1、細(xì)胞庫建立概況一、對細(xì)胞庫細(xì)胞基質(zhì)總的要求（一） 細(xì)胞系株歷史資料1細(xì)胞系株來源資料 應(yīng)具有細(xì)胞系株來源的相關(guān)資料， 如細(xì)胞系株制備機(jī)構(gòu)的名稱， 細(xì)胞系株來源 的種屬、年齡、性別和健康狀況的資料。這些資料最好從細(xì)胞來源實(shí)驗(yàn)室獲得，也可引用正 式發(fā)表文獻(xiàn)。人源細(xì)胞系株須具有細(xì)胞系株的組織或器官來源、 種族及地域來源、 年齡、 性別 及生理狀況的相關(guān)資料。動物來源的細(xì)胞系株須具有動物種屬、種系、飼養(yǎng)條件、組織或 器官來源、地域來源、年齡、性別、病原體檢測結(jié)果及供體的一般生理狀況的相關(guān)資料。2細(xì)胞系株培養(yǎng)歷史的資料 應(yīng)具有細(xì)胞分離方法、 細(xì)胞體外培養(yǎng)過程及建立細(xì)胞系株過程的相關(guān)資料， 包括所 使用的

2、物理、化學(xué)或生物學(xué)手段，是否有外源添加序列，以及細(xì)胞生長特征、生長液成分、 選擇細(xì)胞所進(jìn)行的任何遺傳操作或選擇方法等。 同時(shí)還應(yīng)具有細(xì)胞鑒別、 檢定、 內(nèi)源及外源 因子檢測結(jié)果的相關(guān)資料。應(yīng)提供細(xì)胞培養(yǎng)液的詳細(xì)成分。 如使用人或動物源成分， 如血清、 胰蛋白酶、 水解蛋白 或其他生物學(xué)活性的物質(zhì)，應(yīng)具有這些成分的來源、制備方法、質(zhì)量控制、檢測結(jié)果和質(zhì)量 保證的相關(guān)資料 o（ 二 ） 細(xì)胞庫的建立 細(xì)胞庫的建立可為生物制品的生產(chǎn)提供已標(biāo)定好的、細(xì)胞質(zhì)量相同的及能持續(xù)穩(wěn)定 傳代的細(xì)胞種子。1原材料的選擇 建立細(xì)胞庫的各種類型細(xì)胞的供體均應(yīng)符合細(xì)胞庫細(xì)胞的檢定中相關(guān)規(guī)定。 神經(jīng)系統(tǒng)來 源的細(xì)胞不得用

3、于生物制品生產(chǎn)。培養(yǎng)細(xì)胞用牛血清應(yīng)來源于無牛腦海綿體腦病流行地 區(qū)的健康牛群， 其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)符 合規(guī)定 （附錄 XIII D） 。不得使用人血清作為細(xì)胞培養(yǎng)液。 如需使用人血白蛋白， 則須使用有批準(zhǔn)文號的合格制 品。消化細(xì)胞用胰蛋白酶應(yīng)進(jìn)行檢測，證明其無細(xì)菌、真菌、支原體或病毒污染。特別應(yīng)檢 測胰蛋白酶來源的動物可能攜帶的病毒，如細(xì)小病毒等。用于生物制品生產(chǎn)的培養(yǎng)物中不得使用青霉素或B-內(nèi)酰胺（3 -Lactam）類抗生素。2細(xì)胞培養(yǎng)操作的要求細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)人員應(yīng)定期檢查身體。在生產(chǎn)區(qū)內(nèi)不得進(jìn)行非生產(chǎn)制品用細(xì)胞或微生物的 操作；在同一工作日進(jìn)行細(xì)胞操作前，不得操作或接觸有感染性的微生物或動物。3

