血清脂類測定

1、血清脂類測定血漿中的脂奚包括膽固醇.膽固醉脂、甘油三酯、磷脂和非酯化脂肪酸等。目前，對有關(guān)脂類代謝疾患的診斯和治療過程，均必須檢測血漿（淸）中的脂類，通過其含量 的變化，對臨床疾患提供協(xié)助診斷的依據(jù)。有關(guān)醫(yī)學(xué)科研工作，脂類的定量檢測也是一項(xiàng)必備的研 究項(xiàng)目。1. 膽固醇測定血漿中膽固醇及其酯的含量檢測，從方法學(xué)上可分為兩大矣：一類是化學(xué)法包括抽提法和直接 測定法，這類方法目前仍在沿用：另一類是酶法測定，方法敏感特異快速，并能自動(dòng)化分析，已常 規(guī)應(yīng)用?；瘜W(xué)測定法種類多，由于顯邑反應(yīng)的特異性不同，其結(jié)果有一定的差異。目前公認(rèn)的參考 方法是Abel I-Kendal l（L-B及應(yīng)）法。另外，三氟化

2、鐵-硫酸及應(yīng)法（Zak法）具有顯色穩(wěn)定法、操 作簡便.靈敏度約5倍于L-B反應(yīng)法，膽固醇酯與游離膽固醇顯色程度比較接近等優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)是特 異性差，干擾因素比L-B法多，如冰醋酸中含有的乙醛酸，血淸樣品中的血紅蛋白，膽紅素以及硫 酸的質(zhì)量等因素均可影響Zak方法的準(zhǔn)確性，Zak法更適合于科研使用。酶法測定血淸膽固醇的方 法已秋廣泛采用，國產(chǎn)試劑已能滿足臨床的需要。膽固醇渕定用的標(biāo)準(zhǔn)品，按美國國家標(biāo)準(zhǔn)局（NBS） 出品純度達(dá)，是國際公認(rèn)的參考物，國內(nèi)李健齋等已純化制成符合這一要求的膽固醇純品，已供臨 床檢測血淸膽固醇使用。2. 甘油三SS測定血漿甘油三酯的測定，目前多以化學(xué)法和酶法定量?；瘜W(xué)法測定甘

3、油三酯是以脂蛋白變性，水 解成甘油，并以甘油為計(jì)算依據(jù)。酶法是以特異酶水解甘油三酯，除去脂肪酸，再渕定甘油，方法 特異，準(zhǔn)確而快速，臨床廣為應(yīng)用。目詢甘油三酯測定的方法主要以定量甘油為依抵，然而血諭樣 品中存在有游離甘油，如何從反應(yīng)過程中的總甘油中減去游離甘油，多年來一直在研究討論這一問 題。若不減去，其測定值將會(huì)高于血淸樣品中的真值，如果要減去，就必須先測出血淸樣品中的游 離甘油，甘油三酯的測定方法將增加一個(gè)緊雜的步驟，實(shí)際工作中難以做到。有報(bào)道血淸樣品中的 游禺甘油實(shí)際量是L,相當(dāng)于甘油三酯的L,為此建議，實(shí)測的甘油三酯量減去一個(gè)校正系數(shù)即：甘油三酯（mmol/L）二X 總甘油（mmol/

4、L） （mmol/L）。這一校正系數(shù)也僅適用于健展人，對臨床病人并不一定適用。據(jù)報(bào)道，血溝樣品的游離甘油一 直是個(gè)未知數(shù)，無法測準(zhǔn)。為此，目前臨床測定血渣甘油三酯時(shí)，基本上未考慮游離甘油，因?yàn)槠?含量很少，暫且忽略不記。甘油三酯測定的參考物，推薦三油酸甘油酯和三軟脂酸甘油酯混合物（2: 1, W/W）,此參考物適用于化學(xué)法。在酶法測定中，仍以高純度的三油酸甘油酯為參考物。3. 磷脂測定血淸磅脂包括卵磷脂、溶血卵磷脂.神經(jīng)磅脂、腦磷脂和其他少量磷脂。如需要分別檢測各種 鑄脂，可以通過薄層層析法.柱層析法和高壓液相色譜法。目前，臨床僅測定血清鑄脂總量。血溝 磷脂總量的測定方法有化學(xué)方法和酶法兩大矣