4、.建立細(xì)胞庫細(xì)胞庫為三級管理，即原始細(xì)胞庫、主細(xì)胞庫及工作細(xì)胞庫。如為引進(jìn)的細(xì)胞，可采用 主細(xì)胞庫和工作細(xì)胞庫組成的二級細(xì)胞庫管理。在某些特殊情況下，也可使用主細(xì)胞庫一級庫，但須得到國務(wù)院藥品監(jiān)督管理部門的批準(zhǔn)。(1) 原始細(xì)胞庫(PCB)由一個(gè)原始細(xì)胞群體發(fā)展成傳代穩(wěn)定的細(xì)胞群體，或經(jīng)過克隆培養(yǎng)而形成的均一細(xì)胞群體，通過檢定證明適用于生物制品生產(chǎn)或檢定。在特定條件下，將一定數(shù)量、成分均一的細(xì) 胞懸液，定量均勻分裝于安瓿，于液氮或一130 C以下凍存，即為原始細(xì)胞庫，供建立主細(xì)胞庫用。(2) 主細(xì)胞庫(MCB)取原始細(xì)胞庫細(xì)胞，通過一定方式進(jìn)行傳代、增殖后均勻混合成一批，定量分裝，保存 于液氮

5、或一 130 C以下。這些細(xì)胞必須按其特定的質(zhì)控要求進(jìn)行全面檢定，全部合格后即為 主細(xì)胞庫，供建立工作細(xì)胞庫用。(3) 工作細(xì)胞庫(WCB)工作細(xì)胞庫的細(xì)胞由 MCB®胞傳代擴(kuò)增制成。由MCB的細(xì)胞經(jīng)傳代增殖，達(dá)到一定代次 水平的細(xì)胞，合并后制成一批均質(zhì)細(xì)胞懸液，定量分裝于安瓿，保存于液氮或一130C以下備用，即為工作細(xì)胞庫。凍存時(shí)細(xì)胞的傳代水平須確保細(xì)胞復(fù)蘇后傳代增殖的細(xì)胞數(shù)量能滿 足生產(chǎn)一批或一個(gè)亞批制品。復(fù)蘇后的傳代的水平應(yīng)不超過批準(zhǔn)的該細(xì)胞用于生產(chǎn)的最高限定代次。所制備的 WCE必須經(jīng)檢定合格，方可用于生產(chǎn)。4細(xì)胞庫的管理每種細(xì)胞庫均應(yīng)分別建立臺賬，記錄放置位置、容器編號、分

6、裝及貯存安瓿數(shù)量，取用記 錄等。細(xì)胞庫中的每支細(xì)胞安瓿均應(yīng)注明細(xì)胞系/株名、代次、安瓿號、凍存日期，貯存容器的編號等。凍存的細(xì)胞存活率應(yīng)在 90%以上。凍存后的細(xì)胞，應(yīng)至少做一次復(fù)蘇培養(yǎng)并連續(xù)傳代 至衰老期，檢查不同傳代水平的細(xì)胞生長情況。主細(xì)胞庫和工作細(xì)胞庫分別存放。非生產(chǎn)用細(xì)胞應(yīng)與生產(chǎn)用細(xì)胞嚴(yán)格分開存放。(三)細(xì)胞庫細(xì)胞的檢定細(xì)胞檢定主要包括以下幾個(gè)方面： 細(xì)胞鑒別、外源因子污染和內(nèi)源因子的檢測、 致瘤性 檢測等。必要時(shí)還須進(jìn)行細(xì)胞染色體核型檢查。 這些檢測內(nèi)容對于 MCBffl胞和WCBffl胞均適 用。建立細(xì)胞庫的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)至少進(jìn)行一次 mcb®胞的全面檢定，檢定應(yīng)包括：細(xì)胞鑒

7、別試驗(yàn)， 細(xì)菌、真菌檢查，支原體檢查，外源病毒因子檢查等。每次建立WCB后，均應(yīng)按規(guī)定項(xiàng)目進(jìn)行檢定。1細(xì)胞鑒別試驗(yàn)新建細(xì)胞系/株、細(xì)胞庫（MCB和WCB和生產(chǎn)結(jié)束時(shí)的細(xì)胞應(yīng)進(jìn)行鑒別試驗(yàn)，以確認(rèn)為 本細(xì)胞，無其他細(xì)胞的交叉污染。細(xì)胞鑒別試驗(yàn)方法有多種，包括細(xì)胞遺傳檢測（如特征染色體標(biāo)志）、遺傳標(biāo)志檢測（如DNA指紋圖譜、STR圖譜、基因組二核苷重復(fù)序列 ）、免疫學(xué) 檢測 （ 如組織相容性抗原、種特異性抗血清） 和生物化學(xué)鑒別法 （ 如同工酶試驗(yàn) ） 等?？蛇x其中一種或幾種方法， 但均須經(jīng)國家藥品檢定機(jī)構(gòu)認(rèn)可。 細(xì)胞表型特征與遺傳學(xué)特 征相結(jié)合來判斷，更有利于細(xì)胞鑒別。2細(xì)菌、真菌檢查取細(xì)胞培養(yǎng)上

8、清液樣品3支原體檢查取細(xì)胞培養(yǎng)上清液樣品，應(yīng)為陰性。4細(xì)胞內(nèi)、外源病毒因子檢查 應(yīng)注意檢查細(xì)胞系/株中是否有細(xì)胞來源物種中潛在的可傳染的病毒，以及由于操作 帶入的外源性病毒。 對細(xì)胞進(jìn)行病毒檢查的種類及方法， 須根據(jù)細(xì)胞的種屬來源、 組織來源 及細(xì)胞特性決定。（1）細(xì)胞形態(tài)觀察及紅細(xì)胞吸附試驗(yàn) （ 簡稱血吸附試驗(yàn) ）取混合瓶細(xì)胞樣品，接種至少 6 個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿，待細(xì)胞長成單層后換維持液， 持續(xù)培養(yǎng)兩周。每日鏡檢細(xì)胞，細(xì)胞應(yīng)保持正常形態(tài)特征。細(xì)胞至少培養(yǎng)14天后，分別取1/3細(xì)胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿，用 02%0.5 %豚鼠紅細(xì) 胞和雞紅細(xì)胞混合懸液進(jìn)行血吸附試驗(yàn)。加入紅細(xì)胞后置48C 30分

9、鐘，然后置2025C30 分鐘，分別進(jìn)行鏡檢，觀察紅細(xì)胞吸附情況，結(jié)果應(yīng)均為陰性。新鮮紅細(xì)胞在28 C保存不得超過7天，且溶液中不應(yīng)含有鈣離子或鎂離子。（2）不同細(xì)胞傳代培養(yǎng)法檢測病毒因子自MCB或WCB來源的細(xì)胞，分別接種下列三種單層細(xì)胞，包括猴源細(xì)胞、人源二倍體細(xì)胞和同種不同批的細(xì)胞。每種單層細(xì)胞接種至少 10000000個(gè)活細(xì)胞或裂解細(xì)胞及其培養(yǎng)上 清液，每種細(xì)胞至少接種 2瓶。接種樣品量應(yīng)占維持液的1/4以上，培養(yǎng)至少 14天。取培養(yǎng) 7 天的上清液各一瓶，分別接種于同種細(xì)胞培養(yǎng)，盲傳一代，繼續(xù)培養(yǎng)7天，觀察細(xì)胞病變并進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察及紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)。若待檢細(xì)胞已知可支持人巨細(xì)胞病毒（

10、CMV）的生長，則應(yīng)在接種人二倍體細(xì)胞后至少觀察 28 天，應(yīng)無細(xì)胞病變。同時(shí)，應(yīng)進(jìn)行血吸附病毒檢測，應(yīng)為陰性。（3）接種動物和雞胚法檢測病毒因子MCB細(xì)胞或WCB田胞以及增殖到或超過生產(chǎn)用體外細(xì)胞齡限制代次的細(xì)胞，須采用動物體內(nèi)接種法進(jìn)行外源病毒因子檢測。 選用乳鼠、 成鼠和雞胚 （兩組不同日齡 ）共計(jì) 4組， 按表 1 所列方法進(jìn)行試驗(yàn)和觀察。 如試驗(yàn)到期有 80%以上動物或雞胚健存， 此試驗(yàn)成立， 結(jié)合其 他檢測確定結(jié)果。對于新建細(xì)胞系/株， 還應(yīng)接種豚鼠和家兔 （見表 1） 。豚鼠主要用于檢查細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分 枝桿菌， 在注射前觀察 4 周， 結(jié)核菌素試驗(yàn)為陰性者方可用于試驗(yàn)。 家兔主要用