5、?；瘜W(xué)法是以磷脂中的磷為定量依據(jù)，因?yàn)槊苛字?子中都含有一個(gè)磷酸根，故將磷脂的磅稱為脂性磷。由于血洽中碼脂大部分為卵磷脂，其分子量中 麟約占4亂 故將脂性磅換算成磷脂的系數(shù)，一般為25。由于化學(xué)法均需要抽提，再渕抽提液中的磷 脂的磷，血洽中的磷酸鹽不可能混入抽提液中，因此血淸中的磷酸鹽對磷脂測定的干撫很少。酶法 是利用磷脂酶進(jìn)行定量測定。生物體中磷脂酶包括磷脂酶久、心C和D四種。磷脂酶D特異性差， 均可水解卵磷脂.溶血卵磷脂和神經(jīng)磷脂，三者約占血淸總磷脂的95%,臨床多用含磷脂酶d的試 劑進(jìn)行磷脂的定量測定。4. 游離脂肪酸測定游離脂肪酸屬于未酯化的一類脂肪酸，故又稱為非酯化脂防酸，其量很少

6、，采用方法必須是靈 敏的方法,還需要避免脂肪水解產(chǎn)生脂肪酸的干擾。測定方法有：演定法需妥微量滴定裝置，因 為要通過肉眼觀家顏色，竝免會(huì)有主觀因素的影響，所以難以測定準(zhǔn)確，很難用于常規(guī)；光度法， 以鋼皂法常用：酶法，主要采用特異性不強(qiáng)的脂肪酶D進(jìn)行檢測，方法特異，快速準(zhǔn)確，已常規(guī) 應(yīng)用于臨床。第一節(jié)膽固醇測定血淸中膽固醇包括CE和FC,酯型的CE占70%, FC占30軋CE中的Cs的-0H在LCAT作用下，可 分別結(jié)合亞油酸(43%)、油酸(24%) 軟脂酸(10%)、亞麻油酸(6%).花生四烯酸(6%) 理 脂酸(3%)等脂肪酸結(jié)合而成。血淸中膽固酹在LDL中呆多，其次是HDL和VLDL. C

7、M冕少。血淸總 膽固醇測定方法分為化學(xué)法和酶法兩大類。1-化學(xué)法化學(xué)法一般包括：抽提：皂化：毛地黃皂昔沉淀純化；顯色比色四個(gè)階段。代表性的 方法有Sperry-Webb法,適過步隸操作過程。常規(guī)操作中多采用省去了、?；蛘哂檬∪?.步驟的Zak-Henl y法及省去步隸的Abel I-Kendal I法，現(xiàn)將此法作為標(biāo)準(zhǔn)參考方法予以引 用。2.酵法測定CE在膽固醉酯酶(cholesterolesterase)作用下水解成FC和NFFA, TC再經(jīng)膽囲醉取化酶 (cholesterol oxidase, COD)氧化成Zk4膽紛烯酮和HO。再分別定量0?的消耗或者HO的生成量， 或者A4膽省烯酮生

8、成量，以作為TC的定量依據(jù)。該法是目前常觀的應(yīng)用方法，快速準(zhǔn)確，標(biāo)本用 量少，便于自動(dòng)生化分析儀作批量測定。一、Abe 11 -Kenda I I 改良法1.原理血淸加入醇溶性氮氧化鉀，使膽網(wǎng)醇從脂蛋白中分離出來，同時(shí)使膽固酹酯加水分解成游離膽 加石油醛振搖.抽提，使膽固醇移入石油靛層，分需并取一定量的石油聯(lián)層，蒸發(fā)至干，再 進(jìn)W Liebermann-Burchard顯色反應(yīng)，620nm比色定量。該法可用于基本功訓(xùn)練及組織細(xì)胞膽固醇 的提取定量。2.試劑組成代號種類濃度組成貯存28°C有效時(shí)間R1乙醇優(yōu)質(zhì)純R2石油醛沸點(diǎn)68°C,特級純R3水醋酸分析純R4無水醋酸膽固醇分