11、于檢測猴來 源細(xì)胞中是否存在 B病毒污染，也可用兔腎細(xì)胞培養(yǎng)法代替。動物組要求數(shù)量接種途徑細(xì)胞濃度/個(gè)活細(xì)胞ml探接種細(xì)胞液量/ ml只 - 觀察天數(shù)結(jié)果判定乳鼠24 小時(shí)內(nèi)10（2 窩 ）腦內(nèi)腹腔>10 7O 01O 121應(yīng)健存成鼠15 20g10腦內(nèi)腹腔>2X10 60.03 O521應(yīng)健存雞胚9 11 日齡10尿囊腔>5X106O 234尿 液血凝試驗(yàn)陰性雞胚5 6 日齡10卵黃囊>2X106O 55應(yīng)存活豚鼠350 500g5腹腔>4X10 55O42應(yīng)健存，解剖無結(jié)核病變家兔1.5 2.5kg5皮下皮內(nèi)>2X10s9.0 O.1X 1021無異常

12、，健存(4) 逆轉(zhuǎn)錄病毒及其他內(nèi)源性病毒或病毒核酸的檢測可采用下列方法對MCBffl胞或WCB田胞以及增殖到或超過生產(chǎn)用體外細(xì)胞齡限制次的細(xì) 胞進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病毒的檢測。 逆轉(zhuǎn)錄酶活性測定采用敏感的方法，如產(chǎn)品增強(qiáng)的逆轉(zhuǎn)錄酶活性測定法 (PERT)或其他檢測逆轉(zhuǎn)錄酶的方法，檢測細(xì)胞培養(yǎng)液上清中逆轉(zhuǎn)錄酶活性。 透射電鏡檢查收集待檢細(xì)胞，低速離心后，棄上清，沉淀中應(yīng)含有1X 10 7個(gè)細(xì)胞，且細(xì)胞存活率應(yīng)不低于 99%。在沉淀中加入固定劑，于4 C保存或直接包埋后制備超薄切片， 置于銅網(wǎng)上染色后透射電鏡觀察。 感染性試驗(yàn)將待檢細(xì)胞感染逆轉(zhuǎn)錄病毒敏感細(xì)胞， 培養(yǎng)后檢測。 根據(jù)待檢細(xì)胞的種屬 來源，須使用

13、不同的敏感細(xì)胞進(jìn)行感染性試驗(yàn)。這三種方法具有不同的檢測特性及靈敏度， 因此應(yīng)采用不同的方法聯(lián)合檢測。 若逆轉(zhuǎn)錄 酶活性檢測陽性時(shí)， 建議進(jìn)行透射電鏡檢查或感染性試驗(yàn)， 以確證是否存在感染性逆轉(zhuǎn)錄病 毒顆粒。小鼠來源和其他嚙齒類來源的細(xì)胞系或其雜交瘤細(xì)胞系有可能攜帶潛在的逆轉(zhuǎn)錄病毒。因此， 對于人一鼠雜交瘤細(xì)胞系則應(yīng)進(jìn)行特異性逆轉(zhuǎn)錄病毒檢測。如用于單克隆抗體生產(chǎn)的小鼠細(xì)胞系，則可不檢測特異性的逆轉(zhuǎn)錄病毒，但在生產(chǎn)工藝中應(yīng)增加病毒滅活程序。(5) 特殊外源病毒因子的檢測應(yīng)對MCBffl胞或WC細(xì)胞進(jìn)行特殊病毒的檢測。檢測病毒的種類應(yīng)根據(jù)細(xì)胞系/株種屬、 組織來源等確定。如鼠源的細(xì)胞系，可采用小鼠、

14、大鼠和倉鼠抗體產(chǎn)生試驗(yàn)，檢測其種特異病毒。 人源的細(xì)胞系/株，則應(yīng)檢測如人鼻咽癌病毒、人巨細(xì)胞病毒、人逆轉(zhuǎn)錄病毒、人乙型 肝炎病毒、 人丙型肝炎病毒。 在某些情況下， 也可能進(jìn)行轉(zhuǎn)化病毒的檢測， 如人乳頭瘤病毒、 腺病毒及人單純皰疹病毒。這些病毒的檢測可采用適當(dāng)?shù)捏w外檢測技術(shù)。5致瘤性檢查某些傳代細(xì)胞系已證明具有致瘤性，如來源于嚙齒類的細(xì)胞系BHK21 CHOC127胞等,或細(xì)胞類型屬致瘤性細(xì)胞，如雜交瘤細(xì)胞，則可不必做致瘤性檢查。某些傳代細(xì)胞系已證明在一定代次內(nèi)不具有致瘤性，而超過某代次則具有致瘤性，如Vero 細(xì)胞，則必須進(jìn)行致瘤性檢查。人上皮細(xì)胞系、 人二倍體細(xì)胞株及所有用于活病毒疫苗生

15、產(chǎn)的細(xì)胞系株應(yīng)進(jìn)行致瘤性 檢查。另外，新建細(xì)胞系株必須進(jìn)行致瘤性檢查。在某些情況下，用于人體細(xì)胞治療及基因治療的細(xì)胞也須進(jìn)行致瘤性檢查。將來源于MCB細(xì)胞或WCB田胞的增殖到或超過生產(chǎn)用體外細(xì)胞齡限制代次，再進(jìn)行致瘤性試驗(yàn)。下述兩種致腫瘤性試驗(yàn)方法可任選其一： 裸鼠至少10只，將細(xì)胞懸浮于適量無血清培養(yǎng)基中，使細(xì)胞濃度為每Iml含5X 10 7個(gè)細(xì)胞，每只裸鼠皮下注射或肌內(nèi)注射O. 2ml;同時(shí)用Hela細(xì)胞或HeP-2細(xì)胞設(shè)立陽性對照，陽性對照組至少 10只，每只注射0. 2ml含10 6個(gè)細(xì)胞；可用人二倍體細(xì)胞株作為陰 性對照，陰性對照組至少 10只，每只注射 0. 2ml 含10 7 個(gè)

16、細(xì)胞。 新生小鼠（35日齡），8lOg小鼠10只，在出生后第 0天、2天、7天和第14天, 分別用0.1ml抗胸腺血清（ATS）或球蛋白處理，然后同上每只皮下接種 10 7個(gè)活細(xì)胞。并 設(shè)立陽性對照組，對照組至少接種 10只。結(jié)果判定： 定期觀察并觸摸注射部位有無結(jié)節(jié)形成，且形成的任何結(jié)節(jié)均應(yīng)進(jìn)行雙向測量并記 錄。 陽性對照組至少有 9 只有進(jìn)行性腫瘤生長時(shí)，試驗(yàn)視為有效。 如試驗(yàn)組動物有進(jìn)行性生長的結(jié)節(jié)或可疑病灶，應(yīng)觀察至少12周；若出現(xiàn)的結(jié)節(jié)在觀察期內(nèi)開始消退，則應(yīng)在結(jié)節(jié)完全消退前，處死動物并進(jìn)行解剖做病理及組織學(xué)檢查。 未發(fā)生結(jié)節(jié)的動物，半數(shù)動物應(yīng)觀察21天，剖檢，另外半數(shù)動物應(yīng)觀察 1