9、析用，不含HCIR5濃硫酸分析純R6K0H液33%(W/W)K0H10g+H2020mlR7乙醇性KOH液R194ml+R66ml臨用前配制R8L i ebermann配制后BurchardR420體積+R51體積+R310體積1h試劑*內(nèi)用完R9膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液L膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品200mg+RW 100ml0:在三角燒瓶內(nèi)，加入無水酪酸,于冰水中冷至i(rc以下，再慢慢加入濃硫酸，混合，靜置I靜置35ih«以空白管調(diào)零，°剛定光巒度(620w】)Ebl壓人內(nèi)r3.操作操作中白標(biāo)本血消(ml)0.2R9(tnllR7(ml)2.010min, 乂加冰酪酸混勻，備用。標(biāo)準(zhǔn)液0.22.

10、02.0扳站.37 1C lh矜 i取岀平衡到室溫 5.05.02.0 2.0充分混勻4 1000r/miiK 離心 5min2.0 2.0|養(yǎng)60匸水浴，使I右油離藻干葢發(fā)T1燥L(fēng) - R反應(yīng)良&ml)m3.03.0圖15-1血淸膽固醇(Abell法)測定操作圖 按圖15-1操作。4 計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)總膽固醇濃度二EMEstX (mmol/L)二.酶法(CEH、COD-POD 法)首先將血溝中膽網(wǎng)醇酯在膽固醇酯酶(CEH)水解為游離膽固醇和脂肪酸，膽固醇在膽固醇氧化 酶(COD)作用下，生成A4-膽越烯酮和HO,再H2O2經(jīng)過氧化物酶(POD)作用在4-氨基安替比林 (4-AA-P)及N-乙

11、基-N- (3-礎(chǔ)基貉酸)-3甲氧基苯胺(N-ethyI-N-(3-suIfopropyI)-manisidine, ESPAS)參與下，生成紅色St亞胺色素。皿固醇酯一游離膽固醇+脂肪醸膽固醇膽當(dāng)烯雷十E°2H2O2十ESPAS + 4氨基安替比林紅色釀亞胺芭素HO+ESPAS+4-氨基安替比林t紅色醍亞胺色素(一)手工測定法1.試劑組成代號種類濃度組成貯28°C有效吋間Na2HP0450mmoI/LNa2H2P0450mmoI/L膽酸鈉3mmoI/L4 -氮基安替比林LR1*ESPAS14nmo I /L24hCarbowax-6000LCEH33U/LCOD117U/

12、LPOD6700U/LR2標(biāo)準(zhǔn)液L用異丙醇溶解膽固醇*混勻，調(diào)pH至±(25'C),或購買試劑盒。酶以活性單位表示。2.操作按圖15-2操作。3計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)總膽固醇濃度二EMEstX (mmol/L)(二)自動(dòng)化分析儀測定以CL-7200型全自動(dòng)生化分析儀檢測為例。1. 試劑組成A液.：CEH、POD、抗壞血酸氧化酶等。B液：COD、4-氨基安替比林等。操作宇白管測定管標(biāo)注管3.03.03.0水舷顯色刪R2(pl)以空白管調(diào)零，500nm,測比密岌30V430304- 37 r>10mift 反應(yīng)Ebl十rr%.Est137 U 預(yù)溫 lOmin圖15-2血淸膽固醇測定(酶

13、法)操作圖2.上機(jī)參數(shù)項(xiàng)目參數(shù)方法終點(diǎn)法波長雙波長(540nm, 700nm)反應(yīng)溫度37°C試劑A反應(yīng)時(shí)間23mi n試劑B反應(yīng)時(shí)間56mi n樣本用量3u 1試劑A用量250 |1 1試劑B用量120 u I單位mmol/L3.操作過程祥本亠A液竺上吧測定光密度(A1)亠B液3兀56啤測定光密度(A2) 和I 250卩I* .S40nm ' 1201700nm4 計(jì)算以厶A=A2-A1,根據(jù)同樣處理之標(biāo)準(zhǔn)或質(zhì)控物計(jì)算，打印結(jié)果。5.注意事項(xiàng)(1) 試劑與樣本量可根抵分析儀要求按比例改變。(2) 試劑在有效內(nèi)28C避光食保存。(3) 膽網(wǎng)醇含量趨過200nmol/L,需用生

14、理鹽水稀釋再測。第二節(jié)甘油三酯測定甘油三酯51稱中性脂肪，由于其甘油骨架上分別結(jié)合了 3分子脂肪酸、2分子脂肪酸或1分子 脂肪酸，相應(yīng)稱為甘油三酯(TG)、甘油二酯(DG)和甘油一酯(MG) o血淸中90嶺95$是TG, TG 中結(jié)合的脂肪酸分別為油酸(44%)、軟脂酸(26用)、亞油酸(16%)和櫬桐油酸(7%) o血淸TG測定方法一般分為物理化學(xué)法、化學(xué)法及酶法三大類。血淸中TG的化學(xué)組成并不單一，準(zhǔn)確求其分子較為困難。因標(biāo)準(zhǔn)不同，測定結(jié)果存奩差異?；?學(xué)法多采用三棕桐箱(較脂牯)(分子量)、三油耕(分子量)為標(biāo)準(zhǔn)，按摩爾濃度計(jì)算。酶法測 定以三油梢為標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行換算。1 化學(xué)法化學(xué)測定法包

15、括：TG的抽提分離：皂化：甘油糖的氧化：氧化生成甲掌顯色定量等四 個(gè)階段。操作較為緊雜，影響測定因素太多，本法準(zhǔn)確性差，一般很少用。2. 酶法測定酶法渕定包括：TG的抽提與皂化：加水分解生成甘油煽定量等二個(gè)階段。目前常規(guī)檢測應(yīng) 用的方法有甘油激酶(glycerolkinase, GK)法和甘油氧化酶(glycerol Oxidase, GOD)法。操作簡 便，快速準(zhǔn)確，并能在自動(dòng)化生化分析儀上進(jìn)行批量測定。一、乙酰丙酮法1. 原理血淸中加入異丙醇抽提取甘油三酯，經(jīng)KOH皂化使甘油三酯水解生成甘油及脂肪酸，甘油在過 碘酸作用下取化成甲菸.在氟需子存在下甲醛與乙酰丙酮縮合生成黃色的3, 5二乙St

16、, 1, 4二更 甲基毗吭，其顏色的深淺與甘油三酯的含量成正比，420nm測定定量。該法可用于基本功訓(xùn)練及組 織細(xì)胞TG的提取測定。tr油三前竺廿注+ 3次脂肪酸甘油寸QT f甲醛十申酸十2HIQT甲聲+變色戰(zhàn)(4.5一拜2 7 縈一磺酸)一紫紅色化介物(氏班伙亡反應(yīng))2.試劑組成代號種類濃度組成貯有效時(shí)2-8C間R1抽提液(CH3) choh ()重蒸餡R2吸附劑氧化鋁，水洗除去微細(xì)顆粒，110°C烤干3h以上閉封一周R3皂化劑5%KOH 5g+HaO-> 100mlR4醋酸溶 液2moI/LCHsCOOH +H20-> 100mlR5過碘酸鈉LNa 104 +H2OT