17、2周，進(jìn)行病理檢查，剖檢接種部位，觀察各淋巴結(jié)和各器官有無結(jié)節(jié)形成，如有懷疑，進(jìn)行病理組織 檢查，不應(yīng)有轉(zhuǎn)移瘤形成。除上述體內(nèi)法外， 也可采用軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)或器官培養(yǎng)試驗(yàn)等體外法檢測，特別適用于低代次時(shí)，動物體內(nèi)無致瘤性的傳代細(xì)胞系。應(yīng)符合本規(guī)程 "一、 （二）細(xì)胞庫的建立 "中有關(guān)規(guī)混合后培養(yǎng)， 傳至一定代次后供生產(chǎn)用。 其代次 從WC敢出的細(xì)胞種子增殖的細(xì)胞不得再回凍保（四）生產(chǎn)用細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)用原材料的選擇和細(xì)胞操作環(huán)境， 定。從凍存的WC沖取出一支或多支安瓿,不得超過該細(xì)胞用于生產(chǎn)的最高限定代次。存或再用于生產(chǎn)。體外培養(yǎng)細(xì)胞齡的計(jì)算 二倍體細(xì)胞齡以細(xì)胞群體倍增 （

18、Population Doubling） 計(jì)算，以每個(gè)培養(yǎng)容器細(xì)胞群體 細(xì)胞數(shù)為基礎(chǔ)，每增加一倍作為一世代，即一瓶細(xì)胞傳二瓶（1 ：2 分種率），再長滿瓶為一世代；一瓶傳四瓶 （1 ：4） 為二世代；一瓶傳八瓶 （1 ：8） 則為三世代。生產(chǎn)用細(xì)胞齡限制在細(xì) 胞壽命期限的前 23內(nèi)。傳代細(xì)胞系則以一定稀釋倍數(shù)進(jìn)行傳代，每傳一次為一代。二、連續(xù)傳代細(xì)胞系的特殊要求 傳代細(xì)胞系一般是由人或動物腫瘤組織或正常組織傳代或轉(zhuǎn)化而來，可懸浮培養(yǎng)或采用載體培養(yǎng)，能大規(guī)模生產(chǎn)。這些細(xì)胞可無限傳代，但到一定代次后，致瘤性會增強(qiáng)。所以對生產(chǎn)用傳代細(xì)胞系應(yīng)進(jìn)行嚴(yán)格檢查。 應(yīng)按本規(guī)程 "一、（ 三）細(xì)胞庫細(xì)

19、胞的檢定 "的規(guī)定進(jìn)行 細(xì)胞庫的檢查。對生產(chǎn)過程中細(xì)胞培養(yǎng)的要求如下：1用于生產(chǎn)的細(xì)胞代次 用于生產(chǎn)的傳代細(xì)胞系，代次都有一定限制。用于生物制品生產(chǎn)的細(xì)胞最高限定代次， 須經(jīng)批準(zhǔn)。2 在生產(chǎn)末期進(jìn)行外源病毒因子檢測 對手病毒類制品，茬生產(chǎn)末期，對照細(xì)胞應(yīng)按本規(guī)程"一、 （ 三）4 （1） 細(xì)胞形態(tài)觀察及紅細(xì)胞吸附試驗(yàn) " 規(guī)定進(jìn)行血吸附病毒檢查。對于在不同時(shí)間收集合并的培養(yǎng)物，應(yīng)在每次 收集時(shí)檢測對照細(xì)胞培養(yǎng)物。三、人二倍體細(xì)胞株的特殊要求新建的人二倍體細(xì)胞株必須具有以下資料： 建立細(xì)胞株所用胎兒的胎齡和性別、 終止妊 娠的原因、所用胎兒父母的年齡、職業(yè)及健康良好

20、的證明 （ 醫(yī)師出具的健康狀態(tài)良好、無潛 在性傳染病和遺傳性疾患等證明） ，以及胎兒父系及母系三代應(yīng)無明顯遺傳缺陷疾病歷史的書面調(diào)查資料。人二倍體細(xì)胞株應(yīng)在傳代過程的早期，選擇適當(dāng)世代水平（28世代）增殖出大量細(xì)胞，定量分裝后，置液氮中或一130 C下凍存，供建立 PCB之用，待全部檢定合格后，即可正式定為PCB供制備 MCB。1 染色體檢查及判定標(biāo)準(zhǔn) 新建人二倍體細(xì)胞株及其細(xì)胞庫必須進(jìn)行染色體檢查。對于已建株的人二倍體細(xì)胞株， 如 WI-38、MRC-5 2BS KMBI7等，在建立 MCB寸可不必進(jìn)行細(xì)胞染色體檢查。但如對細(xì)胞 進(jìn)行了遺傳修飾，則須按新建細(xì)胞株進(jìn)行染色體檢查。（1）染色體檢

21、查新細(xì)胞建株過程中， 每 812世代應(yīng)做一次染色體檢查， 一株細(xì)胞整個(gè)生命期內(nèi)連續(xù)培 養(yǎng)過程中，至少應(yīng)有 4 次染色體檢查結(jié)果。每次染色體檢查，應(yīng)至少隨機(jī)取 1000個(gè)分裂中期細(xì)胞，進(jìn)行染色體數(shù)目、形態(tài)和結(jié)構(gòu) 檢查， 并做記錄以備復(fù)查。 其中至少選擇 50個(gè)分裂中期細(xì)胞進(jìn)行顯微照相， 作出核型分析， 并應(yīng)粗?jǐn)?shù) 500 個(gè)分裂中期細(xì)胞，檢查多倍體的發(fā)生率。每次染色體檢查， 應(yīng)從同一世代的不同培養(yǎng)瓶中取細(xì)胞， 混合后進(jìn)行再培養(yǎng)， 制備染色 體標(biāo)本片。染色體片應(yīng)長期保存，以備復(fù)查?？捎肎分帶或Q分帶技術(shù)檢查50個(gè)中期細(xì)胞染色體帶型，應(yīng)用照相圖片作出帶型分析。（2）判定標(biāo)準(zhǔn)對 1000個(gè)和 500個(gè)中

22、期細(xì)胞標(biāo)本異常率進(jìn)行檢查，合格的上限（可信限 90Poison法 ） 如表 2。表 2 人二倍體細(xì)胞染色體分析標(biāo)準(zhǔn)I檢查細(xì)胞數(shù)丨異常丨III 1000500 |10011 -染色單體和染色體斷裂1| 471 1| 26 | 8 |結(jié)構(gòu)異常| 17 | 10 | 2 |超二倍體|8|5|2亞二倍體| 180 | 90 | 18 |多倍體| 30 | 17 | 4 亞二倍體如超過上限，可能因制片過程中人為丟失染色體，應(yīng)選同批號標(biāo) 本重新計(jì)數(shù)。 一個(gè)中期細(xì)胞內(nèi)超過 53 條染色體，即為一個(gè)多倍體。 2無菌檢查每812世代細(xì)胞培養(yǎng)物，應(yīng)進(jìn)行無菌檢查(附錄劉A)。3支原體檢查每812世代細(xì)胞培養(yǎng)物，應(yīng)進(jìn)

23、行支原體檢查(附錄劉B)。4病毒檢查二倍體細(xì)胞株傳代過程中， 至少對 2個(gè)不同世代水平進(jìn)行病毒包含體、 乙型肝炎、 丙型 肝炎、EB病毒、艾滋病病毒檢查等，結(jié)果應(yīng)均為陰性。5 致瘤性檢查每 812 世代應(yīng)做一次致瘤性檢查 (方法見本規(guī)程 "一、 (三)5致瘤性檢查 ") ，結(jié)果應(yīng)無 致瘤性。6生產(chǎn)過程細(xì)胞培養(yǎng)物檢查(1) 染色體檢查可根據(jù)制品特性及生產(chǎn)工藝， 確定是否進(jìn)行生產(chǎn)過程中細(xì)胞培養(yǎng)物的染色體檢查。 通常， 含有活細(xì)胞的制品或純度不足的制品，應(yīng)對所用細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行染色體檢查及評價(jià)(見本規(guī)程"三、 1染色體檢查及判定標(biāo)準(zhǔn) ") 。但如采用已建株的人二