17、100m IR6氧化劑R4 1體積+R51體積一周R7醋酸鐵 液CH3COONH2 +H20100mlR8顯色劑+RT40m I+R-7100m I+R-480mlR9參考液2mg/dI三油酸甘油酯2mg+R-iTlOOml (TG100mg/dl)3.操作按圖15-3操作。r (ml) 抽提R-l(ml)t R-2(g)空白傑測定管標(biāo)準(zhǔn)管0.1S.00.5見化振搖 30 60min, 其何豫置后，再振 搖»3000r/min 肉心"lOmin2,02.02.00.30.10.1緬化 gmE)150 X：水浴/ I5min0.1 0.1 0.1Y"I室溫lOmin

18、,靜蚩1.51.51.5I 50 水浴 40min.X流水冷卻以空白鐺調(diào)零，410“e瀆取光密度圖15-3血淸甘油三醐(乙酯丙酮法)測定操作圖4. 計(jì)算血淸 TG 濃度=Esa/E$t X (mmo I /L)二、酶法(GK-GPO-POD比色法)血淸中甘油三酯經(jīng)脂肪酶水解為廿油和脂肪酸，甘油在甘油漑酶(GK)及ATP存在下，生成3- 麟酸甘油，爾后，在磷酸甘油氧化酶(GPO)作用取化成麟酸二輕丙酮并生成HO, HO與底物4-甌 基安替比林和ESPAS在過氧化物酶(POD)作用下，生成紅色亞醍化合物(quinoneimine),比色 (500nm),其顏色深淺與甘油三酯含量成正比。甘浪二爾上甘

19、油I脂肪酸甘油+ ATP七La虞酸甘袖十ADPMg*L l璘酸甘燉+ O2亠磷發(fā)改冗丙銅+ H2O22忌O + 4-氨基安替比林+ ESPAS竺紅色亞莖化合物+ HC1 + 4H2O（-）手工測定法1.試劑組成代號種類濃度貯存28°CR1磷酸甘油氧化晦ML冷藏（A液）抗壞血酸氧化晦>L甘油激酶ML4-氨基安替比林80mg/LR2脂蛋白脂酶ML冷藏過氧化物酶N10KU/LESPAS300mg/LR3 （參考液）甘油酸三脂200mg/dI (L)冷藏: 一般采用商品試劑盒操作曲清3)R-l(rnl)空口管16L0測定筲1610161.0I泯勻，37£水浴115minR2(

20、ml)0.50.50.5以空白管調(diào)冬，丄混勻13 7 C 5min"V550nm列光密度E肌EsaEst圖15-4血淸甘油三酣測定法（酶法）操作圖2. 操作按圖15-4操作。3計(jì)算血淸 TG 濃度二Esa/EstX （mmol/L）（二）生化分析儀檢測全自動(dòng)生化分析儀測定操作（以CL-7200型為例）o1. 試劑A液：GK, GPO, 4-AA-P.抗壞血酸氧化酶等。B 液:POD, Lipase, ESPAS 等。標(biāo)準(zhǔn)液：甘油三油酸酯200mg/dlL）o2. 上機(jī)參數(shù)名稱參數(shù)方法終點(diǎn)法波長雙波長(540nm 700nm)試劑A反應(yīng)時(shí)間2 3mi n試劑B反應(yīng)時(shí)間56mi n反應(yīng)溫

21、度3TC樣本用量4u I試劑A用量200 u I試劑B用量100 u I單位mmol/L3.操作過程樣木十A液竺竺J期定光密度（A1）十B液 片匸85；測定光密度（八2）4；d2D0p1540nm1CHJ/./.1700 nm4 計(jì)霧以厶A=A2-A1并根抵同樣之標(biāo)準(zhǔn)或質(zhì)控物計(jì)算，自動(dòng)打印結(jié)果。5. 注意事項(xiàng) 試劑與樣本量可根據(jù)分析儀要求按比例改變。 試劑在有效期內(nèi)28C避光保存。 樣本中甘油三酯含量超過11nw）l/L需用生理鹽水稀釋后再渕。第三節(jié)磷脂測定磷脂（PL）并非單一的化合物，其分子內(nèi)含有磷酸基的多種脂質(zhì)，磷脂是這一類物質(zhì)的總稱。 血中PL包括：卵磷脂占60%和溶血卵磅脂占2%10撫

22、 碼脂酰乙醇胺等，占2用：箱磷脂，占 20%。血淸P L定量方法包括測定無機(jī)鑄的化學(xué)法和酶法兩大類。1 化學(xué)測定法過程包括：抽提分離：灰化：顯色、比色的三個(gè)階段。2.酶測定法可分別利用磷脂酶A. B. C、D等4種酶作用，加水分解，測定其產(chǎn)物，對PL進(jìn)行定量。一般 多采用磷脂酶D (PL-D)進(jìn)行定量。PL-D可作用于含有卵礪脂、溶血卵磷脂和弼磷脂以及含膽堿的 礴脂，這三種磷脂約占血淸總磷脂的95札 本法快速準(zhǔn)確，便于自動(dòng)生化分析儀器進(jìn)行批量檜測。一、化學(xué)法(消化法)1原理以有機(jī)泯合試劑(無水乙醇、乙醇)抽提血淸中磷脂，再用濃硫酸和過氣酸消化抽提液中的脂 類和其他有機(jī)化合物，用硝酸鹽與磷反應(yīng)生

23、成有色化合物，比色定量。本法可用紐織細(xì)胞磷脂的抽 提定量。2.試劑組成代 號種類濃 度組成貯2 8°C有效 時(shí)間R-1抽提液無水乙醇：乙醇二3:1R-2消化液用1L密器，加水約500m I,置冷水中緩緩加濃硫酸280m I 到水中，冷卻后加過氯酸(70鼠AR) 65ml,混勻，加 蒸餡水至1000mlR-3顯邑劑飼酸笹()+無水醋酸鈉，加蒸餾水溶解并稀釋至1L, 監(jiān)用時(shí)取此液體9份加新配的VitC液(10%) 1份，混 合即可R-4參考液(貯存 液)1mg/L稱干燥KH2PO ()，溶于蒸餡水中，轉(zhuǎn)移至100ml的容董 中，用蒸鐳水加至刻度。冷藏R-5參考應(yīng)用液ml取貯存液2ml加至

24、50ml容童中，加水至刻皮冷藏3. 操作按圖15-5操作。4 計(jì)霧血淸脂性磷濃度=Esa/Est X 10 (mg/d I)血淸磷脂(以卵磷脂計(jì))=Esa/EstX10X (wnol/L)空口管標(biāo)鹿管操作血渭(O1)R.-l(E1)0.12.4ml加窪后)充分扳搖,室 SlOotn30001 /tain 1 CrainI混勻，于梆水浴蔥干熬干上消&1）1.00.10J0.10,2020.2各符放佼絲網(wǎng)內(nèi)， 置電爐丄加翅消化， 使到定管內(nèi)由黑到 淸亮為準(zhǔn)靜迓冷 卻.2.0 2.0 2.0I 6CK70 r 林I】0mim冷卻以空白管調(diào)零，于70 Dim比色測光密度操作圖*采用帯垂玻璃試管

25、圖15-5血諭磷脂測定（消化法）二、酶法1.原理磷脂酶D因特異性不高，能水解血淸中卵磷脂，溶血卵磷脂和神經(jīng)磷脂(三者占血溝總鑄脂的 95%),釋放出膽堿，膽堿在膽堿氧化酶作用下生成甜菜堿和H202,在過氧化物酶作用下，HO, 4- 氨.基安咎比林、酚發(fā)生反應(yīng)生成紅色醍亞胺化合物，其顏色深淺與這三種磅脂的含量成正比，在 500nm波長下比色計(jì)算結(jié)果為：2.試劑(1)酶應(yīng)用液(參考配方)：每100mlTris-His緩沖液(50mmol/L,)中含：磷脂酶D45U膽堿氧化酶100U過氧化物酶220U4-氨基安替比林12mg酚20mgCaC 12 2H208mgTritonX-100(2)標(biāo)準(zhǔn)液：純