24、倍體細(xì)胞生產(chǎn)，則不要求進(jìn)行 染色體核型檢查。(2) 細(xì)胞鑒別試驗(yàn)按本規(guī)程 " 一、 ( 三) 細(xì)胞庫細(xì)胞的檢定 "中細(xì)胞鑒別試驗(yàn)進(jìn)行。(3) 無菌檢查按附錄劉A進(jìn)行，應(yīng)符合規(guī)定。(4) 支原體檢測按附錄劉B進(jìn)行，應(yīng)為陰性。(5) 正常細(xì)胞外源病毒因子檢測制備病毒類制品時(shí)， 于接種病毒的當(dāng)天或在連續(xù)傳代的最后一次接種病毒時(shí)， 留取此批 細(xì)胞的 2 5的細(xì)胞不接種病毒，換維持液作為正常細(xì)胞對照。與接種病毒的細(xì)胞在相 同條件下培養(yǎng)， 并按本規(guī)程 "一、 ( 三)4 (1) 細(xì)胞形態(tài)觀察及紅細(xì)胞吸附試驗(yàn) "和"(2) 不同 細(xì)胞傳代培養(yǎng)法檢測病毒因子

25、" 的規(guī)定進(jìn)行外源病毒污染檢查。四、重組細(xì)胞的特殊要求重組細(xì)胞，系通過DNA重組技術(shù)獲得的含有特定基生物制品生產(chǎn)用動物細(xì)胞基質(zhì)制備及檢如細(xì)定規(guī)程因序列的細(xì)胞系， 因此重組細(xì)胞系的建立應(yīng)具有細(xì)胞基質(zhì)構(gòu)建方法的相關(guān)資料，胞融合、轉(zhuǎn)染、篩選、集落分離、克隆、基因擴(kuò)增及培養(yǎng)條件或培養(yǎng)液的適應(yīng)性等方面的資 料。細(xì)胞庫細(xì)胞的檢查應(yīng)按本規(guī)程 " 一、（三） 細(xì)胞庫細(xì)胞的檢定 "的規(guī)定進(jìn)行，但還應(yīng)進(jìn)行下述檢查：1 細(xì)胞基質(zhì)的穩(wěn)定性生產(chǎn)者須具有該細(xì)胞系用于生產(chǎn)的目的基因的穩(wěn)定性資料， 包括重組細(xì)胞系的遺傳穩(wěn)定 性、 目的基因表達(dá)穩(wěn)定性、 目的產(chǎn)品持續(xù)生產(chǎn)的穩(wěn)定性， 以及一定條件下保存時(shí)細(xì)胞生產(chǎn)目 的產(chǎn)品能力的穩(wěn)定性等資料。2 鑒別試驗(yàn)除按本規(guī)程 "一、 （三）1 細(xì)胞鑒別試驗(yàn) "進(jìn)行外，還應(yīng)通過檢測目的蛋白基因或蛋白進(jìn) 行鑒別試驗(yàn)。3 重組細(xì)胞產(chǎn)物的外源病毒因子檢測應(yīng)按本規(guī)程 "一、（三）4 （1） 細(xì)胞形態(tài)觀察及紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)"和"（2） 不同細(xì)胞傳代培養(yǎng)法檢病毒因子 " 的規(guī)定對細(xì)胞裂解物或收獲液及生產(chǎn)用培養(yǎng)基進(jìn)行外源病毒因子的檢測。五、原代細(xì)胞的要求 原代細(xì)胞應(yīng)來源于健康的動物臟器組織或胚胎，包括猴腎、地鼠腎、沙鼠腎、家兔腎、 狗腎或動物的胎兒和其他組織， 以及雞胚和鵪鶉胚等正常組織， 以適當(dāng)?shù)南合?/p>