26、卵磷脂，臨用前配制，5mg/蒸鐳水(含)3. 操作(1) 標(biāo)本采集：空n 12h抽靜脈血，不抗凝，分離血溝或抗凝血分離血漿。(2) 在酶應(yīng)用液中加入血溝(漿)20口1,標(biāo)準(zhǔn)管加標(biāo)準(zhǔn)液20 p I,空白管加水20 n I,放置 37'C水浴10min后，波長500nm,比色，空白管液調(diào)鞋。4計(jì)算血淸磅脂(mg/dl) =TA/SAX200血淸磷脂(mmol/L)二血淸磷脂(mg/dI) X第四節(jié)非酯化脂肪酸測定臨床上將Go以上的脂肪酸稱為游離脂肪酸(free fatty acid,FFA)或非騎化脂肪酸(nonesterifiedfatty acid, NFFA),正常血淸中含有油酸(1

27、8:1,W9)占 54%,軟脂酸(16： 0)占34怡，披脂酸(18: 0)占6匕是其主要的NFFAo另外還有月桂酸(12: 0)、肉豆蔻酸(14： 0) 和花生四烯酸(20: 4,fW)等含量很少的脂肪酸。與其他脂質(zhì)比較，NFFA在血中濃度很低， 其含量水平極易受脂代謝，瘵代謝和內(nèi)分泌機(jī)能等因素影響，血中NFFA半壽期為12min,極短。 血淸中的NFFA是與淸蛋白結(jié)合進(jìn)行運(yùn)輸，屬于一種極簡單的脂蛋白。測定血淸NFFA法有滴定法。比色法，原子分光光度法，高壓液相層析法和酶法等。一般多以酶 法測定。作NFFA測定的標(biāo)本一定要注意在4C條件下分離血淸并盡快進(jìn)行測定。因?yàn)檠杏懈鞣N脂 肪酶存在，極

28、易也極快使血中TG和PL的酯型脂肪酸分解成非酯化的FFA.使血中NFFA值上升。貯 存標(biāo)本僅限于24h內(nèi)，若保存三天，其值約升高30& 使結(jié)果不準(zhǔn)確。1. 非酶法測定非酶法測定包括滴定法、比色法、原子吸收分光光度法和高任液相層析法。前三種方法準(zhǔn)確性 差：高壓液和層析法，儀器太昂貫，不便于批量操作。2. 酶測定法主要用脂肪酶測定。血淸中游離脂肪酸可分別測定酶水解E的產(chǎn)物乙酰CoA或AMP或輔酶A(CoA) 進(jìn)行定量。酶法測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，快速，易于批量栓渕。測定原理如圖15-6所示。SO圖15-6血淸主妥FFA酶法渕定圖:內(nèi)物質(zhì)作為生成量與變化量進(jìn)行測定：ACS:乙fitCoA合成酶：M

29、K：肌激酶：PK:丙酮酸 激酶：POD:丙酮酸取化酶：DTNB: a-碳基茉甲酸：AC0:乙酸CoA氧化酶：ACD:乙酰CoA脫氮酶。仁原理血淸中游離脂肪酸經(jīng)抽提到高密度銅試劑中，形成銅皂在上層溶劑中，再用二苯卡巴耕與銅顯 邑，進(jìn)行定量。2.試劑組成代 號種類濃度組成總存28”C有效期R-1抽提劑氯仿：庚烷：甲醇=5: 5: 1 (V/V)R-2緩沖液33mmol/LL 100ml+Na2HP04 I 50ml 調(diào) pH 至R-3銅貯液500mmol/LCu (N03) 2 3H2o 加 H20->100mlR-4三乙醇胺L三乙醇胺10ml,加水-4100mlR-5NaOH 液1 mo I/LR-6銅試劑R-3 10m